莊明亮，李劍飛，王 志，牛慶生，陳東海，王進州，葛 蓬，李志勇，王 琦

(吉林省養(yǎng)蜂科學研究所，吉林 132108)

蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎，蜜蜂的生存需要蛋白質(zhì)(薛嘉璐, 2020)，蛋白飼糧為蜜蜂的組織發(fā)育、修復等提供原料(莊明亮等, 2019)。正常條件下蜜蜂通過采集植物花粉來獲得蛋白質(zhì)營養(yǎng)，但在一些特殊環(huán)境，需要人工配制飼糧來滿足蜜蜂的生長發(fā)育和生存，對于養(yǎng)蜂生產(chǎn)實踐意義重大。蜂糧是成年蜜蜂的天然食糧，經(jīng)由工蜂采集的植物花粉，加入花蜜和酶等，并貯存在巢房中發(fā)酵而成的產(chǎn)物(Claudia and Consuelo, 2016)。蜂糧的營養(yǎng)成分十分豐富，含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和類黃酮等，對于蜜蜂蜂群的正常的生長發(fā)育至關重要(Wolfe and Dutton, 2015; 劉玥佳等, 2020)。近些年來，關于蜜蜂營養(yǎng)的研究取得了階段性進展，集中在蜜蜂幼蟲時期的蛋白質(zhì)(李成成等, 2011; 劉俊峰等, 2011)、礦物質(zhì)(張鴿和胥保華, 2012)、維生素(馮倩倩等, 2012; 廖春華等, 2016)等營養(yǎng)需要，缺乏對成年工蜂營養(yǎng)的系統(tǒng)研究。

本試驗通過配制含有一定比例蜂糧和花粉的蛋白飼糧，在實驗室紗籠條件下觀察和記錄蜜蜂的死亡情況，利用液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, LC-MS)檢測其對蜜蜂生理代謝的影響，通過分析計算篩選差異代謝物，并結合數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)，探討對代謝通路的影響，發(fā)掘對蜜蜂壽命起關鍵作用的營養(yǎng)因素，為特殊環(huán)境中工蜂飼糧的合理配制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試蜜蜂

試驗蜜蜂采自吉林省養(yǎng)蜂科學研究所的意大利蜜蜂Apismelliferaligustica蜂群。

1.1.2主要試劑

蜂糧(取自當年健康蜂群，現(xiàn)取現(xiàn)用)，蜂蜜(當年7月蜂場自取波美度42°成熟椴樹蜜，保存于干燥通風環(huán)境)，雜花粉(取自當年健康蜂群)，蔗糖(廣西大新湘桂制糖有限公司)，甲醇、甲酸、乙腈等(天津市彪仕奇科技有限公司)，L-2-氯苯丙氨酸(生工生物工程股份有限公司)。

1.1.3主要儀器

樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-24/32型，購自上海凈信有限公司)，電子天平(JD300-3-G型，沈陽龍騰電子有限公司)，超聲波清洗機(SB-5200DT型，寧波東鑫有限公司)，冷凍離心機(TGL-16MS型，上海盧湘儀器有限公司)，液相色譜儀(Nexera UPLC型，日本島津公司)，高分辨質(zhì)譜儀(QE型，賽默飛公司)。

1.2 試驗方法

1.2.11日齡工蜂的獲取

準備產(chǎn)過1～2代蜜蜂的空巢脾，利用蜂群清理，然后將巢脾置于底箱中央，并使用控產(chǎn)器限制蜂王產(chǎn)卵12 h，把此巢脾放入蜂群繼箱中，工蜂出房前1 d提取巢脾，放到34.5℃ ± 0.3℃培養(yǎng)箱里，待工蜂出房。

1.2.2飼糧的配制

依據(jù)本團隊前期工作基礎(莊明亮等, 2021)，以蜂蜜、蔗糖粉、花粉和蜂糧為原料，按照一定比例配置3種飼糧。對照組飼糧：蜂蜜和蔗糖粉按照1 ∶3比例充分揉搓，裝入鐵紗籠5 g備用；試驗組A飼糧：花粉、蜂蜜、蔗糖粉按照5 ∶1 ∶6比例充分揉搓，裝入鐵紗籠5 g備用；試驗組B飼糧：蜂糧、蜂蜜、蔗糖粉按照5 ∶1 ∶6比例充分揉搓，裝入鐵紗籠5 g備用。鐵紗籠為長方體結構(長×寬×高=13 cm×3.5 cm×3 cm)。

1.2.3蜜蜂死亡情況的觀察記錄

每組鐵紗籠內(nèi)裝入30頭1日齡的工蜂，放在避光安靜的室內(nèi)常溫環(huán)境(25℃～29℃)飼養(yǎng)。每天固定時間觀察和記錄蜜蜂的死亡情況，并把死蜂清除。每組樣品做3組平行處理。

1.2.4代謝組分析測定

根據(jù)上一步關于蜜蜂死亡情況觀察的試驗結果，針對試驗組A和試驗組B進行代謝組分析。室內(nèi)飼養(yǎng)第5天，取生命體征正常的工蜂，2頭成年工蜂裝入1個2 mL離心管中，置于液氮中1.5 h后放入-80℃冰箱冷凍保存，每組6個生物學重復。

把蜜蜂樣本放入研磨機70 Hz運行1.5 min，稱取30 mg，加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸、20 μL Lyso PC20和400 μL 甲醇，震蕩40 s；冰水中超聲提取15 min；-18℃靜置25 min；4℃條件13 000 rpm離心10 min，取300 μL上清液濃縮揮干，加入400 μL甲醇 ∶水(1 ∶4)重新溶解，震蕩40 s；4℃條件13 000 rpm再次離心10 min，用移液器吸取150 μL上清液，使用0.22 μL相針孔過濾，進行LC-MS檢測。

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C-18色譜柱，流動速度0.35 mL/min，柱溫45℃；流動相A 0.1%甲酸，B甲醇，洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution

質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，電壓正離子3 500 V負離子3 100 V，輔助氣體流動速度為10 arb，鞘氣體流動速度為35 arb，毛細管溫度320℃。

1.2.5統(tǒng)計學分析

蜜蜂存活試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進行分析，t檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。代謝組數(shù)據(jù)用Progenesis QI v2.3軟件(Nonlinear Dynamics Newcastle, UK)分析，用變量投影重要度(Variable Importance in the Projection, VIP)和t檢驗來分析差異代謝物。使用KEGG、The Human Metabolome Database(the human metabolome database, HMDB)數(shù)據(jù)庫并結合文獻進行定性分析。

2 結果與分析

2.1 飼喂不同蛋白飼糧的蜜蜂死亡情況

蜜蜂7 d內(nèi)的死亡情況(表2)：各試驗組工蜂在第1天和第2天均沒有出現(xiàn)死亡；試驗組A在第3天出現(xiàn)死亡，在第6天30頭工蜂全部死亡；對照組和試驗組B前5天均沒有出現(xiàn)死亡，在第6天和第7天試驗組B死亡數(shù)量均顯著低于對照組(P<0.05)。7 d內(nèi)每組總死亡情況：對照組死亡7.27 ± 1.78頭，試驗組A死亡30.00頭，試驗組B死亡2.34 ± 0.58頭。前7天試驗組B總死亡數(shù)量顯著對于對照組和試驗組A(P<0.05)。

表2 飼喂不同蛋白飼糧的蜜蜂死亡情況Table 2 Mortality of honeybees fed different diets

2.2 蜜蜂代謝物主成分分析

利用LC-MS方法分析飼喂不同蛋白飼糧工蜂的代謝物，色譜圖的峰沒有漂移，而且具有穩(wěn)定的保留時間。經(jīng)過t檢驗，設置VIP>1.0，F(xiàn)C>2.0，共篩選差異代謝產(chǎn)物393個，196個上調(diào)，197個下調(diào)(圖1)。

圖1 試驗組A與試驗組B差異代謝物的火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed metabolites of two groups

蜜蜂代謝物主成分分析得分圖PCA見圖2-A，采用PCA方法來觀測兩試驗組的分布趨勢，試驗樣本全部在95%置信區(qū)間，兩組可以明顯區(qū)分開。

蜜蜂代謝物偏最小二乘法判別分析得分圖PLS-DA見圖2-B，在PCA模型的基礎上進一步探討加入蜂糧的飼糧與加入花粉的飼糧對蜜蜂代謝的差異，找到差異代謝物，建立PLS-DA模型，放大它們的差異。使用交叉驗證法驗證PLS-DA模型，模型預測率(Q2)均大于0.50，模型穩(wěn)定可靠，且具有較好的分析判別能力。

圖2 試驗組A與試驗組B蜜蜂代謝物PCA和PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA and PCA score scatter plots of bees metabolites in two groups注：A，三角形代表試驗組；B，正方形代表試驗組。圖3同。Note: A, Triangle represents test group; B, Square represents test group. The same for Fig.3.

蜜蜂代謝物正交偏最小二乘法判別分析得分圖OPLS-DA見圖3-A，OPLS-DA可篩除與分類無關的噪音，優(yōu)化重要變量，有利于識別差異代謝物。前3個有效主成分的R2X(cum)=0.528，R2Y(cum)=0.927，Q2(cum)=0.817，表明模型質(zhì)量較好。

模型的排序驗證圖見圖3-B，為了判別是否過擬合，采用200次響應排序檢驗(response permutation testing, RPT)和7次循環(huán)交互驗證(7-fold cross validation)來檢測模型的質(zhì)量。Q2均在R2之下，并且Q2小于0，表明模型沒有過擬合，穩(wěn)定可靠，可以進行下一步差異代謝物的鑒定與分析。

2.3 差異代謝物鑒定與分析

2.3.1差異代謝物鑒定

試驗組A與試驗組B的差異代謝物情況，通過OPLS-DA分析后，在OPLS-DA模型中選擇VIP值最大的前100個變量(VIP值大于2.0)，對這100個變量進行內(nèi)標和積分校正。在Human、KEGG等數(shù)據(jù)庫比對，共指認出15個差異代謝物，包括氨基酸、維生素、糖類等，試驗組A相對于試驗組B，上調(diào)的有4種代謝產(chǎn)物,下調(diào)的有11種代謝產(chǎn)物(表3)。

表3 試驗組A與試驗組B的差異代謝物Table 3 Identification of significantly different metabolites in two groups

2.3.2差異代謝物通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進行通路分析(圖4)。代謝通路差異顯著的有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路(Glycine, serine and threonine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝通路(Arginine and proline metabolism)、賴氨酸降解通路(Lysine degradation)、戊糖磷酸通路(Pentose phosphate pathway)。

圖4 差異代謝物KEGG代謝通路富集圖Fig.4 Differential metabolite KEGG enriclument map注：藍色虛線示意P值為0.05，條柱高于藍線時，代表的通路具有顯著性差異。Note: The value of P indicated by the blue dotted line was 0.05. When the column was higher than the blue line, the pathway represented by the blue dotted line had significant difference.Glycine, serine and threonine metabolism: 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路; Arginine and proline metabolism: 精氨酸和脯氨酸代謝通路; Lysine degradation: 賴氨酸降解通路; Pentose phosphate pathway: 戊糖磷酸通路; Butanoate metabolism: 丁酸代謝通路; Alpha-Linolenic acid metabolism: α-亞麻酸代謝通路; Tyrosine metabolism: 絡氨酸代謝通路; Tryptophan metabolism: 色氨酸代謝通路; Sphingolipid metabolism: 鞘脂代謝通路; ABC transporters: ABC轉運蛋白代謝通路。

3 結論與討論

優(yōu)質(zhì)的蜜蜂種質(zhì)資源越來越引起人們的重視，其中郵寄蜂王是目前引入優(yōu)良蜂種的最為常用方式。長途郵寄蜂王時，會伴有幾頭幼年陪嫁工蜂，再裝入煉糖飼糧保證郵寄途中蜂王的安全。前期研究發(fā)現(xiàn)加入一定比例的蜂糧飼糧，工蜂不僅存活時間長而且又能保證王漿腺的正常發(fā)育，郵寄蜂王的存活率高(莊明亮等, 2021)。但加入相同比例花粉的飼糧，工蜂在紗籠這種特殊環(huán)境中卻不能長時間存活，存活時間顯著低于蜂糧飼糧組。本試驗在紗籠條件下模擬特殊環(huán)境，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術代謝組學研究飼喂相同比例蜂糧和花粉飼糧的工蜂的代謝差異物，找到影響工蜂壽命的關鍵因子。

本試驗配置相同比例的花粉和蜂糧的A、B兩組人工飼糧，與蜂蜜和蔗糖的煉糖飼糧對比。結果最先出現(xiàn)蜜蜂死亡是A組，出現(xiàn)在紗籠飼養(yǎng)的第3天，而且在第5天A組蜜蜂全部死亡。而且延長紗籠飼養(yǎng)時間發(fā)現(xiàn)，B組蜜蜂不僅存活時間長而且蜜蜂生命體征更活躍，說明B組的人工飼糧更加適合蜜蜂，能夠保證蜜蜂在無法排泄的紗籠環(huán)境正常存活。蜜蜂接受不同蛋白飼糧的飼喂，它的壽命和活躍狀況均不同。用鑷子拉出A、B兩組死亡蜜蜂的中腸，發(fā)現(xiàn)A組蜜蜂中腸膨大并且有許多花粉粒，在密閉的紗籠環(huán)境中無法消化吸收花粉，可能是A組蜜蜂短時間大量死亡的原因。本試驗采用代謝組學方法來評定試驗組A和B飼糧對蜜蜂生理代謝的影響，通過分析判斷驗證并指認出15個差異代謝物，包括氨基酸、維生素、糖類等。

本研究發(fā)現(xiàn)，試驗組A和B鑒定出6種氨基酸及其衍生物差異顯著，其中4種氨基酸含量降低，2種氨基酸含量提高。試驗組A賴氨酸含量比試驗組B下降，通過參考數(shù)據(jù)庫KEGG，進一步對代謝通路分析發(fā)現(xiàn)賴氨酸降解通路出現(xiàn)差異。賴氨酸是蜜蜂生命活動的必需氨基酸，賴氨酸分解后容易生成乙酰-CoA，調(diào)控脂肪酸，為脂質(zhì)產(chǎn)生提供物質(zhì)基礎(Narkewiczetal., 2000)。試驗組A亮氨酸含量比試驗組B下降，亮氨酸是蜜蜂體內(nèi)重要的氨基酸，能夠提高機體對蛋白質(zhì)的利用效率，戴榮國等(2016)研究表明亮氨酸能夠顯著提高蜂群群勢和封蓋數(shù)量等。試驗組A比試驗組B相比氨基酸含量下降數(shù)量大于上升數(shù)量，氨基酸代謝與蜜蜂生存發(fā)育、調(diào)節(jié)抗逆性等活動極其相關。添加花粉的試驗組A比添加蜂糧的試驗組B維生素中檢測出差異只有維生素B4，其在動物體內(nèi)與許多中間物質(zhì)的合成有關，如ATP等。添加花粉的試驗組A比添加蜂糧的試驗組B的肌苷含量下降。肌苷參與生物體內(nèi)ATP、輔酶A等的合成，與生物體的能量及物質(zhì)代謝相關。閆俊書等(2016)研究發(fā)現(xiàn)肌苷能促進三黃肉雞體內(nèi)ATP與蛋白質(zhì)的合成，提高多種酶的活性，促進機體產(chǎn)生抗體。肌苷在蜜蜂機體內(nèi)的應用研究還未見報道。

在室內(nèi)紗籠等特殊環(huán)境中，工蜂飼糧不可直接加入花粉，可以按照6 ∶5 ∶1蔗糖、蜂糧、蜂蜜比例混合制成的人工飼糧，不僅可以提高蜜蜂存活率而且可以增加存活時間。采用LC-MS方法檢測飼喂試驗組A和B飼糧5日的工蜂，共篩選鑒定15種差異代謝物，主要包括賴磺酸、亮氨酸、維生素B4、肌苷等，主要涉及賴氨酸降解通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路、能量代謝等途徑。本試驗結果可為蜜蜂飼養(yǎng)管理中人工飼糧配置提供一定理論基礎。