劉 杰，李明濤，陳順安，姚 俊，石 雷，陳曉鳴

(中國林業(yè)科學研究院高原林業(yè)研究所，國家林業(yè)局資源昆蟲培育與利用重點實驗室, 昆明 650224)

昆蟲的嗅覺在種內(nèi)通訊、探測捕食者、尋找寄主、躲避天敵及交配、取食、產(chǎn)卵等行為活動中發(fā)揮重要作用(Liuetal., 2012; Lietal., 2018a; Lietal., 2018b; Zengetal., 2018; Duanetal., 2019; Muhammadetal., 2020)。與視覺、聽覺等常用交流方式相比，嗅覺、味覺等化學通訊也被多數(shù)生物利用(Wyatt, 2003; 2009; Stéphanieetal., 2014)。通常，揮發(fā)物作為嗅覺信號能傳達潛在配偶質(zhì)量、身份等多種信息，包括生理狀態(tài)(Rantalaetal., 2003)、年齡(Thomas, 2011)、交配狀態(tài)(Nieberdingetal., 2012)和性別差異(Michelleetal., 2018)等，多用于評估配偶吸引力和物種識別(Wyatt, 2003; Johansson and Jones, 2007; Anderssonetal., 2007)。

鱗翅目昆蟲常借助蟲體揮發(fā)物提供的嗅覺信號進行配偶選擇和雌雄個體識別，如雌成蟲產(chǎn)生性信息素遠距離吸引雄性(Millar, 2000; Andoetal., 2004; Johansson and Jones, 2007; Millaretal., 2010)。蝴蝶在求偶過程中通過蟲體揮發(fā)物進行同性和異性的識別(Pliske, 1975a; Silberglied and Taylor, 1978; Costanzo and Monteiro, 2007; 李承哲, 2017)，促進雌蝶對雄蝶的接受(Pliske, 1975a; Nishidaetal., 1996; Mellstr?m and Wiklund, 2009)，區(qū)別雌蝶的交配狀態(tài)(Vane and Boppré, 1993; Thomas, 2011)及作為種間生殖隔離機制(Pliske, 1975a; Silberglied and Taylor, 1978; Grulaetal., 1980)。但是，在蝴蝶研究中，關(guān)于蟲體揮發(fā)物在蝶類物種識別中的作用及何種揮發(fā)物參與了物種識別報道相對較少。

美鳳蝶Papiliomemnon隸屬于鱗翅目Lepidoptera鳳蝶科Papilionidae鳳蝶屬Papilio美鳳蝶亞屬Menelaides，羽化3 d即可交配(作者觀察)，人工飼養(yǎng)時可用蜂蜜水補充營養(yǎng)(陳曉鳴等, 2008)。美鳳蝶是著名的觀賞昆蟲，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，是目前人工養(yǎng)殖及市場供應(yīng)的主要蝴蝶品種，特別是在活體蝴蝶觀賞園中應(yīng)用較多。美鳳蝶在國內(nèi)分布較廣，主要分布于南方各地，在國外廣布于日本、東南亞和印度等地。迄今為止，國內(nèi)外還沒有對美鳳蝶蟲體揮發(fā)物及其求偶時嗅覺信息利用的研究，關(guān)于化學信息在美鳳蝶物種識別中的作用及何種化合物參與美鳳蝶物種識別未見報道，探索美鳳蝶雌雄蝶羽化成蟲不同時期揮發(fā)性成分及變化規(guī)律，揭示嗅覺信息在美鳳蝶求偶過程中所扮演的角色及探索美鳳蝶求偶的嗅覺行為機制，為篩選出對美鳳蝶具有生物活性的引誘劑提供基礎(chǔ)，同時為開展蝴蝶繁育及景觀營造提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地點位于云南省昆明市盤龍區(qū)白龍寺，中國林業(yè)科學研究院高原林業(yè)研究所(102°45′E，25°03′N)，當?shù)睾０? 930 m，年平均氣溫15℃～16℃，年平均降雨量900～1 000 mm，屬于亞熱帶高原季風氣候。蝴蝶交配時及交配后，行為學觀察試驗在一個長、寬和高度分別為(8 m× 4 m× 5 m)的網(wǎng)室內(nèi)進行。網(wǎng)室內(nèi)透光良好，光照均勻。

1.2 試驗材料

試驗用美鳳蝶P.memnon蛹來自于中國林業(yè)科學研究院高原林業(yè)研究所元江試驗站人工飼養(yǎng)的種群，美鳳蝶幼蟲用新鮮柑橘Citrusreticulata葉喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為光周期L ∶D=13 h ∶11 h，溫度26℃±2℃，相對濕度50%～70%。蝴蝶成蟲飼養(yǎng)在人工氣候室，供試蝴蝶均為羽化后的健康成蟲。

1.3 蟲體揮發(fā)物檢測時期

將羽化成蟲按交配前、交配時、交配后1 d和交配后3 d分組，測試4個不同時期蟲體揮發(fā)物。

1.3.1交配前蟲體揮發(fā)物的檢測

雌雄無干擾組：雌雄蝶羽化后單放，用羽化后2 h個體作為檢測對象進行揮發(fā)物的檢測。

1.3.2交配時蟲體揮發(fā)物的檢測

雌雄無干擾組：雌雄蝶羽化后單放，用羽化后3 d未交配個體作為檢測對象進行揮發(fā)物的檢測(觀察中發(fā)現(xiàn)美鳳蝶羽化后3 d開始交配)。

1.3.3交配后1 d蟲體揮發(fā)物的檢測

雌雄干擾組：雌雄蝶來自于網(wǎng)室大棚自然交配后的種群，雌雄蝶交配后1 d進行蟲體揮發(fā)物檢測。

1.3.4交配后3 d蟲體揮發(fā)物的檢測

雌雄干擾組：雌雄蝶來自于網(wǎng)室大棚自然交配后的種群，雌雄蝶交配后3 d進行蟲體揮發(fā)物檢測。

1.4 蟲體揮發(fā)物采集與檢測方法

利用固相微萃取(solid-phase micro extraction，SPME)方法吸附并采集蟲體揮發(fā)物：先將待測試雌、雄活蝶(2頭)分別放入廣口瓶(高10 cm，開口直徑3 cm，體積80 mL)，用“4號”LDPE材質(zhì)塑料膜將廣口瓶封口，將PDMS/DVB固相微萃取頭(65 μm，Supelco，Bellefonte，PA，USA)扎穿塑料并固定，吸附時間為1 h?？盏膹V口瓶作為空白對照。上述揮發(fā)物檢測重復3次。

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析蟲體揮發(fā)物：參考李承哲(2017)的方法略有改動。每次進樣前需將SPME萃取頭在GC進樣口老化(250℃，10 min)，采用TR-5MS色譜柱(內(nèi)徑：0.25 mm，厚度：0.25 μm，長度：30 m)，程序為40℃保持2 min，升溫到120℃保持2 min(4℃/min)，最后升到230℃保持5 min(5℃/min)，進樣口溫度為250℃，載氣He的氣壓為69 kPa。

揮發(fā)物定性方法：以美國國家標準技術(shù)研究所(National Institute of Standards and Technology，NIST，http://webbook.nist.gov/chemistry/)質(zhì)譜庫檢索為主，同時結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖；揮發(fā)物的定量計算：采用峰面積歸一化法，即計算樣品組分峰面積占總峰面積的百分比，得到相對含量。計算揮發(fā)性成分的保留指數(shù)，并與文獻值進行比對。保留指數(shù)(linear retention index，LRI或RI)計算公式如下：

LRI—保留指數(shù)；

tx—待測組分的保留時間，min；

tn—具有n個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，min；

tn+1—具有n+1個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配前蟲體揮發(fā)物的組成及相對含量

雌雄蝶羽化1 d分別檢測到14種和16種揮發(fā)物，共有的揮發(fā)物有14種，其中反-2-辛烯醛含量最高，雌蝶含量為59.88%，雄蝶含量為77.99%，其次是2-甲基烯丙醇，雌蝶含量為14.47%，雄蝶含量為8.42%。雄蝶特有的揮發(fā)物有2種，未檢測到雌蝶特有的揮發(fā)物(表1)。檢測到的揮發(fā)物主要包括烷烴類、芳香烴、醇類、醛類、酮類、脂類、萜類、酸類物質(zhì)和醌類9類，醛類和醇類含量最高，醛類物質(zhì)雌蝶含量為70.86%、醛類物質(zhì)雄蝶的含量為85.34%、醇類物質(zhì)雌蝶含量為14.62%、醇類物質(zhì)雄蝶含量為8.42%(表2)。

表1 美鳳蝶成蟲蟲體在羽化后不同時間揮發(fā)物種類相對含量Table 1 Relative contents of volatile compounds at different times after eclosion in the adults of Papilio memnon

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 交配時蟲體揮發(fā)物的組成及相對含量

雌雄蝶羽化3 d分別檢測到24種和21種揮發(fā)物，共有的揮發(fā)物有20種，其中反-2-辛烯醛含量最高，雌蝶含量為53.75%，雄蝶的含量為39.62%，其次是2-甲基烯丙醇和1-二十醇，雌蝶體內(nèi)2-甲基烯丙醇含量為9.36%，雄蝶體內(nèi)2-甲基烯丙醇的含量為11.04%，雌蝶體內(nèi)1-二十醇含量為10.46%，雄蝶體內(nèi)1-二十醇含量為21.13%。雌蝶特有的揮發(fā)物有4種，分別是1-苯基-1-丙炔(0.23%)、異辛酸(2.44%)、紫蘇醛(0.99%)、1-茚酮(0.66%)，雄蝶特有的揮發(fā)物β-石竹烯(0.16%)(表1)。檢測到的揮發(fā)物主要包括烷烴類、炔烴類、芳香烴、醇類、醛類、酮類、脂類、萜類、酸類和酚類10類，醛類和醇類含量最高，醛類物質(zhì)雌蝶含量為55.01%、醛類物質(zhì)雄蝶的含量為39.76%、醇類物質(zhì)雌蝶含量為21.53%、醇類物質(zhì)雄蝶含量為32.56%(表2)。

2.3 交配后1 d蟲體揮發(fā)物的組成及相對含量

雌雄蝶交配1 d均檢測到8種揮發(fā)物，共有的揮發(fā)物有5種，其中反式-2-壬烯酸含量最高，雌蝶含量為33.88%，雄蝶的含量為51.80%，其次是香豆素-3-羧酸乙酯，雌蝶含量為50.00%，雄蝶的含量為16.78%。雌蝶特有的揮發(fā)物有3種，分別是衣康酸(5.26%)、1-茚酮(1.65%)、正十四烷(1.51%)，雄蝶特有的揮發(fā)物有3種，分別是辛酸十六烷酯(12.01%)、3a-羥基-5b-雄甾烷-17-酮(0.53%)、26-二叔丁基對甲酚(0.05%)(表1)。檢測到的揮發(fā)物主要包括烷烴類、芳香類、醛類、酮類、脂類、酸類6類揮發(fā)物，酯類和酸類含量最高，其中酯類物質(zhì)雌蝶含量為52.32%、酯類物質(zhì)雄蝶含量為30.16%、酸類物質(zhì)雌蝶含量為39.14%、酸類物質(zhì)雄蝶含量為51.80%(表2)。

2.4 交配后3 d蟲體揮發(fā)物的組成及相對含量

雌雄蝶交配3 d分別檢測到14種和22種揮發(fā)物，共有的揮發(fā)物有8種，其中反式-2-壬烯酸含量最高，雌蝶含量為29.21%，雄蝶含量為4.17%，其次是衣康酸，雌蝶含量為8.79%，雄蝶含量為8.65%。雌蝶特有的揮發(fā)物有6種，分別是十三烷醇(2.70%)、5-甲基-2-(1-甲乙烯基)-4-己烯-1-醇(2.70%)、1，2，3，4-甲基苯(0.45%)、巴倫西亞橘烯(5.08%)、26-二甲基-2,4,6-辛三烯(0.58%)、二十四烷(17.48%)，而雄蝶特有的揮發(fā)物高達14種(表1)。檢測到的揮發(fā)物主要包括烷烴類、烯烴類、芳香類、醇類、酮類、脂類、萜類、酸類和酚類9類揮發(fā)物，酸類和醇類含量最高，雌蝶蟲體中酸類物質(zhì)含量為51.25%、雄蝶蟲體中酸類物質(zhì)含量為84.20%、雌蝶蟲體中醇類物質(zhì)含量為14.76%、雄蝶蟲體中醇類物質(zhì)含量為6.62%(表2)。

表2 美鳳蝶成蟲蟲體在羽化后不同時間揮發(fā)物歸類Table 2 Classification of volatile compounds at different times after eclosion in the adults of Papilio memnon

比較發(fā)現(xiàn)雌雄蝶羽化后共檢測出12類揮發(fā)物，其中芳香類、酯類、酸類3類在雌雄蝶羽化后均有出現(xiàn)(表2)。芳香類雖然一直存在但是相對含量一直較低，酯類在雌雄蝶交配后1 d達到最大值，酸類在雌雄蝶蟲體交配后3 d達到最大值。炔烴類僅在交配時雌蝶蟲體中檢測到，醌類僅在交配前雌雄中檢測到。雌蝶交配前后含量最多，揮發(fā)物有5類，分別是醇類、醛類、酯類、酸類及烷烴類，雄蝶交配前后含量最多，揮發(fā)物有4類，分別是醇類、醛類、酯類、酸類(表2)。

交配前雌雄蝶優(yōu)勢揮發(fā)物為醇類、醛類(圖1-A, B)。雌雄蝶蟲體揮發(fā)物中醇類含量在交配前及交配時隨羽化時間的增加而上升，交配后1 d消失，交配后3 d又呈現(xiàn)上升趨勢(圖1-A)。雌雄蝶蟲體揮發(fā)物中醛類含量隨羽化時間的增加而逐漸減少，雌蝶醛類揮發(fā)物交配后1 d消失，雄蝶醛類揮發(fā)物交配后3 d消失(圖1-B)。雌雄蝶共有且含量最高的揮發(fā)物均在交配后消失，雌蝶蟲體內(nèi)2-甲基烯丙醇含量在在交配前及交配時隨羽化時間的增加而減少，雄蝶蟲體內(nèi)2-甲基烯丙醇含量在交配前及交配時隨羽化時間的增加而增加(圖1-C)。雌雄蝶蟲體內(nèi)反-2-辛烯醛、1-二十醇在交配前及交配時含量的變化規(guī)律與醇類、醛類的變化規(guī)律類似(圖1-D, E)。

圖1 美鳳蝶成蟲不同時期主要揮發(fā)物(醇類；醛類；2-甲基烯丙醇；反-2-辛烯醛；1-二十醇)的含量變化Fig.1 Variations in the main volatile compounds (Alcohols; Aldehydes; 2-Methylallyl alcohol; (2E)-2-Octenal; 1-Eicosanol) of the adults of Papilio memnon in different periods

交配時雌蝶蟲體特有的4種揮發(fā)物(1-茚酮、異辛酸、1-苯基-1-丙炔、紫蘇醛)及雄蝶特有的1種揮發(fā)物(β-石竹烯)在交配后3 d均消失(圖2-A, E)。交配前及交配后1 d，紫蘇醛在雌雄蝶體內(nèi)均存在，而交配時僅在雌蝶蟲體檢測到(圖2-A)。交配前，β-石竹烯在雌雄蝶體內(nèi)均存在，交配時僅在雄蝶蟲體檢測到，交配后則完全消失(圖2-B)。雌蝶蟲體特有異辛酸、1-苯基-1-丙炔交配后1 d在雌蝶體內(nèi)消失(圖2-C, D)，而1-茚酮在交配后1 d在雌蝶體內(nèi)仍然存在(圖2-E)。

圖2 美鳳蝶成蟲不同時期特有揮發(fā)物(紫蘇醛；β-石竹烯；異辛酸；1-苯基-1-丙炔；1-茚酮)的含量變化Fig.2 Changes in contents of unique volatile compounds (Perillaldehyde; β-Caryophyllene; 2-Ethylcaproic acid; Phenylpropyne; 1-Indanone) of the adults of Papilio memnon in different periods

3 結(jié)論與討論

日齡是影響昆蟲交配及繁殖的重要因素(Tanneretal., 2019)。昆蟲的最佳交配日齡因其種類不同而存在差別。日齡增加使昆蟲交配能力減弱，其原因可能與昆蟲體內(nèi)精原細胞耗盡導致交配能力降低有關(guān)(閆喜中等, 2014)。本研究通過對美鳳蝶交配前、交配時及交配后蟲體揮發(fā)物檢測，分析了美鳳蝶成蟲蟲體揮發(fā)物的動態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果顯示羽化后雌雄蝶揮發(fā)物成分和相對含量都有較大的變化。羽化后的雌雄蝶可檢測到醇類、醛類、酯類、酸類等12類揮發(fā)物，其中芳香類、酯類和酸類在羽化后均有出現(xiàn)，揮發(fā)物的動態(tài)變化反映了美鳳蝶生理狀態(tài)、年齡、交配狀態(tài)、性別差異及生活環(huán)境因素等。

交配前，蝴蝶剛羽化還處于補充營養(yǎng)和促進生殖器官發(fā)育階段(王翻艷, 2015)，對蜜源植物的訪問才是主要任務(wù)，對成蟲氣味的追逐并不是主要的。本研究發(fā)現(xiàn)此階段美鳳蝶共有揮發(fā)物數(shù)量多而特有揮發(fā)物少或無，交配前雌雄蝶醛類、醇類含量最高。雌雄蝶共有的含量相對較高的揮發(fā)物為2-甲基烯丙醇和反-2-辛烯醛，雄蝶揮發(fā)物種類多于雌蝶。

交配時，蝴蝶羽化3 d已經(jīng)達到性成熟階段，求偶交配是蝴蝶的主要任務(wù)，對蝴蝶成蟲氣味的追逐是主要的。交配中雌雄蝶蟲體醛類、醇類含量最高，共有揮發(fā)物(2-甲基烯丙醇、反-2-辛烯醛、1-二十醇)的相對含量較高，目前關(guān)于2-甲基烯丙醇、反-2-辛烯醛、1-二十醇這3種揮發(fā)物在前人研究中尚未見報道。交配時雌蝶特有的揮發(fā)物有4種，雄蝶特有的揮發(fā)物有1種。結(jié)合前人的研究結(jié)果，Grula等(1980)研究發(fā)現(xiàn)菲羅豆粉蝶Coliasphilodice雄蝶翅膀分泌的酯類(肉豆蔻酸正己酯n-hexyl myristate)作為物種識別信號區(qū)分同種或異種雄蝶。黑紋粉蝶Pierismelete雌蝶依靠揮發(fā)物(雄蝶翅膀釋放的物種特異性氣味)來識別配偶(Kan and Hidaka, 1997)。透翅蝶Ithomiine雄蝶利用從味刷釋放的內(nèi)酯來識別同類雄蝶(Pliske, 1975b)。偏瞳蔽眼蝶Bicyclusanynana雄蝶翅膀上的香鱗釋放的揮發(fā)物會干擾雄雄蝶的識別，說明揮發(fā)物可能參與雄雄識別過程(Costanzo and Monteiro, 2007)。初步推測2-甲基烯丙醇、反-2-辛烯醛、1-二十醇可能用于美鳳蝶求偶時同性的識別，雌雄蝶特有揮發(fā)物(1-苯基-1-丙炔、異辛酸、紫蘇醛、1-茚酮、β-石竹烯)為求偶時異性的識別提供了某種暗示。

交配后，雌蝶進入大量耗能的產(chǎn)卵階段，需要大量取食補充、積累營養(yǎng)，并尋找合適的寄主植物進行產(chǎn)卵，繁衍后代的使命使蝴蝶對植物揮發(fā)物更為敏感。交配后雌雄蝶蟲體揮發(fā)物的種類和相對含量發(fā)生了極大的變化，揮發(fā)物種類銳減到8種，揮發(fā)物種類也由醛、醇類為主轉(zhuǎn)變?yōu)橹?、酸類為主。這種變化進一步證明了醛類、醇類肩負著蝴蝶配偶識別的作用。交配后蝴蝶進入孕卵生殖階段，也預(yù)示著它們使命的完成，醇類、醛類物質(zhì)徹底消失。交配后3 d雌雄蝶特有的揮發(fā)物均消失，說明雌蝶進行產(chǎn)卵，雄蝶完成自己的使命，雌雄蝶不需要再利用特有的揮發(fā)物吸引異性。

蝴蝶求偶時利用共有揮發(fā)物識別同類及同性，通過雌雄蝶特異性揮發(fā)物來辨別同種異性(王翻艷, 2015; 李承哲, 2017; 王華, 2017)，通過對美鳳蝶交配前后揮發(fā)物變化規(guī)律的分析，推測美鳳蝶雌雄蝶成蟲共有揮發(fā)物(2-甲基烯丙醇、1-二十醇和反-2-辛烯醛)可能用于識別同種及同性。雌蝶特有揮發(fā)物紫蘇醛及雄蝶特有揮發(fā)物β-石竹烯，在交配前雌雄蝶蟲體均存在，雄雌蝶對此氣味很熟悉，雄蝶很容易通過紫蘇醛識別雌蝶，雌蝶很容易通過β-石竹烯識別雄蝶。交配時雌蝶特有的揮發(fā)物1-茚酮、異辛酸、1-苯基-1-丙炔交配前不存在，交配后消失，推測這3種物質(zhì)可能是性信息素物質(zhì)，而雄蝶充分利用雌蝶特有的這幾種揮發(fā)物進行同種異性的識別。

由于昆蟲生境及個體之間存在差異，所以測得的成分也有很大不同。美鳳蝶蟲體醌類僅在羽化1 d雌雄蝶蟲體存在，推測其可能是美鳳蝶雌雄蝶未達到性成熟的標志性揮發(fā)物，炔類物質(zhì)僅在交配時雌蝶蟲體存在，推測其可能是雌蝶性信息素物質(zhì)。然而這些化合物仍然需要做進一步的分離、鑒定，如電生理試驗和行為學試驗才能確定它們的具體作用，這也是我們下一步需要進行的工作。