歐陽(yáng)經(jīng)鑫，李秋粉，周 華，鄭 俊，郭帥鵬，劉三鳳，黎觀紅* (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330045；.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

隨著全球氣候變暖以及集約化養(yǎng)殖的普及，加之中國(guó)南方地區(qū)高溫高濕的氣候特征，熱應(yīng)激是畜牧業(yè)發(fā)展需面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)機(jī)體的等熱區(qū)上限，機(jī)體不能維持產(chǎn)熱和散熱的穩(wěn)態(tài)，就會(huì)發(fā)生熱應(yīng)激[1]。而家禽因其代謝速率快、體溫偏高、被覆羽毛、缺乏汗腺等生理特性，更容易受到熱應(yīng)激[2]。熱應(yīng)激對(duì)肉雞的影響涉及許多方面，包括使畜禽體溫度升高，采食量降低，代謝異常，氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，免疫機(jī)能、屏障功能下降等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體組織器官的損傷甚至是死亡[3-6]。當(dāng)機(jī)體組織受損后，受損細(xì)胞釋放內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)并激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的分泌而引發(fā)炎癥反應(yīng)[7-9]。研究表明活性氧，特別是來(lái)自線粒體的活性氧，可以激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎癥小體，增加白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18的釋放[10-12]。張宏男等[13]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可以激活NLRP3炎癥小體，敲除NLRP3基因可以減輕全身性炎癥反應(yīng)，維持腸道屏障的完整性，減輕組織的損傷程度。因此，NLRP3炎癥小體的激活可能參與了熱應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)過(guò)程。

色氨酸(Trp)是畜禽的必需氨基酸，也是家禽飼糧中的限制性氨基酸[14]。色氨酸及其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物采食量、行為、應(yīng)激和免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[15]。岳云雙[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加色氨酸可以提高應(yīng)激條件下肉雞的生產(chǎn)性能，抑制應(yīng)激反應(yīng)引起的腸道促炎細(xì)胞因子分泌，維持腸道正常屏障功能。褪黑素是色氨酸的代謝產(chǎn)物之一，被認(rèn)為是一種有效的自由基清除劑和氧化還原活性酶的調(diào)節(jié)劑[17]。尹華祺[18]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以增加熱應(yīng)激小鼠血液中白細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞數(shù)量，調(diào)節(jié)免疫功能，提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性，降低丙二醛(MDA)的含量，有效緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的組織損傷。因此，本研究以AA肉雞為試驗(yàn)對(duì)象，探討熱應(yīng)激對(duì)肉雞肝臟和腸道抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的影響和飼糧添加色氨酸的調(diào)節(jié)作用，為色氨酸緩解動(dòng)物應(yīng)激損傷提供進(jìn)一步的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取健康、體質(zhì)量接近的180只18日齡雌性AA肉雞，隨機(jī)分為3個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)至21日齡開(kāi)始進(jìn)行溫度控制，試驗(yàn)期為21 d。適溫組(TN)肉雞飼養(yǎng)于正常溫度(23±1)℃，飼喂基礎(chǔ)飼糧；熱應(yīng)激組(HS)肉雞飼養(yǎng)于高溫環(huán)境(34±1)℃、8 h/d，飼喂基礎(chǔ)飼糧；熱應(yīng)激+0.18%色氨酸組(HS+0.18% Trp)肉雞飼養(yǎng)于高溫環(huán)境(34±1)℃、8 h/d，飼喂基礎(chǔ)飼糧+0.18%色氨酸。本試驗(yàn)所用的L-色氨酸購(gòu)自韓國(guó)希杰食品有限公司，純度>98%。

1.2 試驗(yàn)日糧與動(dòng)物飼養(yǎng)管理本試驗(yàn)采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，參考NRC(1994)推薦的營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行配制，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。通過(guò)調(diào)節(jié)谷氨酸添加量使各組飼糧保持等氮等能水平。試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地的試驗(yàn)雞房進(jìn)行。試驗(yàn)雞采用4層籠籠養(yǎng)。試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)雞舍及周?chē)h(huán)境進(jìn)行充分沖洗和嚴(yán)格消毒，雞只按正常免疫程序進(jìn)行免疫。試驗(yàn)期熱應(yīng)激從21日齡開(kāi)始至42日齡結(jié)束。HS組溫度控制如下：每天從9:00-17:00 維持(34±1)℃ 8 h，共21 d。試驗(yàn)期間雞只自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

1.3 樣品采集與制備于42日齡時(shí)，肉雞提前禁食12 h，期間自由飲水。從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取 1 只雞，斷頸處死，剖開(kāi)腹腔，取肝臟、空腸和回腸，用PBS沖洗干凈腸道內(nèi)容物，吸水紙吸干后，刮取空腸、回腸黏膜，置于無(wú)菌無(wú)酶凍存管中，液氮速凍，-80℃ 保存用于后續(xù)分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1肝臟、腸道黏膜抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 用生理鹽水制備10%的組織勻漿，離心取上清進(jìn)行試驗(yàn)檢測(cè)，采用BCA法測(cè)定上清液的蛋白濃度。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定肝臟、腸道黏膜SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)、GSH-Px的活力、總抗氧化能力(T-AOC)和MDA的含量。

1.4.2肝臟細(xì)胞因子含量的測(cè)定 用PBS制備10%的肝臟組織勻漿，5 000×g離心10 min取上清進(jìn)行檢測(cè)，采用BCA法測(cè)定上清液的蛋白濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，檢測(cè)肝臟中IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TransZol Up(北京全式金生物技術(shù)有限公司)裂解樣品，提取肉雞肝臟和腸道黏膜總RNA，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA提取完成后，用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-1000)測(cè)定RNA樣品的純度和濃度，保證D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0之間，使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，按說(shuō)明加入相應(yīng)體系，將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，采用以下熱循環(huán)條件:94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，在57～60℃退火延伸30 s，共循環(huán)42次。目的基因和內(nèi)參基因β-actin的引物序列見(jiàn)表2，并由華大基因設(shè)計(jì)合成。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 飼糧添加色氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟和腸道黏膜抗氧化能力的影響由表3可知，與TN組相比，HS組肉雞肝臟GSH-Px、回腸黏膜CAT活性和T-AOC顯著降低(P<0.05)，肝臟CAT、回腸黏膜SOD活性極顯著降低(P<0.01)；與HS組相比，HS+0.18%Trp組肝臟、空腸黏膜T-AOC顯著升高(P<0.05)，肝臟CAT、空腸和回腸黏膜SOD活性極顯著升高(P<0.01),然而各組間的MDA含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 飼糧添加色氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟和腸道黏膜抗氧化能力的影響

2.2 飼糧添加色氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟炎癥細(xì)胞因子含量的影響由表4可知，與TN組相比，熱應(yīng)激顯著升高肝臟IL-6和TNF-α的含量(P<0.05)，極顯著提高肝臟IL-1β和IL-18的含量(P<0.01)。與HS組相比，添加0.18% Trp顯著降低熱應(yīng)激肉雞肝臟IL-1β和TNF-α的含量(P<0.05)，極顯著降低熱應(yīng)激肉雞肝臟IL-18的含量(P<0.01)。

表4 飼糧添加色氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟炎癥細(xì)胞因子含量的影響 ng/g

2.3 飼糧添加色氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟、腸道黏膜炎癥小體相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響由表5可知，與TN組相比，熱應(yīng)激顯著升高肝臟IL-1β和IL-18以及空腸黏膜IL-12A、IL-12B和IL-18的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，并極顯著提高空腸黏膜NLRP3、IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。與TN組相比，熱應(yīng)激顯著升高回腸黏膜NLRP3的mRNA相對(duì)表達(dá)(P<0.05)，并極顯著升高回腸黏膜Caspase-1、IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。與HS組相比，飼糧添加色氨酸顯著降低熱應(yīng)激肉雞肝臟TNF-α以及空腸黏膜IL-12A和IL-12B的mRNA相對(duì)表(P<0.05)，并極顯著降低熱應(yīng)激肉雞空腸黏膜NLRP3、IL-18和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。與HS組相比，飼糧添加色氨酸極顯著降低熱應(yīng)激肉雞回腸黏膜NLRP3、Caspase-1、IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.01)。

表5 飼糧添加色氨酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟、腸道黏膜炎癥小體相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

熱應(yīng)激是氧化應(yīng)激的重要誘導(dǎo)因子[6]，使機(jī)體內(nèi)有毒性的活性氧自由基過(guò)度積累，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡，造成核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的氧化損傷[19]。機(jī)體有自身抗氧化防御系統(tǒng)以維持機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，其中SOD、GSH-Px和CAT是組成抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，SOD能夠?qū)2-歧化成為H2O2，然后GSH-Px和CAT進(jìn)一步將H2O2分解為H2O[20]。T-AOC能夠反映機(jī)體防御體系的總抗氧化能力。MDA是多不飽和脂肪酸過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量能夠反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[21]。本試驗(yàn)研究表明，與TN組相比，熱應(yīng)激顯著降低SOD、GSH-Px、CAT抗氧化酶的活性及T-AOC的含量。這一結(jié)果與前人在肉雞、綿羊上的研究結(jié)果一致[22-24]，表明長(zhǎng)期的熱應(yīng)激會(huì)破壞機(jī)體組織氧化-還原平衡，降低機(jī)體的抗氧化能力。色氨酸是血清素和褪黑素的重要前體，在維持肉雞采食量、生長(zhǎng)性能、免疫反應(yīng)和抗應(yīng)激等方面發(fā)揮著重要作用[25-26]。MUND等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高于NRC推薦水平的色氨酸可提高肉雞的生長(zhǎng)性能、免疫反應(yīng)和抗氧化狀態(tài)。LIU等[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.15%色氨酸能夠提高斷奶仔豬空腸黏膜SOD、GSH-Px和CAT活性，降低MDA含量，緩解由敵草快引起的腸道氧化應(yīng)激損傷。在本研究中，飼糧添加色氨酸提高了SOD、CAT的活力及T-AOC的含量，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，飼糧中添加色氨酸能夠提高機(jī)體的抗氧化能力，清除過(guò)度產(chǎn)生的有毒性活性氧自由基，緩解熱應(yīng)激引起的肉雞組織氧化應(yīng)激損傷。

炎癥是一種機(jī)體對(duì)抗外界有害刺激或病原體的自然防御機(jī)制[29]。適度的炎癥反應(yīng)可以幫助機(jī)體對(duì)抗病原體的入侵，清除壞死的細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體正常功能的恢復(fù)。然而過(guò)度的炎癥反應(yīng)反而會(huì)加重?fù)p傷[30]。氧化應(yīng)激造成組織細(xì)胞損傷并釋放損傷相關(guān)模式分子，并被機(jī)體組織相應(yīng)的模式識(shí)別受體識(shí)別進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，引起組織細(xì)胞的不可逆損傷[31]。TNF-α、IL-1β、IL-6是炎癥反應(yīng)中主要的炎癥因子，少量分泌能夠與免疫細(xì)胞上的受體結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)控作用，但隨其分泌量增加，炎癥反應(yīng)被加劇而導(dǎo)致機(jī)體組織損傷[23]。IL-12能激活和誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[32]。DENG等[33]研究表明，34℃高溫環(huán)境下持續(xù)熱應(yīng)激提高肉雞血清TNF-α、IL-6和皮質(zhì)酮的含量。TNF-α等促炎癥因子的過(guò)量產(chǎn)生可導(dǎo)致包括腸道在內(nèi)的器官出血和壞死[34]。李秋粉[35]研究報(bào)道，21 d的熱應(yīng)激顯著升高肉雞血清促炎因子TNF-α、IL-6的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，與TN組相比，熱應(yīng)激升高肝臟炎癥因子IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α的含量，這與前人的研究結(jié)果一致，同時(shí)也說(shuō)明熱應(yīng)激能夠促進(jìn)炎癥因子的分泌，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥小體是研究最為廣泛及深入的炎癥小體，并與多種人類自身炎癥和自身免疫疾病有關(guān)[36]。炎癥小體是由NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)以及半胱天冬酶前體(pro-Caspase-1)組成的細(xì)胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，通過(guò)獨(dú)特的模式識(shí)別受體響應(yīng)多種外源性(包括脂多糖、細(xì)菌鞭毛等)和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(包括活性氧、K+外流、Ca2+內(nèi)流和溶酶體損傷等)的刺激，招募和激活促炎蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1可將pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的生物活性形式釋放[13,36-37]。王偉等[38]研究表明，熱應(yīng)激可導(dǎo)致肝NLRP3炎癥小體的激活，促進(jìn)下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)中Caspase-1、IL-1β、IL-6的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)肝臟炎癥損傷，而抑制NLRP3表達(dá)水平可有效拮抗下游促炎因子的表達(dá)。在本研究中，熱應(yīng)激升高肉雞NLRP3、Caspase-1及促炎細(xì)胞因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量，此結(jié)果表明，NLRP3炎癥小體激活下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)共同參與熱應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這與前人的研究結(jié)果一致[38]。本研究中，飼糧添加色氨酸顯著降低熱應(yīng)激肉雞肝臟炎癥細(xì)胞因子及NLRP3信號(hào)通路的mRNA表達(dá)。YUE等[39]研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激導(dǎo)致IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子mRNA水平升高以及抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA表達(dá)量下降，而飼糧添加色氨酸能部分逆轉(zhuǎn)以上變化，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn)，色氨酸可能通過(guò)抑制NLRP3信號(hào)通路的表達(dá)，抑制機(jī)體的促炎反應(yīng)，以此緩解由熱應(yīng)激引起的機(jī)體炎癥損傷。

綜上所述，長(zhǎng)期熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肉雞肝臟和腸道產(chǎn)生氧化應(yīng)激，降低組織的抗氧化能力，同時(shí)誘發(fā)肝臟和腸道炎癥反應(yīng)。飼糧添加色氨酸能夠緩解熱應(yīng)激引起的氧化應(yīng)激損傷，通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體及下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)。