王艷紅，張麗娜，2，牛思思，3，馬振國，4，常樂，5，喬長晟，6*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心，天津 300457；3.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；4.寧夏索米亞生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，寧夏 吳忠 751100；5.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；6.天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457）

亞麻籽餅粕是亞麻籽加工制油的主要副產(chǎn)物，亞麻籽餅粕中的粗蛋白含量達(dá)30%以上，脂肪含量在6.5%以上，粗制膳食纖維含量約為26%，碳水化合物含量為6.5%。除此之外，亞麻籽餅粕中分離出有價(jià)值的營養(yǎng)成分，這些活性物質(zhì)以及不飽和脂肪酸有多種保健功能。Xia等[1]的研究表明添加研磨亞麻籽的飲食通過降低TLR4/NF-κB通路的基因表達(dá)和改變鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠的腸道微生物群來改善肝臟炎癥。Parikh等[2]的研究表明膳食亞麻籽對心肌梗死后室性心律失常和左室擴(kuò)張有保護(hù)作用。除此之外，亞麻籽還具有降血脂、降膽固醇[3]、抗氧化[4]、提高免疫力[5]、抗癌[6-7]和減肥[8]等多種功效。根據(jù)國內(nèi)外研究表明，很多研究者利用酶水解技術(shù)對廢渣副產(chǎn)物進(jìn)行高值化、生態(tài)化利用，特別是功能多肽的制備，其中活性肽在體外具有黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）抑制活性，在體內(nèi)具有降尿酸的活性[9]。酶法水解反應(yīng)過程比較溫和，反應(yīng)用時(shí)短且得率高，不會破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，且純度較高，能較好地保留酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)價(jià)值[10]。酶法水解亞麻籽餅粕制備的多肽耐受性良好，可以穩(wěn)定存在于強(qiáng)酸和高溫中而不被破壞。

本試驗(yàn)以副產(chǎn)物亞麻籽粕廢渣為研究對象，使用不同蛋白酶制備酶解產(chǎn)物，比較不同酶解產(chǎn)物的黃嘌呤氧化酶抑制活性以及抗氧化活性，為亞麻籽粕蛋白質(zhì)功能活性肽的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

亞麻籽、生榨餅粕、熟榨餅粕：寧夏索米亞生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（152 000 U/g）、復(fù)合蛋白酶（421 800 U/g）、水解蛋白酶（11 436 U/g）、中性蛋白酶（256 900 U/g）、復(fù)合蛋白酶粉末（21 809 U/g）、風(fēng)味蛋白酶粉末（70 213 U/g）、木瓜蛋白酶（256 915 U/g）、堿性蛋白酶（460 638 U/g）：天津慧智百川生物技術(shù)有限公司；黃嘌呤氧化酶（100 U/mg）、別嘌呤醇、C2HCl3O2、K2SO4、CuSO4：天津市裕達(dá)科技發(fā)展有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（752）：天津市拓普儀器有限公司；臺式高速離心機(jī)（TGL-16C）：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯pH計(jì)（FE20）：北京匯中順成科技有限責(zé)任公司；搖床（SKY-2102）：蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（WDP-9062）：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9030MBE）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；半自動凱氏定氮儀（K9840）：山東海能科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（LC-20AT）：日本島津有限公司；恒溫振蕩水浴鍋（HH-S4）：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；快速冷凍干燥機(jī)（Alpha2-4LDpLus型）：德國Chirst公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢測指標(biāo)及方法

蛋白質(zhì)含量測定：參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的方法，采用凱氏定氮法測定[11]。

脂肪的測定：參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》中的方法，采用索氏抽提法測定[12]。

灰分的測定：參考GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》[13]中的方法。

粗纖維的測定：參考GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》[14]中的方法。

總糖的測定：參考DB12/T 847—2018《飼料中總糖的測定分光光度法》[15]中的方法。

游離脂肪酸的測定：參考NY/T 1797—2009《油菜籽中游離脂肪酸的測定滴定法》[16]中的方法。

多酚的測定：參考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定分光光度法》[17]中的方法。

碳水化合物的測定：參考GB 28050—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》[18]中的方法計(jì)算。

1.2.2 亞麻籽多肽制備工藝

亞麻籽餅粕→粉碎過濾→過60目篩→調(diào)料液→膠體研磨→調(diào)pH值→酶解→離心→取上清液→冷凍干燥→粗多肽粉

1.2.3 酶解亞麻籽餅粕制備多肽

粉碎亞麻籽餅粕并去除其中雜質(zhì)，稱取一定量亞麻籽餅粕，按料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水制成懸浮液，并分別調(diào)節(jié)復(fù)合蛋白酶粉末pH 6.0、風(fēng)味蛋白酶粉末pH 6.0、中性蛋白酶pH 7.0、水解蛋白酶pH 9.0、復(fù)合蛋白酶（液體）pH 6.0、風(fēng)味蛋白酶（液體）pH 6.0、木瓜蛋白酶pH 6.0、堿性蛋白酶pH 9.0，按照酶活2 000 U/g分別加入風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶等8種蛋白酶，將反應(yīng)溫度與溶液的pH值調(diào)至每種蛋白酶的最適溫度與pH值，在恒溫振蕩水浴鍋酶解5 h，酶解結(jié)束后立即用100℃水浴滅酶 15 min，冷卻至室溫（25℃），5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min提取多肽，離心沉淀，膜過濾提純，-80℃冷凍干燥，用凍干機(jī)凍干，備用。

1.2.4 多肽含量的測定

參考 GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》[19]，利用三氯乙酸沉淀蛋白并結(jié)合凱氏定氮法測定酶解產(chǎn)物中的多肽含量。

1.2.5 多肽得率的測定

多肽得率計(jì)算公式如下。

式中：m1為亞麻籽粗多肽質(zhì)量，g；m2為亞麻籽餅粕質(zhì)量，g。

1.2.6 黃嘌呤氧化酶抑制活性測定

參考文獻(xiàn)[20-21]中的方法，將200 μL樣品依次加入10mL離心管中，與50 μL 0.03 U/mL黃嘌呤氧化酶溶液混勻，37℃下溫浴10 min。加入400 μL 0.42 mmol/L黃嘌呤溶液，2 800 μL Tris-HCl緩沖液啟動反應(yīng)，37℃下保溫20 min，加150 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。使用去離子水代替樣品做空白試驗(yàn)。別嘌呤醇（20 mmol/L和60 mmol/L）做陽性對照。過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾反應(yīng)液后進(jìn)行高效液相檢測，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件為色譜柱：Shim pack C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：95%15 mmol/L NH4H2PO4+5%色譜級甲醇（pH6.5）；檢測波長：290 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25℃。

使用不同濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃嘌呤氧化酶抑制率計(jì)算公式如下。

式中：X1為試驗(yàn)組尿酸含量，μmol/mL；X2為對照組尿酸含量，μmol/mL。

1.2.7 體外抗氧化活性測定

1.2.7.1 ABTS+自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)[22-23]的方法進(jìn)行測定。配制7 mmol/L ABTS+母液及2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，使用前以1∶1的體積比混合，避光放置16 h后，用pH 7.4、濃度5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS+溶液，使其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。將ABTS+溶液與樣品等體積混合，室溫（25℃）反應(yīng)10 min后，在734 nm下測定吸光度A1?？瞻捉M用蒸餾水代替樣品，吸光度記為A0。以維生素C（1 mg/mL）作為對照。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.2.7.2 羥基自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)[24-25]的方法進(jìn)行測定。將1 mL樣品與0.3 mL FeSO4（8 mmol/L）、1 mL水楊酸（3 mmol/L）及1 mL H2O2（3%）混勻，37℃保溫30 min，冷卻至室溫（25℃）后，加入0.7mL蒸餾水使反應(yīng)液總體積達(dá)4 mL，5 000 r/min離心10 min，510 nm波長下測定吸光度A1，用蒸餾水代替樣品作為空白對照，吸光度記為A0。以維生素C（1 mg/mL）作為對照。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.2.8 單因素試驗(yàn)

探究料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、酶解pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、酶添加量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/g）、酶解溫度（40、45、50、55、60 °C）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）對多肽得率的影響及對黃嘌呤氧化酶的抑制活性的影響。

1.2.9 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用試驗(yàn)次數(shù)為12的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對酶解過程中影響多肽得率的5個(gè)因素（A料液比、B酶解pH值、C酶添加量、D酶解溫度、E酶解時(shí)間）進(jìn)行研究，以多肽得率為響應(yīng)值。編碼和水平因素如表1所示。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)水平及編碼Table 1 Plackett-Burman experiment test standard and code

1.2.10 最陡爬坡試驗(yàn)

在PB試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，按一定的梯度增加C酶添加量、D酶解溫度和E酶解時(shí)間的梯度，其余2個(gè)均取單因素最佳值，測定多肽得率，從而確定這3個(gè)因素的最佳條件。

1.2.11 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，確定了酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度為試驗(yàn)因素。通過Box-Behnken設(shè)計(jì)，以多肽得率為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，各因素水平及編碼值如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平Table 2 Response surface analysis factor and level

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽餅粕營養(yǎng)成分

亞麻籽餅粕營養(yǎng)成分的檢測結(jié)果見表3。

表3 亞麻籽餅粕中的基本營養(yǎng)成分的測定Table 3 Determination of basic nutrients in flaxseed cake

由表3可知，亞麻籽餅粕中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，本文采用熟榨餅粕，熟榨餅粕蛋白質(zhì)含量較高為32.31%，粗纖維含量30.00%，灰分含量5.20%，總糖14.24%，游離脂肪酸1.20%，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。此外，亞麻籽餅粕還含有多酚、木酚素等抗氧化物質(zhì)，其中多酚含量4.90 mg/g。研究表明，亞麻籽及其餅粕的基本成分、營養(yǎng)價(jià)值與大豆粕相比，其氨基酸組成與大豆相似，缺乏賴氨酸、蛋氨酸，富含色氨酸。亞麻籽餅粕是可以進(jìn)行開發(fā)的豐富蛋白質(zhì)資源，是優(yōu)質(zhì)植物蛋白。

2.2 不同蛋白酶酶解效果的影響

不同蛋白酶酶解亞麻籽餅粕結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在酶添加量為2 000 U/g、酶解時(shí)間5 h條件下，堿性蛋白酶酶解亞麻籽餅粕的多肽得率較高，水解效果較好。風(fēng)味蛋白酶粉末在8種酶中顯示出最弱的水解能力，其酶解多肽得率最低。在酶解反應(yīng)中，蛋白質(zhì)之間的一些相互作用被破壞，影響功能特性[26]，所以不同酶解反應(yīng)黃嘌呤氧化酶抑制活性也不同，復(fù)合蛋白酶粉末和堿性蛋白酶的酶解反應(yīng)后多肽的黃嘌呤氧化酶抑制活性較好，綜合考慮選用堿性蛋白酶作為最優(yōu)酶。

圖1 不同蛋白酶對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響Fig.1 Effects of different proteases on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase

2.3 不同蛋白酶對多肽的抗氧化活性的影響

亞麻籽多肽的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，不同種類的蛋白酶酶解所得多肽的自由基清除率雖存在區(qū)別，但均在80%以上，其中堿性蛋白酶酶解物的自由基清除率最高。由此推斷，多肽得率與抗氧化活性呈正相關(guān)。與任佰萍等[27]的研究結(jié)果一致。

圖2 不同蛋白酶對多肽抗氧化活性的影響Fig.2 The effect of different proteases on antioxidant activity

2.4 酶解工藝的優(yōu)化

2.4.1 酶添加量對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酶添加量對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響見圖3。

圖3 酶添加量對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響Fig.3 The effect of the amount of enzyme added on the peptide yield and xanthine oxidase inhibitory activity

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，多肽得率先呈上升趨勢。當(dāng)酶添加量4 000U/g時(shí)多肽得率最高，此時(shí)亞麻籽多肽得率達(dá)到67.46%。隨著酶添加量的增加，亞麻籽多肽的水解度不再增加，呈平穩(wěn)趨勢。酶添加量達(dá)到底物與酶作用的飽和時(shí)，水解達(dá)到飽和，多肽得率不再增加。亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性幾乎相差不大，因此確定最適酶添加量為4 000 U/g。

2.4.2 酶解時(shí)間對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酶解時(shí)間對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響Fig.4 The effect of different enzymatic hydrolysis time on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase

隨著酶解時(shí)間的延長，多肽得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。亞麻籽多肽的形成需要一定的時(shí)間，隨著時(shí)間的延長，小分子多肽逐漸增加。酶解時(shí)間為5 h時(shí)，多肽得率為70.16%，酶解效果達(dá)到峰值。酶解時(shí)間繼續(xù)延長，多肽含量并未增加，是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長，溶液中底物濃度達(dá)到飽和，反應(yīng)速度下降。亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性隨著酶解時(shí)間的延長呈先增加后降低趨勢，酶解5 h時(shí)，亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性為62.04%，與其他時(shí)間抑制活性相差不大。因此確定最適酶解時(shí)間為5 h。

2.4.3 酶解溫度對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酶解溫度對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響Fig.5 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase

由圖5可知，隨著酶解溫度的逐漸升高，亞麻籽餅粕酶解多肽得率呈上升趨勢，亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性波動變化。在50℃時(shí)，多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性達(dá)到最大。繼續(xù)升高溫度，蛋白逐漸發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白酶活力逐漸降低，多肽得率呈下降趨勢。因此確定最佳酶解溫度為50℃。

2.4.4 堿性蛋白酶酶解pH值對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酶解pH值對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響見圖6。

圖6 酶解pH值對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響Fig.6 The effect of different pH on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase

由圖6可知，隨著酶解pH值的增加，多肽得率逐漸增加；當(dāng)pH值達(dá)到10.5時(shí)，多肽得率為62.20%，亞麻籽多肽得率達(dá)到最大。在pH 8.0～10.0條件下，多肽得率變化不大，但是黃嘌呤氧化酶抑制活性波動變化，可能是由于pH值不同改變了酶與底物的帶電狀態(tài)，影響了酶解反應(yīng)。當(dāng)pH值增大或者減小時(shí)，影響亞麻籽蛋白分子酶切位點(diǎn)與蛋白酶活性，破壞了酶與亞麻籽蛋白最適宜的酶解空間結(jié)構(gòu)[28]，黃嘌呤氧化酶抑制活性降低。因此確定最適pH值為10.5。當(dāng)pH值為11時(shí)，由于溶液局部pH值太高，反復(fù)調(diào)節(jié)過程中強(qiáng)堿對pH電極造成影響，pH計(jì)不穩(wěn)定，因此選擇9.5、10.0、10.5進(jìn)行PB試驗(yàn)。

2.4.5 堿性蛋白酶料液比對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

不同料液比對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響見圖7。

由圖7可知，隨著溶劑體積的逐漸增加，多肽得率逐漸上升，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，多肽得率達(dá)到最大，為64.43%。溶劑體積繼續(xù)增大，多肽得率降低。當(dāng)料液比在 1∶10（g/mL）～1∶20（g/mL）范圍內(nèi)，隨著溶劑體積增加，溶劑與溶質(zhì)接觸更加充分，促進(jìn)混溶蛋白溶解成多肽，多肽得率逐漸增大。隨著溶劑體積增加，溶液濃度減小，亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性也降低。但繼續(xù)增大溶劑體積，多肽得率變化不明顯。因此確定最佳料液比為1∶20（g/mL）。

圖7 不同料液比對多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響Fig.7 The effect of different material-liquid ratios on the yield of peptides and the inhibitory activity of xanthine oxidase

2.5 PB試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 4 PB test design and test results

PB試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表5。

表5 PB試驗(yàn)方差分析Table 5 PB experiment analysis of variance table

排列圖結(jié)果見圖8。

圖8 各因素的排列圖Fig.8 Pareto chart of each factor

由表5和圖8可知，正影響因子有A料液比、B酶解pH值、C酶添加量、E酶解時(shí)間。負(fù)影響因子為D酶解溫度。其中C酶添加量、D酶解溫度、E酶解時(shí)間對多肽得率的合成有顯著的影響。因此選擇C酶添加量、D酶解溫度、E酶解時(shí)間為下一步爬坡試驗(yàn)的研究對象。

2.6 爬坡試驗(yàn)

爬坡試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental design and the results of steepest ascent

由表6可知，在酶添加量4 000 U/g、酶解溫度50 U/g、酶解時(shí)間5.0 h時(shí)，多肽得率達(dá)到最大，因此選擇其作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表7所示。

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Response surface experiment design and results

續(xù)表7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 7 Response surface experiment design and results

多元回歸方程的方差分析結(jié)果見表8。

表8 多元回歸方程的方差分析Table 8 Analysis of variance in multiple regression equation

由表 8可知，模型的F 值為115.28，P＜0.000 1，說明模型差異極顯著。R2大于0.8說明方程擬合度較好，可以用此模型對蛋白酶酶解亞麻籽餅粕工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)合方差分析可知，一次項(xiàng)中F、H對多肽得率的影響極顯著，G對多肽得率的影響顯著。交互作用FG、FH、GH 對多肽得率影響不顯著，二次項(xiàng) F2、G2、H2對多肽得率影響極顯著。各因素對亞麻籽多肽的影響次序?yàn)槊柑砑恿浚久附鉁囟龋久附鈺r(shí)間。通過采用Design Expert 8.0得出最佳條件為堿性蛋白酶酶添加量4 060.17 U/g、酶解時(shí)間5.18 h、酶解溫度49.59℃，多肽得率預(yù)測值為68.27%。對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到三維模型圖，如圖9～圖11所示。

圖9 酶添加量和酶解時(shí)間三維平面關(guān)系圖Fig.9 Three-dimensional plane relationship diagram between enzyme addition amount and enzymolysis time

圖10 酶添加量和酶解溫度三維平面關(guān)系圖Fig.10 Three-dimensional plane relationship diagram of enzyme addition and enzymolysis temperature

圖11 酶解時(shí)間和溫度三維平面關(guān)系圖Fig.11 Three-dimensional plane relationship diagram of enzymolysis time and temperature

響應(yīng)面為平滑的曲面，且開口向下，說明在響應(yīng)曲面上存在最大響應(yīng)值，可從中確定最佳因素水平范圍。如圖9～圖11所示，亞麻籽多肽得率隨著酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，存在極大值。此外，等高線沿酶添加量軸變化趨勢明顯高于酶解溫度和酶解時(shí)間，由此可知，酶添加量對多肽得率的影響大于酶解時(shí)間和酶解溫度。酶添加量和酶解時(shí)間、酶添加量和酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用對亞麻籽多肽得率影響不顯著，與試驗(yàn)得到結(jié)果相符。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照預(yù)測條件進(jìn)行平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，測得結(jié)果取算數(shù)平均值，得到亞麻籽多肽得率為67.24%，與預(yù)測值68.27%較為接近，證明此模型參數(shù)可靠，有參考價(jià)值。

2.9 亞麻籽多肽抗氧化活性及黃嘌呤氧化酶抑制活性

亞麻籽多肽抗氧化活性的結(jié)果見表9。

表9 亞麻籽多肽與常用抗氧化劑之間的比較結(jié)果Table 9 Comparison results between flaxseed peptides and commonly used antioxidants

由表9可知，亞麻籽多肽對ABTS+自由基和·OH的清除率均高于未水解亞麻籽餅粕，但要低于VC。亞麻籽多肽對ABTS+自由基和·OH的清除率為92.68%、90.65%，VC對ABTS+自由基和·OH的清除率為95.78%、92.65%。結(jié)果表明，蛋白酶解后，所得到的特定多肽段抗氧化效果更好。多肽的自由基清除能力對亞麻籽多肽的抗氧化性起著重要作用。

亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性的結(jié)果見表10。

表10 亞麻籽多肽與別嘌呤醇之間對黃嘌呤氧化酶抑制活性的比較結(jié)果Table 10 Comparison of xanthine oxidase inhibitory activity between flaxseed polypeptide and allopurinol

由表10可知，未水解亞麻籽餅粕對黃嘌呤氧化酶的抑制為40.85%，亞麻籽多肽對黃嘌呤氧化酶抑制性為60.04%，與對照組接近，表明亞麻籽多肽具有較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制活性。

3 結(jié)論

以亞麻籽加工制油的主要副產(chǎn)物亞麻籽餅粕為原料，通過酶解亞麻籽餅粕制備多肽。以多肽得率和黃嘌呤氧化酶抑制活性為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化亞麻籽多肽制備工藝。最佳工藝為用堿性蛋白酶水解制備亞麻籽多肽，最佳酶解條件為酶添加量4 060.17 U/g、酶解pH值10.5、酶解溫度49.59℃、酶解時(shí)間5.18 h、料液比1∶20（g/mL），此條件下多肽得率為67.24%。亞麻籽多肽對ABTS+自由基和羥基自由基有明顯的清除作用，說明亞麻籽多肽具有抗氧化活性，且對黃嘌呤氧化酶也有一定的抑制活性。