呂 東，趙 祜，趙興鵬，趙 明，趙國生，王藝林，劉 瑩，陳 敏*，王光宇*

(1. 甘肅省祁連山水源涵養(yǎng)林研究院,甘肅張掖 734000 ； 2.北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點實驗室，北京 100083)

圓柏大痣小蜂MegastigmussabinaeXuetHe是膜翅目Hymenoptera大痣小蜂科Megastigmidae大痣小蜂屬Megastigmus的寡食性害蟲(徐志宏和何俊華, 1989; 李孟樓, 2002; Petretal., 2017)。幼蟲以祁連圓柏SabinaprzewalskiiKom.種仁為食，并與球果的生長發(fā)育同步，其生活史大部分時間都在球果種仁內(nèi)為害，具有隱蔽性且不易觀察。該蜂在肅南縣境內(nèi)植株果實蟲害率高達(dá)100%，其他地方的果實蟲害率也達(dá)到90%以上，分布于整個祁連山林區(qū)，危害面積達(dá)16 567 hm2。近年來，由于圓柏大痣小蜂種群的自然擴(kuò)張和人為種苗運輸，在西藏自治區(qū)中部的熱振國家森林公園的大果圓柏JuniperustabeticaKom.種仁內(nèi)也發(fā)現(xiàn)圓柏大痣小蜂為害(索南措等, 2020)。關(guān)于圓柏大痣小蜂幼蟲蟲齡劃分及測定方面的研究未見報道，明確其幼蟲各發(fā)育階段的特征，有利于準(zhǔn)確了解圓柏大痣小蜂幼蟲的發(fā)育情況并開展相應(yīng)的防治措施。

Dyar(1890)通過總結(jié)27種鱗翅目幼蟲齡期的研究發(fā)現(xiàn)，大部分鱗翅目幼蟲的頭寬在每次成功蛻皮后都呈有規(guī)律的幾何式增長，稱作Dyar氏法則，并認(rèn)為骨化結(jié)構(gòu)會在幼蟲蛻皮的過程中有規(guī)律地增長，可作為分齡過程中的可靠指標(biāo)。在一些天牛的幼蟲中，非骨化指標(biāo)也可被用來劃分幼蟲齡期，如氣門長(寬)、剛毛數(shù)、體寬及體長等(黎保清等, 2012; 王小藝等, 2012; 潘龍等, 2015)。

本研究通過測定自然條件下圓柏大痣小蜂幼蟲上顎關(guān)節(jié)寬、頭寬、體寬和體長4項指標(biāo)，并結(jié)合頻次分布等方法確定幼蟲的齡數(shù)及齡期，為進(jìn)一步明確圓柏大痣小蜂的生物學(xué)特性及該害蟲的合理防治提供理論基礎(chǔ)，同時也為野外調(diào)查和快速判斷幼蟲蟲齡提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

圓柏大痣小蜂的幼蟲和蛹均通過解剖祁連圓柏球果獲得，祁連圓柏受害果采集于甘肅省張掖市肅南裕固族自治縣頭灘地區(qū)的祁連圓柏林(海拔2 700 m)。采集日期自2019年6月16起至2020年5月15日結(jié)束，開始的兩個半月(6月16日-8月27日)大約每半個月采集一次，其余各齡幼蟲間隔約1個月，于樣地采集球果至實驗室解剖獲得。為準(zhǔn)確獲取1齡幼蟲，在圓柏大痣小蜂成蟲羽化中期摘取1年生祁連圓柏球果，于實驗室常溫條件保存，每天解剖觀察幼蟲是否孵化。幼蟲解剖后先置于75%酒精中浸泡麻痹后轉(zhuǎn)移至0.1 M，pH 7.4 PBS緩沖液中保存待測。

1.2 幼蟲形態(tài)指標(biāo)的測定與齡期劃分方法

幼蟲各齡期測量指標(biāo)均利用Leica M205 FA體視顯微鏡獲取。測量共選擇圓柏大痣小蜂幼蟲的4個形態(tài)指標(biāo)：上顎關(guān)節(jié)寬-Y1(上顎兩側(cè)最寬處距離)；頭寬-Y2(頭兩側(cè)最寬處距離)；體寬-Y3(第6體節(jié)寬)和體長-Y4(頭至體末長)，如圖1所示。

圖1 圓柏大痣小蜂幼蟲蟲齡劃分的4個測量指標(biāo)Fig.1 Four variables measured for separating instars of Megastigmus sabinae larvae注：Y1，上顎關(guān)節(jié)寬；Y2，頭寬；Y3，體寬；Y4，體長。Note: Y1, Mandible joint width; Y2, Head width; Y3, Body width; Y4, Body length.

用Origin 2018繪制圓柏大痣小蜂幼蟲的各項測量指標(biāo)的頻次分布圖，初步確認(rèn)幼蟲齡數(shù)。根據(jù)分齡結(jié)果計算主要指標(biāo)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)、Crosby指數(shù)等。當(dāng)變異系數(shù)<20%、Crosby指數(shù)<10%時，分齡準(zhǔn)確，該指標(biāo)符合要求(Craig, 1975)。生長率和Crosby指數(shù)按如下公式計算(王小藝等, 2005)。最后根據(jù)Dyar氏法則，利用SPSS 23.0中的回歸分析對幼蟲不同指標(biāo)的生長曲線進(jìn)行擬合。

式中G為生長率(growth rate)，即Dyar氏指數(shù)，也稱Brooks指數(shù)(Loerch and Cameron, 1983)。xn和xn-1為相鄰兩齡幼蟲分齡指標(biāo)。Cn為Crosby指數(shù)，Gn和Gn-1為相鄰兩齡幼蟲的生長率。

獲得各齡期指標(biāo)的范圍后，選擇頻數(shù)分布重疊程度最小的指標(biāo)，以各齡期第一次測定的時間為各齡幼蟲的齡期開始時間，作圖觀察幼蟲不同時間上顎關(guān)節(jié)寬大小，以估算各齡幼蟲的齡期(根據(jù)全年調(diào)查的圓柏大痣小蜂生活史情況，5齡幼蟲以至化蛹初期的時間為準(zhǔn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 圓柏大痣小蜂幼蟲齡數(shù)劃分

通過測量625頭圓柏大痣小蜂幼蟲的4項指標(biāo)，并分別繪制頻數(shù)分布圖，結(jié)果表明：上顎關(guān)節(jié)寬、頭寬和體寬3個指標(biāo)的頻數(shù)分布均具有明顯的5個峰值，而體長指標(biāo)對齡期劃分不明顯。其中，上顎關(guān)節(jié)寬的峰值分別在0.116、0.148、0.188、0.212和0.236 mm；頭寬的峰值分別為0.250、0.350、0.460、0.580和0.710 mm；體寬的峰值分別為0.525、0.700、0.975、1.375和1.700 mm。根據(jù)Dyar氏法則初步判斷圓柏大痣小蜂幼蟲的齡數(shù)為5齡。

在測量的4個指標(biāo)中，上顎關(guān)節(jié)寬的頻次分布圖出現(xiàn)的峰值最為明顯，且5個峰的重疊度相對較小。頭寬與體寬的頻次分布圖也出現(xiàn)了5個明顯的峰，也可以作為齡期劃分的形態(tài)指標(biāo)，但這兩個指標(biāo)為非骨化結(jié)構(gòu)，受營養(yǎng)條件、環(huán)境等因素的影響較大，相鄰齡期重疊程度較高。對各齡幼蟲的上顎關(guān)節(jié)寬、頭寬和體寬進(jìn)行處理的各項結(jié)果顯示，這3項分齡指標(biāo)在不同齡數(shù)之間的各項指標(biāo)均值均具有顯著差異且變異系數(shù)均小于20%，Crosby指數(shù)均小于10%，幼蟲生長率在1.1～1.4之間。因此圓柏大痣小蜂幼蟲被劃分為5個齡期(表1)。

圖2 圓柏大痣小蜂幼蟲頻次分布圖Fig.2 Frequency distribution of Megastigmus sabinae larvae

2.2 圓柏大痣小蜂幼蟲齡期

在測定結(jié)果中，上顎關(guān)節(jié)寬的頻數(shù)分布重疊程度最小，因此以上顎關(guān)節(jié)寬作為估算各齡期時間的最佳標(biāo)準(zhǔn)。已知各齡幼蟲上顎關(guān)節(jié)寬的范圍，將每次采樣時測得的幼蟲上顎關(guān)節(jié)寬數(shù)據(jù)作圖(圖3)，以各齡期第一次采樣的時間為幼蟲的脫皮時間(5齡幼蟲至化蛹初期為準(zhǔn))估算各齡期時間。1～5齡幼蟲分別為30、200、30、30、15 d，共305 d，主要以2齡幼蟲越冬，極少數(shù)以1齡、3齡幼蟲越冬。幼蟲于次年3月中旬開始發(fā)育，4月中旬發(fā)育至3齡，經(jīng)2次蛻皮于6月中下旬化蛹。

圖3 圓柏大痣小蜂幼蟲齡期時間劃分圖Fig.3 Time division of Megastigmus sabinae larvae instar

3 結(jié)論與討論

目前，劃分和確定幼蟲種群齡期主要通過室內(nèi)個體飼養(yǎng)測定和自然界的種群眾數(shù)齡期測定兩種方法，由于幼蟲的生存條件不同，兩者之間所測定的幼蟲齡期往往存在一定差異(戴志一, 1980)，前者主要適用于鱗翅目及部分膜翅目等食葉幼蟲的齡期結(jié)構(gòu)(王建偉, 2011)。由于不同科屬間幼蟲骨化程度較高的部位有差別，因此在測量不同幼蟲中選擇的指標(biāo)也略有不同，如鞘翅目天?？朴紫x通常選擇頭殼、前胸背板、上顎等部位的指標(biāo)作為分齡的依據(jù)(王小藝等, 2012; 任驥, 2014)；鱗翅目幼蟲通常選擇頭殼、上顎、復(fù)眼間距及體長(寬)等指標(biāo)(楊美紅等, 2012; 陳琪等, 2015; 孫玉劍等, 2018)；膜翅目幼蟲則大多選擇頭殼寬、上顎長(寬)、體長(寬)等指標(biāo)(范麗清, 2008; 劉長月等, 2011)，另外，還可通過測定膜翅目幼蟲的尾鋏長(寬)來進(jìn)行劃分(閆家河等, 2020)。這些生長指標(biāo)的測量值反映了幼蟲不同階段的生長情況，同時也能夠反映出齡期劃分的合理性。

李秉新等(1991)在描述圓柏大痣小蜂生活習(xí)性的時曾提到過圓柏大痣小蜂幼蟲分為5齡，但并未介紹各蟲齡的具體判斷方法。本研究通過測量圓柏大痣小蜂幼蟲上顎關(guān)節(jié)寬、頭寬、體寬和體長4項指標(biāo)，并計算這4項指標(biāo)的均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差、變異系數(shù)、Brooks指數(shù)和Crosby指數(shù)，將幼蟲劃分為5齡。通過對各項分齡指標(biāo)的平均值進(jìn)行指數(shù)擬合，發(fā)現(xiàn)上顎關(guān)節(jié)寬、頭寬與體寬這3項指標(biāo)與齡數(shù)間的關(guān)系均符合Dyar氏法則，且均可以解釋種群90%以上的個體發(fā)育情況，進(jìn)一步表明圓柏大痣小蜂幼蟲劃分為5齡是準(zhǔn)確的，上顎關(guān)節(jié)寬為最理想的分齡指標(biāo)。在對體長的劃分時發(fā)現(xiàn)齡期劃分不明顯，且重疊度較高，因此不宜用于幼蟲齡數(shù)的劃分。另外，由于上顎關(guān)節(jié)寬度較小，野外調(diào)查和室內(nèi)研究中通過測量上顎關(guān)節(jié)寬來判斷幼蟲齡期較為困難，因此，可參考圓柏大痣小蜂幼蟲各齡期的頭寬與體寬測量范圍(表1)來進(jìn)行快速判斷。

根據(jù)調(diào)查與分析結(jié)果估算幼蟲總共歷期為305 d，1～5齡幼蟲的各齡時間分別為30、200、30、30、15 d。吳洪源等(1992)認(rèn)為圓柏大痣小蜂主要以3齡幼蟲越冬，本研究通過結(jié)合上顎關(guān)節(jié)寬對齡期的劃分與調(diào)查時間來進(jìn)行判斷，認(rèn)為圓柏大痣小蜂越冬時的蟲齡主要為2齡而并非3齡。

本研究明確了圓柏大痣小蜂的幼蟲齡期數(shù)和最佳分齡指標(biāo)，同時獲得各齡期上顎關(guān)節(jié)寬、頭寬、體寬3項指標(biāo)的范圍值，為進(jìn)一步開展該害蟲的生物學(xué)生態(tài)學(xué)、防控技術(shù)等研究提供指導(dǎo)。