馬 琪，董 婧，翁與競(jìng)，杜紅旭，2 (.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 402460；2.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院 免疫研究中心，重慶 402460)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性非特異性炎癥性腸病，本病的病變區(qū)域位于大腸黏膜及黏膜下層，主要涉及直腸和結(jié)腸，尤其是乙狀結(jié)腸，有時(shí)也可能遍及降結(jié)腸乃至整個(gè)結(jié)腸。臨診主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、排血便等。目前普遍認(rèn)為，UC機(jī)體存在腸黏膜炎癥免疫耐受紊亂，腸黏膜免疫反應(yīng)異常激活是UC發(fā)生、發(fā)展的重要因素[1]。對(duì)UC治療的經(jīng)典藥物有5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，該類(lèi)藥物在發(fā)揮功效的同時(shí)，不可避免地帶來(lái)相應(yīng)的副作用[2]。有研究表明，中醫(yī)藥對(duì)UC有良好的治療作用，且不良反應(yīng)較少[3]。

中醫(yī)認(rèn)為UC屬于“瀉下”、“痢疾”、“腸風(fēng)”等范疇，并認(rèn)為UC是由于感受外邪、內(nèi)傷飲食、情志失調(diào)和脾胃虛弱所致，病位在脾、胃和大、小腸。其病因?yàn)橥飧袧駸幔嬍巢还?jié)，導(dǎo)致脾、胃、小腸和大腸傳導(dǎo)失調(diào)，水谷運(yùn)行不暢，久而閉塞，傷及腸胃，氣血瘀滯，以致便血。《古今醫(yī)鑒》云：“夫泄瀉者，注下之癥也，蓋大腸為傳送之官，脾胃為水谷之海，或?yàn)轱嬍成渌鶄?，或?yàn)槭顫耧L(fēng)寒之所感，脾胃停滯，以致闌門(mén)清濁不分，發(fā)注于下，而為泄瀉也?！盪C證型實(shí)證中以大腸濕熱為主，虛證中以脾虛證為主，在虛實(shí)夾雜證型中，多以脾虛為基礎(chǔ)，并見(jiàn)濕熱、寒濕、氣滯和血瘀[4]。而在臨床上，大腸濕熱證、脾胃氣虛證及脾虛夾濕熱證三證型臨床多見(jiàn)，符合中醫(yī)學(xué)理論的病初起多屬于實(shí)證，發(fā)展日久耗傷正氣則形成虛證或虛實(shí)夾雜證的疾病發(fā)展觀[5]。本研究探討脾虛泄瀉型UC的病機(jī)關(guān)鍵為脾虛濕盛，運(yùn)化失健[6]。中醫(yī)認(rèn)為，脾喜燥而惡濕，外來(lái)濕邪，最易困阻脾土，以致升降失調(diào)，清濁不分，水谷雜下而發(fā)生泄瀉，即所謂“無(wú)濕不成泄”，故《雜病源流犀燭·泄瀉源流》說(shuō)：“濕盛則飧泄，乃獨(dú)由于濕耳”。因此，健脾溫腎、行氣導(dǎo)滯是中藥治療 UC 的重要原則[7]。

參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)治療脾虛夾濕證的經(jīng)典方劑，由黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、白扁豆、薏苡仁、砂仁、桔梗、蓮子、炙甘草組成，諸藥配伍，有健脾止瀉，祛濕行滯之功。該方將補(bǔ)脾與祛濕合用，正邪兼顧；脾肺兼調(diào)，主在補(bǔ)脾，寓“培土生金”之義，常用于治療脾虛夾濕證，近年發(fā)現(xiàn)其在臨床消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多個(gè)領(lǐng)域治療疾病應(yīng)用廣泛，并取得顯著成效[8]。

腸道菌群的平衡在構(gòu)建腸黏膜屏障、維持正常免疫功能等方面發(fā)揮著重要作用，其機(jī)制包括產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、與有害菌競(jìng)爭(zhēng)黏附、對(duì)宿主免疫調(diào)節(jié)等[2]。有研究表明中藥通過(guò)口服進(jìn)入消化道，一部分直接通過(guò)胃黏膜吸收入血，另一些生物利用度較低的部分未經(jīng)上消化道吸收，通過(guò)小腸到達(dá)大腸，與腸道菌群接觸并發(fā)生相互作用，中藥有效部位成分不僅能改變腸道菌群代謝，且被腸道菌群轉(zhuǎn)化或代謝[9]。中藥還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群阻止腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素發(fā)生移位，平衡有益菌與致病菌，能明顯提高黏膜細(xì)胞的再生能力，降低過(guò)高的黏膜通透性，從而改善黏膜的屏障功能[10]。因此，本研究通過(guò)探討參苓白術(shù)散對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠腸道菌群的影響，進(jìn)一步探究參苓白術(shù)散治療小鼠UC的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32 只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[(湘)2019-0004]，飼養(yǎng)于西南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(渝)2019-0003]。飼養(yǎng)期間各組小鼠為自由飲水、采食。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在25℃ 左右。所有操作均符合西南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號(hào)：IACUC-20190620-02)。

1.2 試劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)(批號(hào)：S0948，MW：36000-50000)購(gòu)自MP Biomedicals；聯(lián)鄰甲苯胺(批號(hào)：C10659221)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇(批號(hào)：20190818)購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)(批號(hào)：C10865372)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；過(guò)氧化氫(批號(hào)：200506)購(gòu)自四川省伊潔士醫(yī)療科技有限公司；冰醋酸(批號(hào)：20170501)購(gòu)自重慶川東化工有限公司。參考《太平惠民和劑局方》中參苓白術(shù)散的配方組成，藥材蓮子、薏苡仁、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、黨參、甘草、白術(shù)、山藥購(gòu)自重慶榮昌布美大藥房，經(jīng)西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院劉娟教授鑒定。其中蓮子為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的干燥成熟種子，薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix.Lacryma-jobiL.var.mayuen(Roman)Stapf的干燥成熟種仁，砂仁為為姜科植物陽(yáng)春砂AmomumvillosumLour.的干燥成熟果實(shí)，桔梗為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，白扁豆為豆科植物扁豆DolichoslablabL.的干燥成熟種子，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.的干燥根，甘草為豆科植物甘草ClycyrrhizauralensisFisch.的干燥根莖，白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppasitaThunb.的干燥根莖。

1.3 方法

1.3.1試驗(yàn)試劑制備 參苓白術(shù)散制備：以《太平惠民和劑局方》中記載的處方配比為基礎(chǔ)，稱取蓮子肉、薏苡仁、砂仁、桔梗(炒)各3.2 g，扁豆(炒)4.8 g，茯苓、黨參、甘草、白術(shù)(炒)、山藥各6.4 g，先后煎煮2次。過(guò)濾后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 000 g/L，再用乙醇醇沉2次，所得上清液再蒸發(fā)至1 000 g/L，放入溫箱烘干制得浸膏備用，灌胃時(shí)以羧甲基纖維素溶解配置為6.28 g/(kg·d)。柳氮磺胺吡啶溶液配制：灌胃時(shí)以羧甲基纖維素溶解配置為450 g/(L·d)。DSS配制：用純凈水配置為3.5%的溶液。聯(lián)鄰甲苯胺冰醋酸溶液配制：用1∶1無(wú)水乙醇和冰醋酸將聯(lián)鄰甲苯胺配置為15.0%的溶液，低溫、避光保存。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 將BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法把小鼠分為8 只/組：參苓白術(shù)散治療組(SLBZS)、柳氮磺胺吡啶治療組(SASP)、對(duì)照組、模型組(Model)。SLBZS、SASP、Model組飲用3.5% DSS 水溶液，對(duì)照組飲用純凈水。每天更換新鮮飲水，連續(xù)7 d。各組分別以參苓白術(shù)散、柳氮磺胺吡啶、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素按10 mL/kg灌胃，共7 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1小鼠臨床表現(xiàn)觀察 造模及治療期間，觀察并記錄小鼠體質(zhì)量、糞便、毛發(fā)狀況、精神狀態(tài)等變化，以此評(píng)估小鼠狀態(tài)。

1.4.2小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度測(cè)量 治療結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，采集小鼠結(jié)直腸，于冰上去除腸系膜和脂肪組織，然后置于玻璃板上用直尺測(cè)量肛門(mén)到回直結(jié)合部距離。

1.4.3結(jié)腸黏膜損傷眼觀評(píng)分 將小鼠結(jié)腸沿腸系膜側(cè)縱向切開(kāi)，用PBS溶液洗滌腸道內(nèi)容物后進(jìn)行腸黏膜損傷量化評(píng)分(表1)。

表1 結(jié)腸黏膜損傷眼觀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 分

1.4.4疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 通過(guò)體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)、糞便性狀分?jǐn)?shù)和糞便隱血分?jǐn)?shù)評(píng)估小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)。公式為DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+糞便隱血分?jǐn)?shù))/3(表2)。

表2 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

其中小鼠糞便隱血程度采用聯(lián)鄰甲苯胺法判定，判定方法如下：用竹簽將糞便涂于玻片或?yàn)V紙上，分別滴加15%鄰甲苯胺冰醋酸溶液和3%過(guò)氧化氫液2～3滴于糞便上，根據(jù)顏色深淺和出現(xiàn)時(shí)間可判定，在2 min內(nèi)顯藍(lán)褐色為陽(yáng)性(表3，圖1)。

表3 隱血檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn) 分

圖1 隱血判定示意圖

1.4.5結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分 將小鼠整個(gè)結(jié)腸泡入10%中性甲醛固定后，用石蠟包埋，制成切片(約5 μm)后進(jìn)行伊紅-美藍(lán)(HE)染色制成病理切片。采用Leica DFC 顯微拍照系統(tǒng)對(duì)病理切片進(jìn)行觀察與拍照并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分[11]，評(píng)分內(nèi)容包括腸上皮細(xì)胞損傷程度和炎癥浸潤(rùn)程度，結(jié)果可用于評(píng)價(jià)結(jié)腸組織損傷程度(表4)。

表4 組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 分

1.4.616S rDNA測(cè)序 采用CTAB方法對(duì)各組小鼠盲腸內(nèi)容物樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，并對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物和高保真DNA聚合酶對(duì)選定的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)。參照電泳初步定量結(jié)果，對(duì)PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用NEB NextRUltraTMDNA Library Prep Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100和Qubit進(jìn)行質(zhì)檢，文庫(kù)質(zhì)檢合格后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臨床表現(xiàn)在適應(yīng)性喂養(yǎng)期間各組小鼠進(jìn)食、飲水、排便情況均正常，小鼠被毛整潔、平滑有光澤，活潑好動(dòng)。Model組小鼠在造模期間隨著DSS攝入逐漸表現(xiàn)為精神沉郁、怕冷扎堆、不愿走動(dòng)、腹瀉拉血便，肛周及尾根部黏附有干結(jié)的糞便，毛發(fā)逐漸變得干枯無(wú)光澤同時(shí)大量脫毛。SLBZS與SASP組隨著灌胃給藥，腹瀉及血便情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況逐漸轉(zhuǎn)好(圖2)。

圖2 小鼠一般狀況

2.2 小鼠體質(zhì)量及疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)變化在試驗(yàn)期間，對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量基本呈上升狀態(tài)，SLBZS和SASP組小鼠的體質(zhì)量隨著治療進(jìn)行有所恢復(fù)趨近于對(duì)照組，且均明顯高于Model組，具有極顯著性差異(P<0.01)，說(shuō)明2組的治療均取得顯著效果。但SLBZS組的體質(zhì)量明顯高于SASP組，且差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明參苓白術(shù)散的治療效果明顯優(yōu)于SASP組。同時(shí)，Model組體質(zhì)量呈明顯下降趨勢(shì)，與對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01)(圖3A)。與對(duì)照組相比，Model組DAI評(píng)分極顯著升高(P<0.01)。與Model組相比，SLBZS和SASP組DAI評(píng)分均明顯降低(P<0.05)(圖3B)。

A.小鼠體質(zhì)量變化；B.DAI評(píng)分。與Model組比較，*.P<0.05, **.P<0.01；與對(duì)照組比較,#.P<0.05，##.P<0.01。下同圖3 小鼠體質(zhì)量變化及DAI評(píng)分

2.3 小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度變化小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短是UC炎癥的重要特征[12]。與對(duì)照組相比，Model組結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.01)。與Model組相比，SLBZS組結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增加(P<0.01)。SASP組結(jié)腸長(zhǎng)度與Model組相比有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

A.小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度；B.小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度變化圖4 小鼠結(jié)直腸長(zhǎng)度變化

2.4 小鼠結(jié)腸黏膜損傷眼觀評(píng)分根據(jù)小鼠結(jié)直腸剖檢結(jié)果可見(jiàn)，Model組小鼠結(jié)直腸黏膜存在一定病變，腸壁充血腫脹，特別是結(jié)腸端有明顯出血和潰瘍。對(duì)照組小鼠結(jié)直腸基本無(wú)損傷，且結(jié)腸黏膜損傷眼觀評(píng)分與Model組差異極顯著(P<0.01)。同時(shí)SLBZS與SASP組小鼠結(jié)腸炎癥狀況較Model組明顯改善，黏膜腫脹充血程度明顯減輕(圖5A)。在黏膜損傷評(píng)分中，SLBZS組相較于Model組有極顯著性差異(P<0.01)，SASP組相較于Model組有顯著性差異(P<0.05)(圖5B)。

A.小鼠結(jié)腸黏膜病變；B.結(jié)腸黏膜損傷眼觀評(píng)分圖5 小鼠結(jié)腸黏膜病變損傷情況

2.5 小鼠結(jié)腸組織病理切片及病理學(xué)評(píng)分HE染色結(jié)果所示(圖6A)，Model組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞，正常形態(tài)消失，上皮細(xì)胞及皺襞變矮，整個(gè)腸壁變薄，黏膜下層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織病理學(xué)評(píng)分與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05) 。同時(shí)，SLBZS組小鼠結(jié)腸黏膜比較完整，與Model組相比組織病理學(xué)評(píng)分差異顯著(P<0.05)(圖6B)。

A.小鼠結(jié)腸組織病理切片(HE染色，×100，n=3)；B.組織病理學(xué)評(píng)分圖6 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

2.6 小鼠樣品16S rDNA測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及多樣性分析根據(jù)各樣品測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建Shannon 曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息(圖7A)。采用Venn圖分析 OTUs 數(shù)量及不同組之間共有、特有OTUs，Model和對(duì)照組總 OTUs 為181 727個(gè)，Model組特有OTUs為82 309個(gè)，對(duì)照組特有OTUs為79 067個(gè)，共有OTUs為20 351個(gè)，占總OTUs的11.20%。與對(duì)照組相比，Model組腸道菌群物種豐度降低(圖7B)。以O(shè)bserved_Species指數(shù)組間差異分析組間物種多樣性，SLBZS組Observed_Species指數(shù)高于Model組，同時(shí)低于對(duì)照組(圖7C)。

A.小鼠樣品Shannon曲線；B.Venn圖；C.Observed_Species指數(shù)組間差異箱形圖圖7 小鼠腸道菌群多樣性分析

2.7 門(mén)水平小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析選取在門(mén)水平(Phylum)上最大豐度排名前 10 的各組小鼠腸道菌群物種，首先，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)豐度最高，各組占比均在80% 以上，其次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)等(圖8A)。各組Firmicutes與Bacteroidetes豐度比值(即F/B值)由高到低依次為：對(duì)照組(3.37)>SLBZS組(1.70)>SASP組(1.36)>Model組(1.21)。采用heatmap在Phylum上進(jìn)行物種豐度聚類(lèi)情況分析，Proteobacteria的豐度在Model組中最高(0.081)，SASP組次之(0.075)，SLBZS組(0.042)與對(duì)照組(0.034)接近；在對(duì)照組中Deferribacteres和Actinobacteria的豐度顯著高于其他各組(圖8B)。

2.8 屬水平小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成分析選取在屬水平(genus)上最大豐度排名前10的各組小鼠腸道菌群物種，在對(duì)照組中，乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高(18.74%)，其次為Mucispirillum(3.80%)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(3.72%)；在SLBZS組中，擬桿菌屬(Bacteroides)的豐度明顯低于SASP和Model組；在Model組中，Lactobacillus的豐度明顯低于SLBZS和SASP組(圖9)。

圖9 屬水平小鼠腸道菌群豐度

2.9 小鼠腸道菌群組間差異分析采用基于Weighted Unifrac距離[13]構(gòu)建UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)樣品聚類(lèi)樹(shù)分析不同樣品間的相似性，與Model組相比，SLBZS和SASP組與對(duì)照組距離小，相似性較高(圖10)。根據(jù)分類(lèi)學(xué)組成對(duì)樣本按照不同分組條件進(jìn)行線型判別分析(LDA)，找出對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種[14]。Model與SLBZS組的差異類(lèi)群為L(zhǎng)actobacillales，Model與對(duì)照組的差異類(lèi)群為Proteobacteria和Firmicutes。

圖10 小鼠腸道菌群組間差異分析

3 討論

UC是一種黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，病變主要在結(jié)腸和直腸，臨診主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、排血便等?！夺t(yī)學(xué)心悟》指出：“濕多成五瀉，瀉之屬濕明矣。然有濕熱，有寒濕，有積食，有脾虛，有腎虛，皆能致瀉，宜分而治之?！眳④甙仔g(shù)散有健脾滲濕之功，是用于治療脾虛泄瀉型UC的有效方劑。研究表明中醫(yī)藥辨證治療UC，尤其是慢性階段的UC治療，有藥物不良反應(yīng)較小、療效顯著的優(yōu)勢(shì)[15]。

絕大多數(shù)中藥給藥途徑以湯劑、丸劑、散劑等口服為主，腸道菌群主要參與中藥有效成分的吸收、代謝和轉(zhuǎn)化[16]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，除遺傳、免疫、環(huán)境等因素外，UC的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[2]。健康成人腸道內(nèi)約有1 000多種細(xì)菌，是人體組織細(xì)胞總數(shù)的10倍，腸道菌群同腸上皮層、黏液層、腸道淋巴系統(tǒng)一起構(gòu)成腸黏膜機(jī)械、化學(xué)及生物屏障，該屏障有天然保護(hù)作用，可防止致病菌的入侵，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，同時(shí)定植于腸道內(nèi)的菌群可促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟[17]。微生物菌群失調(diào)可通過(guò)破壞結(jié)腸上皮緊密連接而減少腸道屏障，從而增加腸道的供血能力，使細(xì)菌轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致毒性物質(zhì)的轉(zhuǎn)移[18]。

超過(guò)90%的正常人類(lèi)腸道微生物群由4個(gè)主要細(xì)菌門(mén)中的物種組成：Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria和Actinobacteria[19]。而小鼠的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與人相似，測(cè)序結(jié)果表明各組在門(mén)水平豐度前10的物種中，豐度最高的均為Firmicutes和Bacteroidetes，占到80%以上，其次為Proteobacteria、Actinobacteria等。而Firmicutes和Bacteroidetes豐度比值(即F/B值)由高到低依次為對(duì)照組、SLBZS組、SASP組、Model組，在SLBZS組中，Bacteroides豐度明顯低于SASP和Model組。研究表明，F(xiàn)irmicutes相對(duì)于Bacteroidetes的相對(duì)豐度增加被認(rèn)為是腸道微生物群生態(tài)失調(diào)的一個(gè)指標(biāo)[20]。同時(shí)，有研究顯示腸道微生物群結(jié)構(gòu)中適當(dāng)數(shù)量的Firmicutes對(duì)慢性腸道炎癥有保護(hù)作用，在Firmicutes中包含幾種產(chǎn)丁酸的細(xì)菌[21]，而丁酸鹽是結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，可提供腸道內(nèi)的酸性環(huán)境進(jìn)而抑制有害菌生長(zhǎng)，維持水電解質(zhì)平衡，促進(jìn)黏膜炎癥修復(fù)[22]。

另外，16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示在Model組中Proteobacteria的豐度最高，在對(duì)照組中Actinobacteria的豐度顯著高于其他組。研究表明，放線菌在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用，它們產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸的能力被認(rèn)為有助于維持腸道屏障[23]。 而天然腸道菌群通常只包含一小部分的Proteobacteria，且有研究表明腸道微生物群的失調(diào)通常是由Proteobacteria豐度的持續(xù)增加引起的[20]。由于機(jī)體不能將共生的變形桿菌維持在較低的豐度，導(dǎo)致微生物群落的定植能力降低，引發(fā)變形桿菌的不受控制的擴(kuò)張，進(jìn)一步促進(jìn)外來(lái)病原體的入侵或炎癥的發(fā)展。因此，有學(xué)者提出可將Proteobacteria豐度的增加視為微生物群落失調(diào)的標(biāo)志和疾病的潛在診斷標(biāo)準(zhǔn)[20]。

同時(shí)，在對(duì)照組中，Lactobacillus豐度最高(18.74%)，其次為Mucispirillum(3.80%)、Cory-nebacterium(3.72%)；在Model組中，Lactobacillus的豐度明顯低于SLBZS和SASP組。Lactobacillus可以改善小鼠的腸道菌群紊亂，降低腸道通透性，抑制腸道內(nèi)脂多糖移位，并減輕系統(tǒng)性低度炎癥[22]。同時(shí)，Lactobacillus促進(jìn)產(chǎn)丁酸菌的生長(zhǎng)及丁酸在低丁酸菌群體中的吸收和利用，減少炎癥反應(yīng)[18]。覆蓋于腸道表面的黏液層是腸道黏膜屏障完整性的組成部分，在阻止腸腔微生物及其產(chǎn)物穿過(guò)腸黏膜起到重要的作用，Lactobacillus可通過(guò)保證腸黏膜的完整性來(lái)改善腸道屏障功能[24]。另外，研究表明Mucispirillum可以幫助宿主抵御鼠傷寒沙門(mén)菌引發(fā)的腸道炎癥，該菌在腸道內(nèi)與沙門(mén)菌競(jìng)爭(zhēng)厭氧呼吸底物，抑制沙門(mén)菌毒力因子的表達(dá)，從而抵御結(jié)腸炎[25]。

16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，Model與SLBZS組的差異類(lèi)群為L(zhǎng)actobacillales，Model與對(duì)照組的主要差異類(lèi)群為Proteobacteria、Firmicutes。同時(shí)，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明參苓白術(shù)散能有效改善UC小鼠的腹瀉及血便情況、精神狀態(tài)、毛發(fā)情況，明顯恢復(fù)體質(zhì)量(P<0.01)、減少結(jié)腸長(zhǎng)度的縮短(P<0.01)、改善結(jié)腸炎癥狀況、降低黏膜損傷評(píng)分(P<0.01)、降低DAI評(píng)分(P<0.05)、降低組織病理學(xué)評(píng)分(P<0.05)。以上結(jié)果均表明參苓白術(shù)散可以通過(guò)提高小鼠腸道菌群中有益菌的豐度、激發(fā)有益菌的微生物活性來(lái)抑制致病菌的生長(zhǎng)，從而調(diào)節(jié)UC小鼠腸道菌群的多樣性、組成和相對(duì)豐度，同時(shí)改善屏障功能、提高免疫能力，以此達(dá)到治療UC的效果。