張杰　　夏樂莎　　胡紅林　　彭璇　　吳成亮　　陳亞強　　李霞

[摘要] 目的 探討精子形態(tài)聯(lián)合精子DNA碎片率（DFI）對體外受精-胚胎移植臨床結局的影響。方法 選取2020年1月～2021年8月在江西省九江市婦幼保健院生殖中心實施IVF-ET治療的231例IVF新鮮治療周期，取卵當日對精液標本進行精子形態(tài)及DNA完整性檢測。依據精子形態(tài)分為正常組164例及畸形精子組67例，納入精子DFI后分為A組（MNS≥4%且DFI<30%）、B組（MNS≥4%且DFI≥30%）、C組（MNS<4%且DFI<30%）和D組（MNS<4%且DFI≥30%），對比各組間受精率、2PN卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率、早期流產率的差異;比較DFI與男方年齡、精液參數間的相關性。結果 正常形態(tài)組總受精率、2PN受精率顯著高于畸形精子組（P<0.001），2PN卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率、早期流產率在不同形態(tài)組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）;納入精子DFI后，C、D兩組的總受精率、2PN受精率顯著低于A、B兩組，D組2PN卵裂率顯著低于A、C兩組，B組、D組優(yōu)質胚胎率顯著低于A組、C組，B組臨床妊娠率明顯低于A組（P<0.0083）;DFI與年齡及其他精液參數的相關性分析中，DFI與男性年齡呈顯著正相關，與前向運動精子率呈顯著負相關（P=0.002，0.001）。 結論 精子核DNA聯(lián)合精子形態(tài)評估能為IVF-ET的治療結局帶來更為高效準確的預測價值，值得在臨床上推廣應用;同時在IVF-ET的治療中，也要關切男方年齡，避免高齡帶來的諸多不利影響。

[關鍵詞] 精子形態(tài);精子DNA;體外受精-胚胎移植;預測價值

[中圖分類號] R714.8? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）16-0015-07

Predictive value of sperm morphology combined with sperm nuclear DNA in IVF cycle therapy

ZHANG Jie1 XIA Lesha1 HU Honglin2 Peng Xuan1 WU Chengliang1 CHEN Yaqiang1 LI Xia1

1.Department of Assisted Reproduction，Jiujiang Maternal and Child Health Care in Jiangxi Province，Jiujiang 332000，China;2.Department of Urology Surgery， the Second Affiliated Hospital of Nachang University， Nanchang 330000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of sperm morphology combined with sperm DNA fragmentation index （sperm DNA fragmentation index，DFI） on clinical outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer （in vitro fertilization and embryo transfe，IVF-ET）. Methods A total of 231 IVF fresh cycles were selected from January 2020 to August 2021 in the reproductive center of our hospital， the sperm morphology and the integrity of sperm nuclear DNA were detected on the day of egg collection. According to the normal morphology sperm percentage is divided into 164 cases of normal group and teratozoospermia group， after the inclusion of sperm DFI， they were divided into group A（MNS≥4%且DFI<30%），group B（MNS≥4%且DFI≥30%）， group C（MNS<4%且DFI<30%）， group D（MNS<4%且DFI≥30%）. The differences of fertilization rates，zygote transgene rates， optimal embryo rates，clinical pregnancy rate， early abortion rate among the groups were compared. To compare the correlation of DFI with male and semen parameters. Results The total fertilization rate and two pronuclei （two pronucle，2PN） fertilization rate in normal sperm morphology group were significantly higher than those in teratozoospermia group （all P<0.001）. There were no statistical differences in zygote transgene rates， optimal embryo rates， clinical pregnancy rate and early abortion rate between two groups （P>0.05）. After the inclusion of sperm DFI， the fertilization rate and 2PN fertilization rate in group C and D were significantly lower than those in group A and B， the zygote transgene rate in group D was significantly lower than that in group A and C， the optimal embryo rates in group B and D was significantly lower than that in group A and C，and the clinical pregnancy rate in group B was significantly lower than that in group A （P<0.0083）. In the correlation analysis of DFI with age and the other semen parameters， DFI was significantly positively correlated with male age， and significantly negatively correlated with forward motility sperm rate（P=0.002，0.001）. Conclusion Sperm DNA combined with sperm morphology assessment can bring more efficient and accurate predictive value for the treatment outcome of IVF-ET，which is worthy of clinical promotion and application.At the same time，in the treatment of IVF，we should concern about the age of the man， to avoid the many adverse effects of advanced age.

[Key words] Sperm morphology; Sperm DNA; In vitro fertilization-embryo transfer; Predictive value

目前全球不孕人群約占15%～20%，男性不育癥的發(fā)生率每年增加0.291%[1～3]。在中國，隨著生活節(jié)奏的加快和生育年齡推遲等因素的影響，不孕不育的發(fā)生率已接近25%[4]。在不孕癥高發(fā)的背景下，越來越多的人選擇體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）術。雖然IVF-ET治療的平均成功率已達40%～50%，但仍有不少夫婦在治療中出現(xiàn)妊娠失敗、胎停等不良妊娠結局[5，6]?？紤]到IVF-ET治療成本較高及治療失敗產生的負面影響，研究IVF-ET治療結局的相關影響因素是必要的。

精子質量在IVF-ET中起到關鍵作用，過去常認為嚴格的精子形態(tài)是預測IVF治療結局的良好因子[7～9]，但近年來許多研究[10～12]對此觀點提出挑戰(zhàn)。隨著精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）對生殖中的作用愈發(fā)被重視，越來越多的研究表明DFI在胚胎發(fā)育及妊娠結局有更好的預測價值[13～15]。本研究旨在探討精子形態(tài)聯(lián)合精子核DNA對IVF-ET治療結局的影響，評估兩者聯(lián)用的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月～2021年8月在江西省九江市婦幼保健院生殖中心實施IVF-ET治療的354例新鮮周期，其中123例因女方臨床因素（如預防卵巢過度刺激綜合征、無可移植胚胎、內膜異常、扳機日孕酮水平升高等）及其他因素取消移植。根據《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版及相關染色法的診斷標準，將正常形態(tài)精子數<4%定義為畸形精子癥，精子DNA碎片指數≥30%為精子DNA損傷。納入標準：①移植胚胎數≥1枚;②女方≤35歲，卵巢功能正常，獲卵數≥5個;③取卵當日精液標本完整且體積≥1.5 ml。排除標準：①女方生殖內分泌代謝疾病、內膜異位癥等;②男方代謝性疾病，內分泌異常，嚴重少弱精或無精子癥;③ 雙方染色體異常等;④因女方臨床因素或其他因素放棄移植胚胎者。術中所有耗材均來自相同的供應商，資質合格?；颊呔炇餓VF-ET相關治療的知情同意書。共計231例周期符合入選條件和排除標準，按正常形態(tài)精子（normal morphology sperm，MNS）百分率分為精子形態(tài)正常組164例（MNS≥4%）及畸形精子組67例（MNS<4%）;在精子形態(tài)隊列中依據不同精子DNA碎片指數分為A組（MNS≥4%且DFI<30%）128例、B組（MNS≥4%且DFI≥30%）36例、C組（MNS<4%且DFI<30%）42例及D組（MNS<4%且DFI≥30%）25例。不同形態(tài)組間在精液參數、年齡、女性FSH、獲卵數等基礎資料上的分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性;納入DFI后，D組的平均前向運動精子百分率（32.71±14.80）%顯著低于A組（40.76±15.58）%（P=0.045），其余項目比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1～2。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)檢測? 按《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版標準對精液體積、精子濃度、前向運動精子率等參數進行檢測。

1.2.2 精子形態(tài)檢測? 精子形態(tài)檢測采用Diff-Quick法，試劑盒由天津瑞愛金生物科技有限公司生產。方法如下：①取5～20 μl精液于玻片上，推片制成薄片;②甲醇緩沖液覆蓋組織玻片固定15 s，伊紅和天藍染液分別染色15 s，再用流水輕輕浸洗組織玻片10～15次待其干燥;③ 將精子頂體區(qū)、尾部染成不同顏色后進行結果判讀，連續(xù)計數大于200個精子。

1.2.3 精子DFI檢測? 精子DNA碎片指數檢測采用精子染色質擴散法（sperm chromatin dispersion，SCD），試劑盒由深圳華康生物醫(yī)學工程有限公司生產。方法如下：①將含有瓊脂糖凝膠的瓊脂糖管放入90～100℃水中溶解后置于37℃待用，提取60 μl的精液標本與溶解后的瓊脂糖凝膠均勻混合;②取30 μl上述混懸液覆蓋于載玻片后置于冰箱冷藏4 min，將標本浸入濃縮變性液中反應7 min，放入裂解液中反應20 min;③ 洗滌后依次放入70%、90%、無水乙醇溶液中脫水2 min，用配置好的染液進行染色，最后在200倍光鏡下觀察記錄。

1.2.4 控制性超排卵與獲卵? 促排卵采用垂體降調節(jié)方案，月經周期第2天皮下注射亮丙瑞林（麗珠制藥有限公司，國藥準字H20093852，規(guī)格：3.75 mg）3.75 mg，28～30 d返院達到降調節(jié)標準后予果納芬（默克雪蘭諾公司，注冊證號：S20080030，規(guī)格：75 IU）、普麗康（默沙東公司，注冊證號S20181012，規(guī)格：100 IU）等促排卵藥物誘導卵泡發(fā)育。當1～2個主導卵泡直徑達到18～20 mm或2～3個卵泡直徑達到17 mm以上，予注射用絨促性素（麗珠制藥有限公司，國藥準字H44020673，規(guī)格：2000 U）6000～10 000 IU肌注，36～37 h后在超聲引導下經陰道穿刺取卵。

1.2.5 體外授精與胚胎評估? 取卵后2～4 h將卵冠丘復合體加入含精子濃度為50 000條/ml的受精滴中，培養(yǎng)14～18 h觀察受精情況，受精后第3天根據卵裂球數目、形態(tài)、空泡及碎片多少對胚胎等級進行評分，其中發(fā)育6細胞以上的1級和2級胚胎為優(yōu)質胚胎[16，17]。

1.2.6 胚胎移植及隨訪? 取卵后3 d行卵裂胚胎移植，每周期移植胚胎≤2個，移植后給予地屈孕酮片（荷蘭蘇威制藥有限公司，注冊證號：H20170221，規(guī)格10 mg）40 mg/d進行黃體支持。移植14 d后測血清絨毛膜促性腺激素（serum chorionic gonadotropin，HCG），陽性者為生化妊娠;移植后28 d行B超檢查，見孕囊及胎心搏動為臨床妊娠;12周之前經B超證實妊娠丟失為早期流產。

1.3 觀察指標

受精率=受精卵子數/獲卵數×100%;卵裂率=2PN卵裂數/受精卵數×100%;優(yōu)胚率=優(yōu)質胚胎數/2PN卵裂數×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠數/移植周期數×100%;早期流產率=早期流產數/臨床妊娠數×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料符合正態(tài)分布用（x±s）表示，若不符合用中位數表示，兩組變量對比采用獨立樣本t檢驗，多組間變量對比用單因素方差分析α為0.05;計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，檢驗水準α為0.05，組間多重比較采用χ2檢驗后的Bonferroni校正法，校正后的檢驗水準為0.0083。精子DFI與男方年齡及其他精液參數間的相關性采用多元線性回歸分析。

2 結果

2.1 受精、胚胎情況比較

不同形態(tài)組間的總受精率與兩原核（two pronuclei，2PN）受精率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），2PN卵裂率、優(yōu)胚率間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與DFI<30%相比，DFI≥30%組的受精率、2PN卵裂率及優(yōu)胚率均顯著降低;納入DFI后，C、D組的總受精率、2PN受精率顯著低于A、B組（均P<0.0083），D組2PN卵裂率（94.58%）顯著低于A組（98.43%）、C組（98.87%），B、D組的優(yōu)質胚胎率（32.57%、28.66%）顯著低于A、C組（47.86%，47.01%），差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.0083）。見表3～5。

2.3 妊娠結局比較

正常形態(tài)組臨床妊娠率、早期流產率分別為50.61%，10.84%，畸形精子組分別為44.78%，16.67%，臨床妊娠率、早期流產率在不同形態(tài)組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;納入DFI后臨床妊娠率在各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006），組間兩兩對比發(fā)現(xiàn)B組臨床妊娠率（32.57%）明顯低于A組（56.25%）（P=0.008）;早期流產率方面，盡管D組流產率最高，但由于樣本量小，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.474）。見表6～7。

2.4 精子DFI與年齡及精液參數的多元線性回歸分析

DFI與男性年齡呈顯著正相關（t=3.087，P=0.002），與前向運動精子呈顯著負相關（t=-5.319，P=0.001），與精液體積、精子濃度、正常精子形態(tài)無關（均P>0.05）。見表8、圖1。

3 討論

精子形態(tài)在自然妊娠及輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）治療中起著十分重要的作用，在精子生成與成熟的諸多程序中如果發(fā)生異常有可能產生大量的畸形精子，這些畸形精子可能存在某些結構或超微結構的異常而導致精子功能缺陷。卵子受精前，精子需要與卵子透明帶進行識別固定，卵細胞透明帶上存在著透明帶區(qū)糖蛋白3（zona pellucida glycoproten 3，ZP3），而精子頭部膜表面有著與其相應的結合蛋白受體mZP3，頭部形態(tài)異?？赡苁筸ZP3的功能結構發(fā)生改變，從而影響精卵識別而導致卵子不受精[18，19]。此外，精子頂體覆蓋于細胞核前，內部含有多種特殊的溶酶體，在精子穿越卵細胞表面的顆粒層、透明帶及卵細胞膜中發(fā)揮重要作用，而擁有正常形態(tài)的頂體是發(fā)生頂體反應和受精的重要前提[20，21]。

雖然精子形態(tài)對受精有很強的預測作用，但對隨后的妊娠結局影響有限。近年來，精子DNA完整性在生殖中的影響愈發(fā)受到重視。在受孕過程中，精子細胞核作為一種載體將父系的遺傳信息轉移入卵母細胞中，配子DNA通過整合重組傳給子代。胚胎的持續(xù)發(fā)育依賴于遺傳物質的完整性，精子核DNA損傷會使遺傳物質在重組過程中發(fā)生密碼子的錯誤讀取而致基因突變，從而增加胚胎染色體的異常率，最終造成不良的妊娠結局。精子DNA的損傷貫穿于精子發(fā)生、成熟及隨后的整個過程，理化、生物等因素可造成精子核DNA單鏈、雙鏈斷裂和染色體結構發(fā)生改變，使DNA完整性受損，精子本身并不具備修復損傷的能力，任何形式的DNA損傷都可能影響遺傳物質的重組及相關基因、蛋白的正確表達而改變表觀遺傳，從而影響胚胎的發(fā)育潛能。

本研究顯示，在不同形態(tài)組中，畸形精子組的總受精率與2PN受精率顯著低于正常形態(tài)組，畸形精子與異常受精的增加有關?；尉訉κ芫牟焕绊懺缫勋@得臨床共識[8，9，12，22，23]，受精中，精子形態(tài)上的缺陷會產生某些結構或超微結構的異常，這些異常會導致精子與卵子間相關蛋白、受體表達失常，從而使受精發(fā)生障礙。納入DFI后發(fā)現(xiàn)，雖然C、D組的總受精率、2PN受精率顯著低于A、B組，但在不同形態(tài)組中，隨著DFI的增高并不會顯著降低總受精率及正常受精率。這與Green等[24，25]研究一致，他們認為精子DNA損傷并非意味著與受精功能相關的基因、蛋白轉錄表達一定存在異常，且卵子受精階段主要受母源基因組的調控，父系DNA表達在胚胎發(fā)育階段才開始呈現(xiàn)。不過，關于“精子DNA損傷在體外受精治療中是否對受精率有影響”仍存在爭議。有學者認為精子DNA損傷會導致相應蛋白的轉錄與合成障礙，從而降低精子頂體酶活性及精子穿越卵透明帶與卵黃膜融合的能力而發(fā)生受精障礙[26～28]。對不同結論的爭議可能與實驗研究對象的入選標準、DFI閾值界定、檢測方法及卵子對精子DNA損傷的修復能力不同有關。本研究數據還顯示不同精子形態(tài)組間的2PN卵裂率、優(yōu)胚率無顯著性差異，納入DFI后顯示D組2PN卵裂率顯著低于A組和C組，B、D組的優(yōu)胚率顯著低于A、C組。有研究[29]表明無論是IVF還是卵細胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），不同形態(tài)組的卵裂率及優(yōu)胚率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）;馬媛等[30]研究發(fā)現(xiàn)精子形態(tài)與優(yōu)胚率、囊胚形成率及胚胎染色體非整倍體率均無關。多數學者[9，31]認為雖然畸形精子的結構缺陷會在受精階段影響相關蛋白、受體的正常表達而導致受精障礙，但并不參與受精卵后續(xù)的發(fā)育進程，胚胎的持續(xù)發(fā)育更依賴于染色質的完整。雖然精子形態(tài)沒有顯示出與胚胎質量間的相關性，但本研究發(fā)現(xiàn)在不同形態(tài)組中，過高的DFI會顯著降低卵裂率及優(yōu)胚率。

精子質量在妊娠結局中扮演非常重要的角色，有學者認為畸形精子癥會顯著增加胚胎的非整倍體率，降低種植率及臨床妊娠率[32]。而更多研究[12，33]認為雖然正常精子形態(tài)率<4%時會顯著降低IVF總受精率，但并不影響妊娠及新生兒出生后的結局，不同形態(tài)組的臨床妊娠率、流產率、活產率及新生兒性別、早產、出生體重、出生缺陷率等均無統(tǒng)計學差異。本研究雖然并未顯示出精子形態(tài)對妊娠結局的顯著影響，但相比畸形精子組，正常精子形態(tài)組患者通過更高的受精率可獲得更多的優(yōu)質胚胎數[正常組（4.56±2.34）枚，畸形組（3.13±2.06）枚]。由于每次移植胚胎數為兩枚，優(yōu)胚數量的不同可能對本次移植后的臨床妊娠率影響不大，但對移植妊娠失敗的患者來說，正常形態(tài)組擁有更多的優(yōu)質胚胎能夠進行第2次甚至第3次移植，從而獲得更高的累積妊娠率。在相同精子形態(tài)組中，隨著DFI的增高，其臨床妊娠率會顯著降低，但早期流產率在各組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.474），這可能與早期流產相關的樣本量較少有關。目前，大量研究[13，14，26，34，35]已證實精子DNA損傷對IVF/ICSI的妊娠結局有顯著的負面影響，精子DNA在父系遺傳信息的傳遞過程中發(fā)揮重要作用，它的完整性影響著胚胎形成及后續(xù)的持續(xù)發(fā)育，從而可能造成妊娠失敗或妊娠丟失增加。最近的幾項meta分析[15，36]也表明在IVF及ICSI的治療中，精子DFI對胚胎質量、臨床妊娠率及流產率有良好的預測作用。

通過相關性分析，本研究進一步發(fā)現(xiàn)DFI與男方年齡呈顯著正相關，與前向運動精子呈顯著負相關（P=0.002，0.001）。父系高齡生育可影響子代的健康，增加子代患病及出生缺陷的風險。這是因為隨著男性年齡的增加，曲細精管逐漸硬化，微循環(huán)發(fā)生障礙，血清性激素水平下降，生殖細胞增殖減少，這些因素可降低精子染色質成熟度，增加新生精子的基因突變，精子DNA完整性與精液質量下降。國外研究已證實DFI與年齡之間的關系，尤其在不育不孕人群中，隨著男性年齡的增長，精子DFI顯著增高[37，38]。因此，在試管治療中，不僅要關注女性年齡，也不能忽視父系高齡帶來的諸多不利影響。DFI與精液參數之間的關系存在一定爭議，一些學者認為精子DFI與精子濃度、活力及形態(tài)等密切相關，精子DNA損傷與氧化應激、環(huán)境、遺傳等因素有關，而這些因素也會作用于精子的生成與成熟，從而對精液參數產生影響[39～42]。另有研究[43]認為精子DFI僅與精子活動率、前向運動精子率相關，與精子濃度等無關。對此，Alargkof等[44]進一步研究發(fā)現(xiàn)在生育人群中，精子DNA損傷與各精液參數間沒有相關性，而在不育人群中，DFI與前向運動精子率及正常形態(tài)率間呈顯著負相關。精子DFI與精液參數有非常復雜的關聯(lián)，這種關聯(lián)在正常生育男性與不育男性中的表現(xiàn)可能并不一致，此外DFI與精液其他參數的作用機制尚不明，需要繼續(xù)研究與探索。

本研究認為精子DFI對胚胎質量及妊娠結局有著良好的預測作用，同時精子形態(tài)對受精有著極強的預測能力，是獲取更多優(yōu)質胚胎的關鍵，對累積妊娠率有顯著影響，兩者聯(lián)合評估可彌補單獨使用精子形態(tài)對胚胎發(fā)育、妊娠結局的預測不足，從而建立一個更為高效準確的預測體系，有很高的應用價值。此外，作為一項回顧性研究，缺乏對活產率及新生兒相關結局的隨訪與統(tǒng)計，且在妊娠結局方面，早期流產相關病例數較少，這可能對研究造成一定的偏倚與局限性，需要今后進一步研究。

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（收稿日期：2021-11-03）