吳 桐，牛康康，彭玉玲，馮啟理

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631)

Lark基因最初是從果蠅羽化節(jié)律缺失的突變體中鑒定出來的(Newbyetal., 1993)，是果蠅晝夜節(jié)律起搏器輸出路徑的組成成分(Zhangetal., 2000; Wangetal., 2005)。Lark在時(shí)間和空間的信息傳輸，導(dǎo)致行為變化的過程中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性，這可能與LARK靶向調(diào)控編碼鉀離子通道的mRNA有關(guān)(Huangetal., 2009)，或者通過調(diào)節(jié)信號(hào)分子如激酶或者磷酸酶從而控制離子通道和興奮性。LARK表達(dá)水平的節(jié)律性變化對(duì)于成蟲羽化的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)非常重要，該蛋白質(zhì)在介導(dǎo)蛻皮的時(shí)鐘調(diào)節(jié)中起抑制作用，lark基因產(chǎn)物增加會(huì)導(dǎo)致遲羽化表型(Newby and Jackson, 1996; Gerardetal., 1998; Iwai and Takeda, 2007)。

Lark在母體遺傳和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。McNeil(1999)等人發(fā)現(xiàn)在果蠅受精卵中l(wèi)ark開始進(jìn)行轉(zhuǎn)錄之前(0～2 h)，在前胚層胚胎中即含有豐富的larkmRNA，暗示了其作為母體遺傳信號(hào)發(fā)揮著作用。在卵巢管發(fā)育的卵室中的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中也可以檢測(cè)到lark表達(dá)，缺少lark母體遺傳成分的未受精卵子和受精卵都表現(xiàn)出“脆弱”表型，大多數(shù)胚胎在胚盤形成之前停止進(jìn)一步發(fā)育，還會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)傾倒和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織的缺陷(Mcneiletal., 2009)。在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，在家蠶Bombyxmori中用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Bmlark基因后，純合子突變體Bmlark-/-的胚胎死亡，不能正常孵化出蟻蠶。

lark對(duì)神經(jīng)元發(fā)育和功能也至關(guān)重要。有研究表明，LARK在整個(gè)胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)及成蟲神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)(Newbyetal., 1993)。在果蠅的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和腹神經(jīng)系統(tǒng)(VNS)中檢測(cè)到LARK的存在，在含有甲殼類動(dòng)物心臟活性肽CCAP(Crustacean cardioactive peptide)的神經(jīng)元中，LARK定位于細(xì)胞質(zhì)中(Huangetal., 2007)，而在其他神經(jīng)元中定位于細(xì)胞核。在其他組織中LARK也存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，暗示了LARK具有復(fù)雜的功能，可能在RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等過程中起著調(diào)控作用(Kojimaetal., 2007; Huangetal., 2014)。

Bmlark作為具有重要生物學(xué)功能的基因，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究通過構(gòu)建Bmlark基因啟動(dòng)子雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)，鑒定其調(diào)控活性區(qū)及可能與之結(jié)合的調(diào)控蛋白，為進(jìn)一步研究Bmlark基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶Bm12卵巢細(xì)胞株來自中山大學(xué)徐衛(wèi)華教授實(shí)驗(yàn)室；胎牛血清(FBS)和Grace液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。無血清培養(yǎng)基Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。X-tremeGENETMHP DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。一步法克隆試劑盒ClonExpress?ⅡOne StepCloning Kit購(gòu)自美國(guó)Vazyme公司。大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自深圳康體生命科技有限公司。dNTP (10 mM)、rTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、HindⅢ購(gòu)自Ttakara公司。凝膠DNA小量回收試劑盒購(gòu)自Magen公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根深化科技有限公司。雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。核蛋白提取試劑盒和LightShift?Chemiluminescent EMSA Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。DNA引物合成及基因測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物生物技術(shù)有限公司完成。蛋白質(zhì)譜分析由廣州唯譽(yù)智合科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子序列的PCR擴(kuò)增

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得包含啟動(dòng)子區(qū)域的家蠶Bmlark基因序列(-1 232～ +211)(GenBank Accession No.: NC_051360.1)。通過Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增該DNA序列的PCR引物，在上、下游引物的5′端分別引入與線性化載體兩端一致的16 bp同源重組序列及XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)序列(表1)。以家蠶基因組DNA作為PCR模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：2×taq Master 10 μL、DNA模板2.5 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 6.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小正確后，切膠并用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，擴(kuò)增正確的PCR產(chǎn)物命名為P1(-1 232～ +221)。設(shè)計(jì)引物對(duì)P1進(jìn)行系列截短PCR擴(kuò)增，得到的目的PCR產(chǎn)物依次命名為P2(-529～ +211)、P3(-220～+211)、P4(-124～ +211)、P5(-92～ +211)、P6(-66～ +211)和P7(-8～ +211)。所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證其正確性。

表1 擴(kuò)增Bmlark基因啟動(dòng)子區(qū)各序列片段的PCR引物Table 1 PCR primers for amplifying each sequence fragment in the promoter region of Bmlark gene

1.2.2 家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ對(duì)pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行酶切，并切膠回收純化。家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物與線性化的pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)條件參照vazyme ClonExpress?ⅡOne StepCloning Kit說明書。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐青霉素抗性平板培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。挑單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行目的片段的PCR鑒定，將大小正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pLP1(-1 232～ +221)、pLP2(-529～ +211)、pLP3(-220～ +211)、pLP4(-124～ +211)、pLP5(-92～ +211)、pLP6(-66～ +211)和pLP7(-8～ +211)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

用含有10%胎牛血清的Grace昆蟲培養(yǎng)基，于27℃～28℃恒溫培養(yǎng)中貼壁培養(yǎng)家蠶Bm12細(xì)胞。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板里加入105mL的細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞密度80%～90%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取0.1 μg各Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒、0.01 μg內(nèi)參質(zhì)粒SV40、轉(zhuǎn)染試劑0.3 μL，加入25 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中充分混勻，室溫靜置15～20 min，然后轉(zhuǎn)染Bm12細(xì)胞。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置pGL3-Basic空載體轉(zhuǎn)染組作為陰性對(duì)照。

1.2.4啟動(dòng)子活性的螢光素酶測(cè)定

螢光素酶活性測(cè)定參照上海翊圣生物科技有限公司生產(chǎn)的雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加200 μL裂解液，4℃搖床輕微震蕩5 min，充分裂解細(xì)胞，10 000 rpm離心1 min，取20 μL上清和100 μL螢光素酶底物加入1.5 mL離心管中混勻，用Promega Glo Max發(fā)光檢測(cè)儀測(cè)定螢光素酶活性M1后，加入100 μL反應(yīng)終止液，繼續(xù)測(cè)定海參螢光素酶發(fā)光值M2，M1/M2的置即為螢光素酶的相對(duì)活性(Relative Luciferase Activity，RLA)，同一轉(zhuǎn)染試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5Bm12細(xì)胞核蛋白提取步驟

貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)密度至90%～100%后，將預(yù)冷的PBS直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中清洗細(xì)胞兩次，棄上清。每瓶加入360 μL胞漿提取緩沖液，均勻后冰上靜置5 min。用吸頭吹打幾次后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 mL離心管中，渦旋大力震蕩15 s后，4℃最高速離心5 min；棄上清，用0.5 mL預(yù)冷PBS重懸沉淀，10 000 rpm離心5 min后棄上清，每樣品加入150 μL核提取緩沖液，渦旋大力震蕩15 s，冰上孵育1 min，重復(fù)4次；迅速將核提取物轉(zhuǎn)入到預(yù)冷的離心管套管中，14 000 rpm，離心30 s，收集沉淀的核蛋白，保存于-80℃中。

1.2.6電泳遷移率轉(zhuǎn)移法(DNA mobility shift assay，EMSA)檢測(cè)

制備6%非變性聚丙烯酰胺凝膠。用0.5×TBE緩沖液，100 V電壓、冰浴中預(yù)電泳1 h。DNA-蛋白結(jié)合反應(yīng) ：通過北京擎科新業(yè)生物生物技術(shù)有限公司合成Bmlark啟動(dòng)子32 bp(-124～-92)的寡核苷酸序列作為探針并進(jìn)行生物素標(biāo)記，同時(shí)合成未生物素標(biāo)記的的競(jìng)爭(zhēng)探針，探針序列For：5′-AATAATGTCGCCAAATATTATGCCGA AAAATAA-3′，Rev：5′-TTATTTTTCGGCATAATAT TTGGCGACATTATT-3′。DNA-蛋白結(jié)合反應(yīng)混合液包括探針2 μL，核蛋白8 μL，2 μL 10×結(jié)合緩沖液，1 μL 50%甘油，1 μL 1% NP-40，1μL poly(dI-dC)封閉核蛋白非特異性結(jié)合，以及促進(jìn)DNA和核蛋白結(jié)合的MgCl2、KCl和EDTA。上述混合液室溫28℃放置20 min，作為對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行單純探針反應(yīng)和特異性競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)(在結(jié)合反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上分別50倍和100倍未標(biāo)記的探針)。上樣后，于0.5×TBE緩沖液，100 V電壓進(jìn)行電泳2 h。電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，將膜取出，置于玻璃皿中，溴酚藍(lán)面向上，將膜放置于紫外燈(波長(zhǎng)254 nm)下進(jìn)行交聯(lián)0.8 min。根據(jù)Thermo LightShift?Chemiluminescent EMSA Kit的方法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)生物素標(biāo)記的DNA探針與蛋白結(jié)合的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism 7軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和展示，螢光素酶的相對(duì)活性以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，對(duì)各啟動(dòng)子片段相對(duì)螢光素酶活性采用t檢驗(yàn)，*P<0.05表示最低的顯著意義，**P<0.01表示中等程度的顯著意義,***P<0.001表示最高的顯著意義，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmlark基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)

以家蠶基因組DNA為模板，上游引物Bmlark-F(-1 232)和下游引物Bmlark-R (+211)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一約1.4 Kb的PCR產(chǎn)物P1(-1 232～ +211)(圖1-A)。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，表明該P(yáng)CR產(chǎn)物為Bmlark啟動(dòng)子目的片段。

圖1 家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the luciferase reporter plasmid of the Bmlark gene promoter in silkworm注：A，家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子序列P1(-1 232～ +211)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析；M，DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；B，利用同源重組構(gòu)建家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒示意圖；C，家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pLP1(-1 232～ +211)的Xho Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定分析；M，DL5000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。Note: A, Gel electrophoresis analysis of the PCR amplified product of the promoter sequence P1 (-1 232～ +211) of the silkworm Bmlark gene; M, DL2000 DNA standard molecular weight; B, Schematic diagram of constructing the luciferase reporter plasmid of the silkworm Bmlark gene promoter by homologous recombination; C, Xho Ⅰ and Hind Ⅲ double enzyme digestion analysis of the luciferase reporter plasmid pLP1 (-1 232～ +211) of the Bmlark gene promoter; M, DL5000 DNA standard molecular weight.

上述PCR產(chǎn)物的兩端設(shè)計(jì)有與pGL3-Basic螢光素酶報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)同源的接頭序列。利用XhoⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切使pGL3-Basic載體線性化，隨后將Bmlark基因啟動(dòng)子片段P1(-1 232～ +211)，通過同源重組的方式克隆至pGL3-Basic質(zhì)粒中(圖1-B)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞后提取質(zhì)粒后雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該1 475bp目的片段已重組到pGL3-Basic中。測(cè)序結(jié)果顯示，插入序列完全正確，表明含家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子片段的螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pLP1(-1 232～ +211)構(gòu)建成功。

為驗(yàn)證克隆得到的家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子是否具有轉(zhuǎn)錄活性，將報(bào)告質(zhì)粒pLP1和pGL3-Basic空載體分別與SV40海腎螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒(內(nèi)參)共轉(zhuǎn)染家蠶Bm12細(xì)胞。螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)pLP1細(xì)胞中的螢光素酶活性比pGL3-Basic陰性對(duì)照增加約461倍(P=0.0002，圖2)，表明家蠶Bmlark基因的-1 232～ +211 bp區(qū)域具有啟動(dòng)子活性。

圖2 家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pLP1(-1 232～ +211)轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)Fig.2 Detection of the transcriptional activity of the Bmlark gene promoter luciferase reporter plasmid pLP1 (-1 232～ +211)注：螢光素酶的相對(duì)活性以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，n=3，***P<0.001。Note: Relative activity of luciferase was expressed as "mean±standard deviation", n=3, ***P<0.001.

2.2 Bmlark基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性區(qū)的鑒定

為進(jìn)一步定位Bmlark基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性區(qū)，以pLP1(-1 232～ +211)為模板，采用移步截短法設(shè)計(jì)引物對(duì)pLP1(-1 232～ +211)進(jìn)行系列截短擴(kuò)增，得到6個(gè)大小與預(yù)期一致的截短片段：P2(-529～ +211)、P3(-220～ +211)、P4(-124～ +211)、P5(-92～ +211)、P6(-66～ +211)、P7(-8～ +211)(圖3-A)，測(cè)序結(jié)果顯示序列正確。經(jīng)同源重組分別把這些片段插入到pGL3-Basic載體。對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖3-B)和測(cè)序，結(jié)果顯示插入序列完全正確，證明系列截短的Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒pLP2(-529～ +211)、pLP3(-220～ +211)、pLP4(-124～ +211)、pLP5(-92～ +211)、pLP6(-66～ +211)、pLP7(-8～ +211)構(gòu)建成功。

圖3 系列截短的Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.3 Construction of a series of truncated Bmlark gene promoter luciferase reporter plasmids注：A，系列截短的家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳；M，DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；B，系列截短的家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒XhoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定；M，DL5000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。Note: A, Gel electrophoresis of PCR amplified products of a series of truncated silkworm Bmlark gene promoter sequence; M, DL2000 DNA standard molecular weight; B, A series of truncated silkworm Bmlark gene promoter luciferase reporter plasmids XhoⅠ and Hind Ⅲ double restriction digestion identification; M, DL5000 DNA standard molecular weight.

將不同片段長(zhǎng)度的重組質(zhì)粒與內(nèi)參SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Bm12細(xì)胞，以pGL3-Basic作為陰性對(duì)照同步轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行雙螢光素酶檢測(cè)。質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP3、pLP4、pLP5、pLP6的螢光素酶表達(dá)水平均較pGL3-Basic顯著增加。其中，pLP4的螢光素酶表達(dá)最高，較pLP3升高了約13倍(P=0.0004)，暗示在-220～ -124 bp啟動(dòng)子區(qū)域可能存在轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn)或負(fù)向調(diào)控元件。pLP5的螢光素酶表達(dá)水平較pLP4下降低了約5倍(P=0.0007)，pLP6的螢光素酶表達(dá)水平較pLP5又下降了約6倍(P=0.0007)，暗示在-124～ -92 bp可能存在轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)或正調(diào)控元件(圖4)。

圖4 系列截短的家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)Fig.4 Transcriptional activity detection of a series of truncated silkworm Bmlark gene promoter luciferase reporter plasmids注：螢光素酶的相對(duì)活性以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，n=3，***P<0.001。Note: Relative activity of luciferase was expressed as “mean±standard deviation”, n=3, ***P<0.001.

2.3 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的EMSA分析

為了鑒定是否有核蛋白結(jié)合到該-124/-92 bp潛在的轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)或正調(diào)控元件序列，從Bm12細(xì)胞中提取的核蛋白后，以生物素標(biāo)記的該片段(32 bp)探針(For：5′-AATAATGTCGC CAAATATTATGCCGAAAAATAA-3′，Rev：5′-TTAT TTTTCGGCATAATATTTGGCGACATTATT-3′)進(jìn)行EMSA分析。結(jié)果顯示有4個(gè)核蛋白與探針結(jié)合(圖5)。當(dāng)在反應(yīng)體系中加入競(jìng)爭(zhēng)探針(非標(biāo)記的同樣探針)的濃度增加時(shí)，蛋白1、蛋白2、蛋白4的結(jié)合信號(hào)消失，蛋白3結(jié)合信號(hào)在逐漸減弱但不能被探針完全競(jìng)爭(zhēng)。結(jié)果表明，這些蛋白與探針的結(jié)合是特異性的。

圖5 電泳遷移率轉(zhuǎn)移法(EMSA)分析Bmlark基因啟動(dòng)子的-124～ -92 bp序列探針與Bm12細(xì)胞核蛋白的結(jié)合Fig.5 Electrophoretic mobility transfer method (EMSA)analysis of Bmlark gene promoter -124～ -92 bp sequence probe binding to Bm12 nuclear protein注：用生物素標(biāo)記Bmlark基因啟動(dòng)子的-124～ -92 bp序列探針，未標(biāo)記探針作為冷探針。Note: -124～ -92 bp sequence probe of Bmlark gene promoter was labeled with biotin, and the unlabeled probe was used as a cold probe.

將蛋白1～4切膠，并分別進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜結(jié)果顯示protein 1、protein 2、protein 3、protein 4分別有177、124、104、95個(gè)候選蛋白(見S1)，將獲得的蛋白通過Omic Share網(wǎng)站及Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)分析獲得GO富集分析，這些蛋白主要與生殖過程、新陳代謝、生物調(diào)節(jié)相關(guān)，具有核酸及蛋白結(jié)合和催化等活性(圖6)。根據(jù)蛋白分子量，是否細(xì)胞核蛋白以及是否具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域等因素，鑒定出4個(gè)可能與該-124～-92 bp序列結(jié)合的蛋白，分別為TAF7(NC_051358.1)，Ets transcription factor(NC_051374.1)，protein abrupt isoform X1(NW_021011484.1)和forkhead box protein N3(XM_004928387.4)(表2)。今后將對(duì)這4個(gè)候選蛋白或轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖6 GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis注：將質(zhì)譜分析獲得的共500個(gè)蛋白質(zhì)向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)term映射，選取蛋白質(zhì)顯著富集的GO term，通過GO顯著性分析能確定質(zhì)譜檢測(cè)到的蛋白質(zhì)行使的主要生物學(xué)功能。Note: Map a total of 500 proteins obtained by mass spectrometry to each term in the Gene Ontology database, selected GO terms that were significantly enriched in different proteins, and used GO significance analysis to determine the main biological functions of the proteins detected by mass spectrometry. Cellular process，細(xì)胞過程；Single-organism process，單個(gè)組織過程；Metabolic process，代謝過程；Biological regulation，生物調(diào)控；Regulation of biological process，生物過程調(diào)控；Cellular component organization or biogenesis，細(xì)胞組分組織或合成；Response to stimulus，刺激反應(yīng)；Localization，定位；Multicellular organismal process，多細(xì)胞生物過程；Developmental process，發(fā)育過程；Positive regulation of biological process，生物過程正調(diào)控；Negative regulation of biological process，生物過程負(fù)調(diào)控；Reproduction，生殖；Reproductive process，生殖過程；Multi-organism process，多組織過程；Signaling，信號(hào)發(fā)生；Locomotion，運(yùn)動(dòng)；Behavior，行為；Immune system process，免疫系統(tǒng)過程；Growth，生長(zhǎng)；Biological adhesion，生物附著；Rhythmic process，生物節(jié)律過程；Presynaptic process involved in synaptic transmission，突觸傳導(dǎo)中的突觸前過程；Cell，細(xì)胞；Cell part，細(xì)胞部分；Organelle，細(xì)胞器；Organelle part，細(xì)胞器部分；Macromolecular complex，高分子復(fù)合物；Membrane，膜；Membrane-enclosed lumen，有膜腔室；Membrane part，膜部分；Extracellular region，胞外區(qū)；synapse，突觸；Synapse part，突觸部分；Cell junction，細(xì)胞連接；Extracellular region part，胞外區(qū)部分；Supramolecular fiber，超分子纖維；Extracellular matrix，細(xì)胞外基質(zhì)；Extracellular matrix component，細(xì)胞外基質(zhì)部分；Binding，結(jié)合；Catalytic activity，催化活性；Transporter activity，轉(zhuǎn)運(yùn)活性；Transcription factor activity，轉(zhuǎn)錄因子活性；Protein binding，蛋白結(jié)合；Molecular transducer activity，分子傳感器活性；Nuclei acid binding transcription factor activity，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄分子活性；Structural molecule activity，結(jié)構(gòu)分子活性；Electron carrier activity，電子攜帶活性；Molecular function regulator，分子功能調(diào)控；Signal transducer activity，信號(hào)傳導(dǎo)活性；Protein tag，蛋白標(biāo)簽；Translation regulator activity，翻譯調(diào)控活性。

表2 候選4個(gè)蛋白的相關(guān)信息Table 2 Information about the 4 candidate proteins

3 結(jié)論與討論

有研究發(fā)現(xiàn)，Bmlark是晝夜節(jié)律中輸出通路的重要組成部分，對(duì)胚胎發(fā)育有著極其重要的作用，參于神經(jīng)元發(fā)育和功能(Sundrametal., 2012)，其表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，但對(duì)于Bmlark的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究尚無報(bào)道。本研究擬通過尋找Bmlark基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及結(jié)合蛋白，探索Bmlark基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

利用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定基因啟動(dòng)子及調(diào)控元件，具有檢測(cè)快、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果確切等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用該方法，本研究對(duì)家蠶Bmlark基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了克隆并構(gòu)建了家蠶Bmlark基因螢光素酶報(bào)告基因pLP1。與作為內(nèi)參的SV40共同轉(zhuǎn)染Bm12細(xì)胞后，確定家蠶Bmlark基因的-1 232～ +211 bp區(qū)域具有啟動(dòng)子活性，并進(jìn)一步通過截短試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在-124～ -92 bp啟動(dòng)子區(qū)域可能存在正向調(diào)控元件，可增強(qiáng)Bmlark基因的啟動(dòng)子活性。而在區(qū)域-220～ -124 bp可能存在轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn)或負(fù)調(diào)控元件。這些結(jié)果表明，Bmlark基因的轉(zhuǎn)錄可能同時(shí)受到正和負(fù)的協(xié)同調(diào)控。經(jīng)Jaspar在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)，區(qū)域-124～ -92 bp包含轉(zhuǎn)錄因子Cad、Dbx、Ade-B等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，區(qū)域-220～ -124 bp包含轉(zhuǎn)錄因子Su(Hw)、Br、H2.0等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，但預(yù)測(cè)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子與EMSA獲取的轉(zhuǎn)錄因子沒有重合。

為了找到與-124～ -92 bp區(qū)域結(jié)合的調(diào)控蛋白，利用Bm12中提取的核蛋白進(jìn)行EMSA分析，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)蛋白結(jié)合條帶protein1、protein2、protein3、protein4。經(jīng)過甄別分析后，篩選出TAF7、Ets transcription factor、protein abrupt isoform X1、forkhead box protein N3等4個(gè)蛋白最有可能與該調(diào)控區(qū)結(jié)合，參與對(duì)Bmlark基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。TAF7在RNA聚合酶II中可以通過結(jié)合TAF1來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性(Gegonneetal., 2008)，是轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的流量控制器(Gegonneetal., 2013)。但也有研究指出，TAF7也可以作為一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄因子起作用(Devaiahetal., 2010)。TAF7對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要，是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，缺失TAF7會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，TAF7在人類體內(nèi)積極參與調(diào)節(jié)MHC I類基因的轉(zhuǎn)錄(Gegonneetal., 2012)。Ets transcription factor具有RNA聚合酶II順式調(diào)節(jié)區(qū)序列特異的DNA結(jié)合活性，控制細(xì)胞周期、邊界卵泡細(xì)胞遷移等過程，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、氣管和眼睛的發(fā)育至關(guān)重要，參與表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體等信號(hào)通路(Poon and Kim, 2017; Sizemore and Pitarresi, 2017)。Protein abrupt isoform X1與蛻皮激素tai結(jié)合時(shí)會(huì)負(fù)調(diào)控蛻皮激素的信號(hào)傳導(dǎo)。它調(diào)節(jié)器官和多種組織形態(tài)發(fā)生，介導(dǎo)神經(jīng)元分化以及細(xì)胞遷移(Julieetal., 2011; Turkeletal., 2013; Turkeletal., 2015)。Forkhead box protein N3具有RNA聚合酶II順式調(diào)節(jié)區(qū)序列特異性DNA結(jié)合活性(Rogersetal., 2019)，參與器官形態(tài)發(fā)生、唾液腺形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)控以及碳水化合物和脂質(zhì)代謝的發(fā)育(Kongetal., 2019)。雖然從蛋白的結(jié)構(gòu)及EMSA分析結(jié)果來看，這些蛋白有可能與這個(gè)啟動(dòng)子片段結(jié)合，但直接證據(jù)仍需要通過獲得這些蛋白后，再通過EMSA實(shí)驗(yàn)和其他方法加以驗(yàn)證。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了家蠶Bmlark基因啟動(dòng)子雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)-124～-92 bp區(qū)域可能存在轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)或正調(diào)控元件，-220～ -124 bp可能存在轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合位點(diǎn)或負(fù)調(diào)控元件,并篩選出了可能結(jié)合在-124～ -92 bp正調(diào)控區(qū)域的蛋白。研究為進(jìn)一步深入研究Bmlark基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了線索。