陳燕南，范 成，張 鋒，朱朝東，陳 軍*

(1. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2. 河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

甲螨(oribatid mites)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門Arthropoda蛛形綱Arachnida蜱螨亞綱Acari疥螨目Sarcoptiformes甲螨亞目Oribatida，其體型微小(體長(zhǎng)多為0.1～1 mm)，形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類眾多，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并記錄的甲螨達(dá)11 000種以上，估計(jì)實(shí)際種數(shù)超過50萬種(Norton and Behan-Pelletier, 2009)。甲螨多棲息于土壤腐殖質(zhì)中，主要為菌食性和腐食性，在土壤腐殖質(zhì)的分解過程中發(fā)揮著重要作用，是一類重要的土壤動(dòng)物。

由于甲螨種類眾多、個(gè)體微小，某些種類形態(tài)結(jié)構(gòu)還存在種內(nèi)變異現(xiàn)象，因而僅僅依靠其形態(tài)特征有時(shí)難以準(zhǔn)確鑒定物種和分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(Navajas and Fenton, 2000)。20世紀(jì)分子生物學(xué)的革命性變化，尤其是在80年代中期聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)的產(chǎn)生，促進(jìn)了分子生物學(xué)在物種鑒定與進(jìn)化研究方面的應(yīng)用(Cruickshank, 2010)。進(jìn)入21世紀(jì)以來，分子分類技術(shù)(Tautzetal., 2003)和DNA條形碼技術(shù)(Hebertetal., 2003a)等新研究手段更是極大地推動(dòng)了分子分類學(xué)在生物多樣性研究中的廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行上述相關(guān)研究時(shí)，往往首先需要提取生物的DNA。但是，由于體型微小，體壁高度硬化，從甲螨個(gè)體提取DNA而又不損傷其外部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征非常困難，從而使得分子分類學(xué)在甲螨多樣性研究中尚未得到很好應(yīng)用。

在其它螨類研究中，往往可以從同一物種中挑選出多個(gè)個(gè)體，將這些個(gè)體徹底粉碎研磨然后進(jìn)行DNA提取，便可獲得足夠的DNA。但這種方法應(yīng)用在甲螨研究中面臨著極大的障礙：甲螨物種眾多，從一號(hào)土樣中分離出的甲螨一般不止一種；形態(tài)特征多樣且不易觀察；大多數(shù)種類體表高度骨化，依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行物種鑒定時(shí)，必須對(duì)標(biāo)本進(jìn)行透明(一般為浸泡在乳酸中一周至一個(gè)月時(shí)間)后在顯微鏡下觀察。經(jīng)過這些步驟處理后的標(biāo)本便很難再從中提取DNA。為保證分子數(shù)據(jù)與形態(tài)鑒定所對(duì)應(yīng)標(biāo)本的一致性，需要首先提取甲螨的DNA，并盡可能保留其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，然后再進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)物種鑒定(Rowleyetal., 2007)。

為解決這些問題，近年來有不少學(xué)者曾嘗試探討過保存憑證標(biāo)本的無損傷DNA提取技術(shù)。高艷等研究并改進(jìn)了小型節(jié)肢動(dòng)物無形態(tài)損傷的DNA提取方法(高艷和卜云, 2014)；單振菊等也曾研究過一種具厚幾丁質(zhì)外殼微小節(jié)肢動(dòng)物無損傷DNA提取方法(單振菊等, 2017)。但這些方法在甲螨中的應(yīng)用效果并不是很理想。國(guó)外學(xué)者Ota等(2011)、Ahaniazad等(2018)雖然針對(duì)甲螨無損傷DNA提取方法進(jìn)行過探討，并取得了一定的進(jìn)步，但Ota等的方法只在某些甲螨類群(卷甲螨科Phthiracaridae、洼甲螨科Camisiidae和長(zhǎng)單翼甲螨科Protoribatidae)中可以提取出足夠的DNA，不能在所有的甲螨DNA提取中取得良好的效果。Ahaniazad等提供的方法需要自己配制試劑，這與應(yīng)用商品化的DNA提取試劑盒相比將會(huì)更加耗時(shí)，特別是當(dāng)樣本量非常多時(shí)，顯然會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間，而且自己配制試劑進(jìn)行DNA提取也不容易保證DNA質(zhì)量的穩(wěn)定性。因此，非常有必要在無形態(tài)損傷DNA提取方面繼續(xù)改良技術(shù)。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合了試劑盒DNA提取法，提出一套針對(duì)甲螨無形態(tài)損傷的高效DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1甲螨的獲得

在北京市奧林匹克森林公園(N40°0′46.29″, E116°22′50.30″)柏樹林下采集土壤樣本，將土樣放在布氏漏斗(Berlese-Tullgren funnel)中，自然風(fēng)干120 h，并在布氏漏斗底部放一個(gè)盛有30 mL無水乙醇的200 mL燒杯用來收集甲螨標(biāo)本，在收集過程中及時(shí)補(bǔ)充無水乙醇。

將收集到的甲螨標(biāo)本在體視顯微鏡下查看，挑選數(shù)頭形態(tài)特征相同的個(gè)體，通過清洗、透明、制作臨時(shí)玻片后在系統(tǒng)顯微鏡下觀察形態(tài)特征，經(jīng)鑒定后均為大翼甲螨科Galumnidae大翼甲螨屬Galumna顯大翼甲螨中華亞種Galumnaobviussinensis(Jacot, 1922)。然后在其它土樣分離得到的甲螨中挑選該種標(biāo)本，用于后續(xù)研究。

1.1.2試劑

QIAGEN組織和血液DNA提取試劑盒。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取

向6個(gè)滅菌的1.5 mL離心管中各放入1頭甲螨樣本，再向6個(gè)離心管中各加入180 μL Buffer ATL，之后再分別加20 μL蛋白酶K，混勻后，55℃水浴24 h，次日取出離心管，分別向每個(gè)離心管中加入200 μL Buffer AL，然后70℃水浴10 min。再從水浴鍋里取出離心管，向離心管里加入200 μL無水乙醇。將離心管內(nèi)的液體充分混勻之后，將離心管內(nèi)所有的液體全部轉(zhuǎn)移到吸附柱內(nèi)，并將離心管內(nèi)存留的甲螨標(biāo)本用蒸餾水沖洗干凈后放入80%乙醇中保存。將吸附柱放進(jìn)離心機(jī)中8 000 rpm離心1 min，換上新的收集管，向吸附柱內(nèi)加入500 μL的Buffer AW1，再將吸附柱放進(jìn)離心機(jī)中8 000 rpm離心1 min，再換上新的收集管，向吸附柱內(nèi)加入500 μL Buffer AW2，此時(shí)將吸附柱放進(jìn)離心機(jī)中14 000 rpm離心4 min。最后換上滅過菌的離心管，向吸附柱內(nèi)加入50μL Buffer AE，將離心管靜止1 h后，再將其放進(jìn)離心機(jī)中8 000 rpm離心2 min。在-20℃保存DNA模板。

1.2.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系：正反引物各1 μL，PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 3 μL，DNA模板5 μL。擴(kuò)增引物如下：正向引物L(fēng)co1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′；反向引物Hco2198: 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′；引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：96℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，46℃退火30 s，72℃延伸1 min，運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5 min。

1.2.3PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)

每個(gè)樣本取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察。

1.2.4測(cè)序及比對(duì)

將電泳分析有目的條帶的PCR產(chǎn)物原液送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行常規(guī)純化雙向測(cè)序。為驗(yàn)證所提取的DNA確實(shí)是來自于甲螨的DNA，將測(cè)序所得結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，以確定PCR擴(kuò)增序列以及DNA模板是否正確。

1.2.5臨時(shí)玻片標(biāo)本的制作

將提取完DNA之后保留下來的甲螨標(biāo)本放在凹形載玻片上，滴上少許乳酸，稍微調(diào)整甲螨肢體的姿勢(shì)使其便于觀察；輕輕蓋上蓋玻片，用吸水紙?jiān)谳d玻片上吸收多余的乳酸；稍等片刻，在顯微鏡下觀察并拍照。拍照后將甲螨標(biāo)本放入80%乙醇保存。

1.2.6掃描電鏡拍照

將提取完DNA之后保留下來的甲螨標(biāo)本放在脫水硅膠中脫水24 h，脫水后的甲螨噴金后放入掃描電鏡下拍照，以觀察其形態(tài)特征是否完好。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA序列分析

將測(cè)序所得的結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)提取的DNA序列與甲螨亞目中的大翼甲螨科Galumnidae同源性最高，驗(yàn)證了所提取的DNA是來自大翼甲螨科。但由于GenBank數(shù)據(jù)庫中缺少顯大翼甲螨中華亞種Galumnaobviussinensis(Jacot, 1922)的DNA序列數(shù)據(jù)，所以造成與本次實(shí)驗(yàn)提取的DNA序列的最高相似度也只有86%左右，并不能達(dá)到精確的物種水平的鑒定。

2.2 甲螨標(biāo)本的形態(tài)對(duì)比

將未進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)的甲螨標(biāo)本與經(jīng)過本次DNA提取實(shí)驗(yàn)的甲螨標(biāo)本分別制作成臨時(shí)玻片在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，并進(jìn)行掃描電鏡拍照。對(duì)比結(jié)果顯示：提取過DNA的甲螨標(biāo)本形態(tài)保存完好，并沒有發(fā)生明顯的形態(tài)改變(圖1)。其重要的分類學(xué)特征如：感器(bothridial setae)、梁毛(lamellar setae)、吻毛(rostral setae)、前背板(prodorsum)、后背板(notogaster)、翅形體(pteromorph)、下顎體(subcapitulum)、生殖板(genital plate)、肛板(annal plate)、步足(leg)等均保存完好(圖1, 圖2)，可以作為憑證標(biāo)本長(zhǎng)期保存。

圖1 提取DNA的甲螨標(biāo)本與未提取DNA的甲螨標(biāo)本掃描電鏡對(duì)比照片F(xiàn)ig.1 SEM photographs of oribatid mites with DNA extraction and without DNA extraction注：A，B，背面觀；C，D，腹面觀；A，C為未提取過DNA的甲螨標(biāo)本；B，D為提取DNA的甲螨標(biāo)本。Note: A, B, Dorsal view; C, D, Ventral view; A, C, Specimen without DNA extraction; B, D, Specimen after being DNA extracted.

圖2 經(jīng)過DNA提取之后的甲螨標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM photographs of morphological characters after being DNA extracted in oribatid mites注：ad，肛側(cè)毛；ag，側(cè)殖毛；an，肛毛；AP，肛板；bs，感器；GP，生殖板；in，梁間毛；L，步足；le，梁毛；PTM，翅形體；ro，吻毛。Note: ad, Adanal setae; ag, Aggenital; an, Anal setae; AP, Annal plate; bs, Bothridial setae; GP, Genital plate; in, Interlamellar setae; L, Leg; le, Lamellar setae; PTM, Pteromorph; ro, Rostral setae.

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)所選取的顯大翼甲螨中華亞種個(gè)體相對(duì)較大(體長(zhǎng)725～775 μm，寬525～550 μm)，使用此無損DNA提取方法，可以只用一頭標(biāo)本就能提取出足夠的DNA。對(duì)于其它體型更小的甲螨，可以適當(dāng)增加甲螨的個(gè)數(shù)，以保證能夠提取出足夠的DNA用于后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

隨著DNA條形碼和分子分類學(xué)等新概念的提出，利用基因序列輔助鑒定物種已經(jīng)越來越普遍，許多分類學(xué)者都在積極地參與構(gòu)建包含不同物種形態(tài)特征與分子數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(Hebertetal., 2003b)。當(dāng)前，雖然在各大數(shù)據(jù)庫中已收錄了一些甲螨物種的DNA序列數(shù)據(jù)，但是很多的DNA序列都沒有憑證標(biāo)本與之對(duì)應(yīng)，這可能是由于很多情況下在進(jìn)行DNA提取實(shí)驗(yàn)時(shí)已經(jīng)將甲螨標(biāo)本破壞了，只有一些在DNA提取之前借助顯微鏡拍攝的照片可供查閱、參考和比較。然而甲螨由于種類眾多、形態(tài)特征多樣、體型微小等因素影響，僅僅根據(jù)這些照片一般很難對(duì)這些標(biāo)本的物種鑒定是否正確進(jìn)行核對(duì)，與之對(duì)應(yīng)的分子數(shù)據(jù)的可靠性無疑會(huì)大打折扣，這在一定程度上也限制了甲螨分子生物學(xué)的相關(guān)研究。

目前對(duì)于甲螨的分子分類學(xué)工作者們而言，一個(gè)較大的難點(diǎn)就是如何將DNA分子數(shù)據(jù)與甲螨的形態(tài)特征數(shù)據(jù)準(zhǔn)確無誤地對(duì)應(yīng)起來。在其它體型較大的動(dòng)物中，通常采取的做法是取標(biāo)本個(gè)體的一小部分來進(jìn)行DNA提取，其余的部分作為憑證標(biāo)本進(jìn)行保存(Starks and Peters, 2002)。甲螨個(gè)體微小，很難只取一小部分進(jìn)行DNA提取就能獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需足夠的DNA，況且甲螨一般具有較堅(jiān)硬的外殼，在進(jìn)行切取的時(shí)候很難保證不損傷重要的形態(tài)特征，實(shí)際操作中很容易造成整個(gè)個(gè)體都被破壞，從而導(dǎo)致后續(xù)無法依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行物種鑒定。而使用本研究提供的甲螨DNA提取方法，既能獲得足夠的DNA，還可以相當(dāng)完好的保存憑證標(biāo)本，有助于開展甲螨分子生物學(xué)研究。

致謝：感謝蒙皓博士在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中給予的指導(dǎo)，感謝張魁艷老師、李榮同學(xué)在掃描電鏡觀察與拍照過程中給予的幫助。