葉 良，施騰飛，劉 鵬，朱玉潔，李 來(lái)，余林生*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

1 昆蟲免疫及抗菌肽

昆蟲在地球上有著4億多年的進(jìn)化歷史，物種多樣性極其豐富，幾乎在每一個(gè)生態(tài)位上都有分布(Adamsetal., 2000; Ferrandonetal., 2004)。造成這種優(yōu)勢(shì)的原因之一是昆蟲有著強(qiáng)大的免疫能力。與脊椎動(dòng)物相比，由于缺少效應(yīng)淋巴細(xì)胞，因而昆蟲不具有適應(yīng)性免疫反應(yīng)，但卻形成了高效而獨(dú)特的先天免疫機(jī)制。昆蟲先天防御系統(tǒng)由兩部分組成，即細(xì)胞免疫和體液免疫，而不同的外界脅迫作用也都會(huì)對(duì)這兩種方式產(chǎn)生影響(Richardsetal., 2017)。昆蟲的細(xì)胞免疫由昆蟲的血細(xì)胞執(zhí)行，昆蟲血淋巴中的細(xì)胞有著與哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞相似的特性，可以有效的吞噬、結(jié)節(jié)和包囊外源物(Siddiqui and Al-Khalifa, 2014; Blancoetal., 2017)。昆蟲的體液免疫由可溶性血漿蛋白或脂肪體主導(dǎo)，其功能類似于哺乳動(dòng)物的肝臟，主要負(fù)責(zé)凝血、黑色素合成和抗菌肽的生成(Hoffmann, 2003)。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是一類生物體受到外界脅迫時(shí)產(chǎn)生的用于抵御外界侵害的免疫效應(yīng)分子，是先天免疫的重要組成部分，生物體內(nèi)編碼抗菌肽的基因在進(jìn)化上高度保守(Oren and Shai, 1998)。昆蟲抗菌肽是昆蟲抵御外來(lái)病原物的反應(yīng)中十分重要的一環(huán)，是體液免疫系統(tǒng)中不可或缺的重要成員。

第一個(gè)被完全表征的昆蟲抗菌肽是從惜古比天蠶Hyatophoracecropia蛹的血淋巴中分離出來(lái)的(Bomanetal., 1989)?？咕耐ǔＳ幸韵聨讉€(gè)特性：大多為小分子肽段、通常為陽(yáng)離子性、熱穩(wěn)定性較強(qiáng)和水溶性較好(Lietal., 2012; 孫龍, 2012)?？咕闹宰鳛橐环N被高度關(guān)注的新型抗菌制劑，主要是因?yàn)榕c傳統(tǒng)抗菌制劑相比其有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：其一，抗菌肽對(duì)病原微生物有著廣譜的活性，除了可以抑制細(xì)菌增長(zhǎng)以外，還具有抑制真菌繁殖(Lambertyetal., 2001a)、抗病毒(Tripathietal., 2013)、抗艾滋(Wongetal., 2011)、殺死原蟲(Efronetal., 2002)等作用；其二，大多數(shù)抗菌肽的作用機(jī)制是與沒有特異性受體的細(xì)胞膜或者其它廣泛的靶點(diǎn)相互作用，病原微生物不易對(duì)抗菌肽產(chǎn)生抗藥性(Peschel and Sahl, 2016)；其三，抗菌肽對(duì)大多數(shù)哺乳動(dòng)物安全，副作用小，不會(huì)致使生物體畸變，也不會(huì)蓄積毒性；除此之外，部分抗菌肽還有促進(jìn)傷口愈合，提高生物體免疫力等功效(Ribeiroetal., 2012)。

現(xiàn)從昆蟲中分離的抗菌肽已多達(dá)200多條，其主要來(lái)自于膜翅目、鱗翅目、雙翅目和鞘翅目的脂肪體、血淋巴、毒囊等部位。膜翅目是昆蟲綱中的第三大目，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的昆蟲種類已經(jīng)超過(guò)了15萬(wàn)種。從膜翅目中分離的天然抗菌肽現(xiàn)今已多達(dá)100種，是昆蟲抗菌肽來(lái)源最大的一個(gè)目，如Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin和Defensin等(Wangetal., 2016)。

蜜蜂是膜翅目中具有代表性的一類昆蟲，是一種社會(huì)性模式昆蟲，也是重要的傳粉昆蟲，全球大約90%的開花植物和75%的作物需要蜜蜂授粉(Andrikopoulos and Cane, 2018)，其授粉作用對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)多樣性、改良生態(tài)環(huán)境、提高糧食產(chǎn)量和質(zhì)量都有著其它生物無(wú)法替代的作用。不僅如此，蜂產(chǎn)品具有較好的生理活性作用，如蜂王漿有著抗氧化(Guoetal., 2005)、抗衰老(Kimetal., 2019)、抗菌(Katrinaetal., 2015)、抗腫瘤(Zhangetal., 2017)、護(hù)肝(Cemeketal., 2012)和降血糖(Khoshpeyetal., 2016)等作用；蜂蜜有著抗氧化(Hassanetal., 2012)、抗菌(Mavricetal., 2008)、消炎(Ahmadetal., 2009)、愈合傷口(Seemaetal., 2013)等功效，因此蜜蜂有著良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

蜜蜂在野外采集的過(guò)程中，會(huì)受到各種病原物、寄生蟲以及農(nóng)藥的威脅，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的適應(yīng)，蜜蜂形成了與之相適應(yīng)的分子進(jìn)化策略。除了先天免疫產(chǎn)生的抗菌肽以外，在蜜蜂的蜂蜜(Erbanetal., 2019)、蜂毒(Memariani and Memariani, 2020)和蜂王漿(Parketal., 2020)等蜂產(chǎn)品中，也含有豐富的抗菌肽種類。

2 蜜蜂抗菌肽的分類

目前尚沒有一個(gè)統(tǒng)一的昆蟲抗菌肽分類標(biāo)準(zhǔn)，被大多數(shù)人所接受的一種分類方式是根據(jù)昆蟲抗菌肽的氨基酸組成及分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。據(jù)此可將昆蟲抗菌肽分為4大類：天蠶素(Cecropins)及其類似物類、防御素類(Defensins)、富含甘氨酸的抗菌肽類和富含脯氨酸的抗菌肽類(Hancock, 1997; 王義鵬和賴仞, 2010)。本文中根據(jù)蜜蜂抗菌肽的來(lái)源將蜜蜂抗菌肽分為蜜蜂先天免疫抗菌肽和蜜蜂蜂產(chǎn)品抗菌肽兩大類(表1)。

表1 蜜蜂抗菌肽的分類及來(lái)源Table 1 Classification and sources of bee antimicrobial peptides

2.1 蜜蜂天然免疫抗菌肽

蜜蜂體內(nèi)天然抗菌肽主要有4種，分別是Apidaecin(Casteelsetal., 1989)、Abaecin(Casteelsetal., 1990)、Hymenoptaecin(Casteelsetal., 1993)和Defensin(Casteels and Tempst, 1994)。它們作為蜜蜂先天體液免疫的重要組成部分，在抑制和清除細(xì)菌(Krongdangetal., 2019)、真菌(Tesovniketal., 2020)和寄生蟲(Wuetal., 2020)等生物有害因子方面發(fā)揮著重要的作用。

2.1.1Apidaecin

在蜜蜂中，抗菌肽Apidaecin是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的一種抗菌肽，屬于富含脯氨酸的抗菌肽類(Brown and Hancock, 2006)。蜜蜂Apidaecin的成熟肽通常含有18個(gè)氨基酸殘基，其中有6個(gè)脯氨酸(Da Costaetal., 2015)，與果蠅的抗菌肽Drosocin有著較高同源性(Buletetal., 1993)。只存在于部分蜜蜂屬和熊峰屬的昆蟲中，Apidaecin有著較高的同源性，在成熟肽之前，有著獨(dú)特的前體結(jié)構(gòu)，這些重復(fù)受到極少量病原物刺激后便會(huì)迅速表達(dá)，因此Apidaecin是蜜蜂受到病原物入侵后最早起作用的抗菌物質(zhì)之一(Casteelsetal., 1989)。Apidaecin主要用于殺死革蘭氏陰性菌，對(duì)革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度在0.27～64 μM之間(Cardosoetal., 2019)。此外它對(duì)其他病原微生物如革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、病毒和原蟲也用一定的抑制作用(Panetal., 2015)。但是Apidaecin的拮抗作用涉及手性細(xì)胞靶點(diǎn)的立體選擇性識(shí)別(Casteels and Tempst, 1994)，其結(jié)合位點(diǎn)是傳統(tǒng)的底物結(jié)合位點(diǎn)(Zhouetal., 2008)，因此微生物會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抗性。

2.1.2Abaecin

Abaecin也屬于富含脯氨酸的抗菌肽類，存在于膜翅目的昆蟲中，這些昆蟲中的Abaecin基因都有著一定的同源性，中華蜜蜂Apisceranacerana和西方蜜蜂Apismellifera的Abaecin成熟肽序列通常含有34個(gè)氨基酸，不含半胱氨酸殘基，含有的10個(gè)脯氨酸殘基在整個(gè)肽中的均勻分布阻止了α-螺旋構(gòu)象，沒有保守的基序YL/IPRP(Louren?oetal., 2013; Luizetal., 2017)，在蜜蜂中，Abaecin同時(shí)受Toll和Imd途徑的調(diào)控(Louren?oetal., 2018)。Abaecin的氨基末端(N-端)與Apidaecin十分相似，有著比Apidaecin更為廣譜的抗革蘭氏陰性菌能力，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌沒有抗菌活性(Casteelsetal., 1990)，而對(duì)真菌和農(nóng)藥都有一定的抑制或解毒作用(Tesovniketal., 2019a)。

2.1.3Hymenoptaecin

Hymenoptaecin是一種不同于所有已知昆蟲抗菌肽的抗菌肽(Evansetal., 2006)，是膜翅目昆蟲特有的抗菌肽。僅受到Imd途徑的調(diào)控(Schlüns and Crozier, 2007; Louren?oetal., 2013)。蜜蜂的Hymenoptaecin由95個(gè)氨基酸組成，有一個(gè)16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列和一個(gè)前體序列，與熊蜂的Hymenoptaecin具有較高同源性，是一種陽(yáng)離子抗菌肽，屬于富含甘氨酸的抗菌肽類，具有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，其三維結(jié)構(gòu)由N-端環(huán)、中心雙親α-螺旋和C-端反平行β-片組成(Schlüns and Crozier, 2007)。Hymenoptaecin對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌都有一定的效果，且作用機(jī)制使得細(xì)菌不易對(duì)其產(chǎn)生抗性，另外Hymenoptaecin還能對(duì)已對(duì)Apidaecin產(chǎn)生抗性的細(xì)菌起到一定的抑菌效果(Casteelsetal., 1993)。在體內(nèi)，Hymenoptaecin通常與Abaecin共同作用，Hymenoptaecin改變細(xì)菌膜的通透性，此后Abaecin進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)菌內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)達(dá)到殺死細(xì)菌的效果(Rahnamaeianetal., 2015)。除了抑菌效果，Hymenoptaecin還能影響寄生蜜蜂害螨卵黃原蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響害螨的繁殖(Wuetal., 2020)。

2.1.4Defesin

Defensin屬于防御素類昆蟲抗菌肽，有兩種亞型，Defensin-1和Defensin-2。Defensin-1有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，最后一個(gè)外顯子編碼一個(gè)僅由蜜蜂防御素所具有的短C端延伸，Defensin-2只有一個(gè)內(nèi)含子(Klaudinyetal., 2005)。Defensin總體含量很少，在免疫誘導(dǎo)的蜜蜂血淋巴內(nèi)，其它幾種抗菌肽的含量是Defensin的20～50倍，Defensin在受到大量病原物刺激12 h后才微量表達(dá)，24 h之后表達(dá)趨于穩(wěn)定(Quetal., 2008)。在蜜蜂中，Defensin主要受到Toll通路中Dorsal基因的調(diào)控。除了在體液免疫中出現(xiàn)以外，在蜂蜜、蜂王漿中也含有這類抗菌肽(Bucekovaetal., 2019)。Defensin在絕大多數(shù)昆蟲中均有分布，圖4列舉了部分膜翅目Defensin氨基酸對(duì)比及其保守區(qū)域，蜜蜂Defensin的N端含有一個(gè)α螺旋，接著是一個(gè)扭曲的反平行β折疊，其α螺旋和β折疊由2個(gè)二硫鍵相連，形成了一個(gè)半胱氨酸穩(wěn)定的αβ基序(Cs αβ motif)，這種結(jié)構(gòu)在大多數(shù)的動(dòng)物防御素中都存在(Lambertyetal., 2001b)。但是，不同的是，常見的昆蟲防御素由34～43個(gè)氨基酸殘基組成(Lauthetal., 1998)，從蜜蜂中分離出的防御素含51個(gè)氨基酸殘基(Boman, 2003)，含有6個(gè)半胱氨酸，從而構(gòu)成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(Oizumietal., 2005)。Defensin-1可以在唾液腺中合成，負(fù)責(zé)社會(huì)免疫，它還有可能參與蜜蜂對(duì)農(nóng)藥的免疫代謝作用，如百里酚(Gashoutetal., 2020)、雙甲脒(Gashoutetal., 2020)、噻蟲嗪(Tesovniketal., 2019a)；Defensin-2由脂肪體細(xì)胞合成，負(fù)責(zé)個(gè)體免疫，除了抑制細(xì)菌外，對(duì)真菌、農(nóng)藥等外源物也有免疫作用(Tesovniketal., 2019a)。

2.2 蜂產(chǎn)品中的抗菌肽

2.2.1蜂毒中的抗菌肽

一些動(dòng)物，例如蜘蛛、蝎子、蛇、蜜蜂等產(chǎn)生有毒的分泌物—毒液，通常用來(lái)使捕食對(duì)象或掠食者喪失行動(dòng)能力或直接殺死它們。這些毒液通常具有藥理活性成分，包括一些酶和肽，有著極高的研究?jī)r(jià)值(Andreottietal., 2010; Memarianietal., 2018)。蜂毒便是由蜜蜂腹腔內(nèi)的腺體合成的毒素，是一種含有多種生物活性物質(zhì)的混合物，其中的肽類物質(zhì)就包括蜂毒肽(Melittin)、蜂毒明肽(Apamin)等，此外還含有其他酶類和胺類等成分(Sonetal., 2007)。蜂毒肽，也稱蜂毒素，是蜂毒的主要成分(占蜂毒干重的40%～60%)，是一種線性的陽(yáng)離子的兩親性多肽(Fidelioetal., 1984)。蜂毒肽由26個(gè)氨基酸組成(NH2-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln- Gln-CONH2)，由兩個(gè)α螺旋組成，通過(guò)一個(gè)靈活的片段連接在一起，帶6個(gè)正電荷，其單體可以分為N-端區(qū)域、兩性中段和陽(yáng)離子C-端區(qū)域3個(gè)區(qū)域，N端為疏水性，C段為親水性(Raghuraman and Chattopadhyay, 2007)。蜂毒肽有著多種抑制方式，使得蜜蜂對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、腫瘤細(xì)胞都有很好的抵抗作用(Leeetal., 2013; Gajskietal., 2016)。蜂毒明肽是蜂毒中含量第二多的肽，約占干重的1%～2%，由18個(gè)氨基酸組成，是一種高效的神經(jīng)毒肽，其3～5和6～8號(hào)殘基具有旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，9～16號(hào)殘基形成α螺旋，這種螺旋是由碳末端的3個(gè)殘基的上升而得以延伸，還有4個(gè)半胱氨酸殘基和兩個(gè)二硫鍵，呈不對(duì)稱的雙環(huán)結(jié)構(gòu)(Maget-Dana and Ptak, 1997)。

2.2.2蜂王漿中的抗菌肽

蜂王漿對(duì)蜜蜂的級(jí)型分化、蜂王的發(fā)育、生殖以及行為都具有十分重要的生理調(diào)節(jié)作用(沈立榮等, 2009)。已有報(bào)道指出蜂王漿對(duì)放線菌、細(xì)菌都有較好的抑制作用(Eshraghi and Seifollahi, 2003)。蜂王漿中含有的主要抗菌肽是Jelleine I、II、III、IV和Am-royalisin等，這些抗菌肽主要是從蜂王漿主蛋白中分離的(Sugiyamaetal., 2012; Bílikovaetal., 2015)。Jelleines抗菌肽家族最早是從意大利蜜蜂蜂王漿主蛋白MRJP-1分離得到的，它們由8～9個(gè)氨基酸組成，在C-端酰胺化，并帶有+2電荷，主要區(qū)別是N-端或C-端的氨基酸不同 (Romanellietal., 2011; Fontanaetal., 2014; Zahedifardetal., 2020)。Jelleine I、II和III對(duì)酵母、革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌都有很高的抗菌活性，其抗菌肽活性為Jelleine I>Jelleine II>Jelleine III。由于缺少陽(yáng)離子肽抗菌活性所需的C-端亮氨酸殘基，Jelleine IV沒有抗菌活性(Romanellietal., 2011; Perezetal., 2014)。除此以外，Am-royalisin也是蜂王漿中分離的一種抗菌肽，其分子量為5 523Da，其一級(jí)結(jié)構(gòu)由51個(gè)氨基酸殘基組成，含有兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，具有酰胺化的C-末端(Fujiwaraetal., 1990)。

3 蜜蜂抗菌肽作用機(jī)制

抗菌肽的作用機(jī)制主要有兩大類，細(xì)胞膜作用機(jī)制(Pietersetal., 2009)和非細(xì)胞膜作用機(jī)制(Auvynet and Rosenstein, 2009)。不同類型抗菌肽通常有著不一樣的作用機(jī)制，且同一類型的作用機(jī)制對(duì)不同微生物的效果也有可能有著顯著的差異(Lavineetal., 2005; Imamuraetal., 2009)。

細(xì)胞膜作用機(jī)制包括三種模型，分別是環(huán)孔模型(又稱微粒模型)、桶版模型(桶壁模型)和毯式模型(地毯模型)。環(huán)孔模型：抗菌肽的螺旋結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞膜，與磷脂雙分子層共同形成孔洞，從而殺死或抑制微生物，根據(jù)抗菌肽在膜上的分布情況，又分為有序環(huán)孔模型和無(wú)序環(huán)孔模型，蜂毒肽就是環(huán)孔模型模式的代表(Meloetal., 2009; Yangetal., 2010; Nguyenetal., 2011)；桶版模型：含有膦脂成分的細(xì)菌細(xì)胞膜通常使得膜帶負(fù)電，帶正電荷或含有親水基團(tuán)的抗菌肽會(huì)與微生物的膜吸引到一起并以垂直的方式插入到膦脂雙分子層，形成跨膜通道和孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄出，從而達(dá)到殺死或抑制微生物的效果(Huang, 2000)；毯式模型：前半段與桶版模型相似，抗菌肽通過(guò)電荷或親水基團(tuán)與細(xì)胞膜相互吸引，但不一樣的是，與細(xì)胞膜接觸后，會(huì)平行排列在膜的表面，然后通過(guò)疏水作用和分子張力作用改變細(xì)胞膜的表面張力，引起膜變形或崩解達(dá)到殺死或抑制微生物的效果(Brogden, 2005)。

非膜作用機(jī)制則包括細(xì)胞外機(jī)制和細(xì)胞內(nèi)機(jī)制兩種(Brogdenetal., 1996)。細(xì)胞外機(jī)制是通過(guò)各種方式抑制細(xì)胞壁的合成從而殺死或抑制微生物(Ando and Natori, 1988)。例如抗菌肽Mersacidin，它通過(guò)干擾轉(zhuǎn)糖苷作用而抑制肽聚糖的合成從而達(dá)到抗微生物的效果(Br?tzetal., 1998)；細(xì)胞內(nèi)作用機(jī)制的抗菌肽可以自由的穿過(guò)細(xì)胞膜，但不會(huì)造成病原物的內(nèi)物質(zhì)顯著泄露，也不會(huì)造成病原物膜電位的顯著降低，它們通過(guò)絮凝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)、與核酸結(jié)合從而影響DNA合成、抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白或酶的活性以及抑制細(xì)胞呼吸作用等方式來(lái)達(dá)到抑菌的效果(Letellieriietal., 1996; Kragoletal., 2001; Nicolas, 2009)。

3.1 膜作用機(jī)制

Apidaecin、Hymenoptaecin、Defensin、Melittin和Jelleine都屬于膜作用機(jī)制的抗菌肽。研究顯示Apidaecin不會(huì)干擾細(xì)胞膜的通透性(Casteelsetal., 1989; Casteels and Tempst, 1994)，但可以通過(guò)PXP基序形成寡聚體，使其通過(guò)細(xì)菌外膜，與細(xì)菌內(nèi)膜上的受體相互作用達(dá)到抑制細(xì)菌的效果(Leleetal., 2015)；Hymenoptaecin可以與特定的細(xì)胞靶點(diǎn)有效結(jié)合，從而影響細(xì)菌膜的通透性(Casteelsetal., 1993)；Defensin主要通過(guò)干擾細(xì)胞質(zhì)膜的酸性磷脂和電壓依賴性通道的形成，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鉀離子流失、內(nèi)膜部分去極化從而殺死細(xì)胞(Maget-Dana and Ptak, 1997)；Melittin在低濃度(μM)下就能誘導(dǎo)細(xì)胞膜微孔形成，進(jìn)而干擾細(xì)胞膜功能，引發(fā)細(xì)胞溶解(Leeetal., 2013; Gajskietal., 2016)；Jelleine則主要是改變膜電位和膜通透性來(lái)抑制微生物(Bachanováetal., 2002)。

3.2 非膜作用機(jī)制

Abaecin和Apamin屬于非膜作用機(jī)制的抗菌肽，此外Defensin和Melittin也有非膜作用機(jī)制。Abaecin方式是使用非溶解性的方式進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)菌細(xì)胞相互作用及阻礙蛋白質(zhì)的合成(Rahnamaeianetal., 2015)，但是其過(guò)膜能力弱，因此與很多成孔肽例如Cecropin A、Stomoxyn和Hymenoptaecin等共同處理時(shí)，對(duì)細(xì)菌的作用會(huì)被增強(qiáng)，例如Hymenoptaecin對(duì)大腸桿菌的亞致死濃度為1.5 μM，而與Abaecin混合后亞致死濃度變?yōu)?.5 μM，抗菌活性大大提升(Lietal., 2017)。不光來(lái)源于蜜蜂的肽，來(lái)源于其它物種的成孔肽也可以增強(qiáng)其抗菌效果(Rahnamaeianetal., 2016)；Apamin活性由其氨基酸骨架決定，主要通過(guò)阻斷鈣離子激活的鉀通道發(fā)揮作用(Maget-Dana and Ptak, 1997)；Defensin的非膜作用機(jī)制則是降低胞質(zhì)ATP水平以及抑制細(xì)胞呼吸(Maget-Dana and Ptak, 1997)；Melittin在抗腫瘤方面也體現(xiàn)了其非膜作用機(jī)制，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移以及通過(guò)調(diào)節(jié)半胱天冬酶(Caspase)、Ca2+濃度、死亡受體(DRs)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖(Adadeetal., 2013; Jamasbietal., 2016)。

4 影響抗菌肽表達(dá)的因素

在蜜蜂的免疫系統(tǒng)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種信號(hào)通路：Toll通路、Imd通路、JAK/STAT通路和JNK通路。信號(hào)通路之間相互關(guān)聯(lián)，一種信號(hào)通路可以激活另一種通路的一部分。Toll信號(hào)通路被革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌激活，細(xì)菌的肽聚糖被蜜蜂肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRPs)識(shí)別后，絲氨酸蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)將pro-Spaetzle分裂成Spaetzle，使其成熟并與膜Toll受體結(jié)合。在這個(gè)信號(hào)通路中，調(diào)節(jié)蛋白也參與其中，如Myd88、Pelle和Tube，隨后Cactus(類似于哺乳動(dòng)物的I-κB)降解和Dorsal(類似于哺乳動(dòng)物的NF-κB)移位進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致抗菌肽(AMPs)的產(chǎn)生(Brutscheretal., 2015)。在蜜蜂中，Imd途徑更為保守，其信號(hào)通路的激活，都是在PGRPs識(shí)別細(xì)菌后開始的。PGRPs識(shí)別細(xì)菌后，Imd通路激活，caspase-Dredd降解抑制劑kB(Kenny)，與NF-κB相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，此級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端便是抗菌肽的產(chǎn)生(Brutscheretal., 2015)。

蜜蜂抗菌肽的表達(dá)會(huì)受到其它外界因素的影響，尤其是農(nóng)藥殘留和食物中人為添加的其它物質(zhì)。例如，益生菌對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的免疫就會(huì)產(chǎn)生影響(Mudroňováetal., 2011)，飼喂了短乳桿菌Lactobacillusbrevis的西方蜜蜂的Abaecin和Defensin-1的表達(dá)顯著增加(Maru?cˇákováetal., 2020)，而缺少腸道微生物的蜜蜂，這兩種抗菌肽的表達(dá)都顯著低于腸道菌群正常的蜜蜂(Wuetal., 2020)；用0.1%蜂膠添加在花粉替代日糧中會(huì)顯著提高蜜蜂體內(nèi)Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin和Defensin這4種抗菌肽的表達(dá)(Turcattoetal., 2018)；一定濃度的多菌靈均顯著抑制西方蜜蜂中Apidaecin和Hymenoptaecin的表達(dá)(Shietal., 2018)；吡蟲啉則會(huì)影響Apidaecin、Hymenoptaecin和Defensin-1 3種抗菌肽在西方蜜蜂中的表達(dá)(Tesovniketal., 2019b)；抗生素的添加，也會(huì)影響蜜蜂中抗菌肽相關(guān)基因的表達(dá)(Lietal., 2017a)。除此之外，不同蜂種對(duì)于不同外源物的侵染時(shí)這些抗菌肽的表達(dá)也有差異，例如當(dāng)美國(guó)幼蟲病侵染東方蜜蜂時(shí)，Apidaecin、Abaecin、Hymenoptaecin和Defensin這4種抗菌肽的表達(dá)要顯著高于西方蜜蜂(Andrikopoulos and Cane, 2018)。

5 蜜蜂抗菌肽的應(yīng)用

當(dāng)前，抗菌肽在醫(yī)藥(Narayanaetal., 2015; Shinetal., 2016; Yuanetal., 2019)、水產(chǎn)養(yǎng)殖(Zhaietal., 2016; 蘇保元, 2017; Suetal., 2019)、畜牧養(yǎng)殖(Xiongetal., 2014; Yangetal., 2015; 朱宇旌等, 2016)、食品保鮮(Rivasetal., 2014; 賈英民等, 2017; Portoetal., 2017)以及化妝品(Pickartetal., 2015; Parketal., 2016; Halimetal., 2016)等方面都有著廣泛的應(yīng)用。蜜蜂抗菌肽的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：

5.1 蜜蜂抗菌肽合成及改造

抗菌肽的獲取主要有3種方法：(1)傳統(tǒng)上，尋找新的抗菌肽涉及從天然來(lái)源的APMs的鑒定，隨后設(shè)計(jì)合成肽類似物進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究；(2)利用基因重組的生物技術(shù)發(fā)酵表達(dá)重組抗菌肽；(3)從頭設(shè)計(jì)肽的方法則包括高通量組合文庫(kù)篩選、基于結(jié)構(gòu)的活性關(guān)系、預(yù)測(cè)算法和將非編碼修飾引入傳統(tǒng)肽(Rotem and Mor, 2009; Blondelle and Lohner, 2010)。蜜蜂抗菌肽的合成與人工設(shè)計(jì)、改造已取得了一定的進(jìn)展。

Apidaecin在食品級(jí)乳酸菌中已經(jīng)被成功表達(dá)，大大方便了人們對(duì)其的研究(Zhouetal., 2008)。Casteels等人也證明通過(guò)干預(yù)Apidaecin的可變區(qū)域，可以改變Apidaecin的抗菌譜，甚至可以消除微生物的抗藥性(Casteelsetal., 1994)。Kolano等人對(duì)Apidaecin進(jìn)行優(yōu)化，大大提高了其對(duì)大腸桿菌、綠通假單胞菌的活性，對(duì)大腸桿菌的MIC從優(yōu)化前的8 mg/L，優(yōu)化后僅為2 mg/L(Kolanoetal., 2020)。Abaecin也可以在大腸桿菌和植物葉綠體等原核系統(tǒng)中表達(dá)，對(duì)其C-端修飾后的衍生物29-aa-long抗菌效果達(dá)到Abaecin 2～3倍(Kimetal., 2019)。東方蜜蜂Hymenoptaecin也成功地在pGEM-T載體上克隆并表達(dá)，其結(jié)構(gòu)與西方蜜蜂的Hymenoptaecin十分相似(Choietal., 2010)。根據(jù)西方蜜蜂Hymenoptaecin序列，Gao等設(shè)計(jì)并合成了1～33位點(diǎn)和34～98位點(diǎn)的肽，HLD-n和HLD-c，發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出了比原肽更好的抗細(xì)菌活性(Gao and Zhu, 2010)。對(duì)通過(guò)對(duì)蜜蜂Hymenoptaecin的末端序列分析表明，N-端阻斷的可能進(jìn)一步提高Hymenoptaecin的抗菌能力，為Hymenoptaecin人工設(shè)計(jì)改造提供了一定的方向(Ratzkaetal., 2012)。由于大多數(shù)膜翅目昆蟲的毒液均可引起其他生物機(jī)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，其中，蜂毒過(guò)敏的概率為5%(Antolín-Amérigoetal., 2014)，且臨床報(bào)道蜂毒注射液有溶血和過(guò)敏反應(yīng)(楊森林和肖雪, 2018)。因此改良蜂毒肽，降低其對(duì)其它生物的毒性也是利用蜂毒作為抗菌制劑的重要步驟，也是蜂毒肽研究中最為主要的部分。例如一個(gè)由18個(gè)氨基酸組成的一種蜂毒肽的衍生肽—Melectin，在保留原肽對(duì)耐藥性細(xì)菌抑制效果的同時(shí)，還大大減少了其溶血活性，拓寬了原肽的使用范圍(Koetal., 2020)。盡管蜂王漿抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒副作用，但其抗菌譜較窄，抗菌效果與蜂毒肽相比也較弱。為此，Kim等人根據(jù)蜂王漿主蛋白AcMRJP4設(shè)計(jì)的一種細(xì)胞外機(jī)制的抗菌肽—AcMRJP4-15，并在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中重組表達(dá)了該抗菌肽?？咕钚詼y(cè)定發(fā)現(xiàn)AcMRJP4-15對(duì)細(xì)菌、真菌和酵母菌的細(xì)胞壁均能造成損傷，不僅活性高于原抗菌肽，也降低了其生產(chǎn)成本，有望成為一種有效的抗菌制劑(Kim and Jin, 2019)。Royalisin-D是一種由蜂王漿抗菌肽Royalisin去除其11個(gè)氨基酸殘基改造而來(lái)，其抗菌活性與原肽類似，此研究不僅證明了Royalisin的活性主要與其結(jié)構(gòu)中的二硫鍵有關(guān)，還在保留其活性的前提下降低了肽的長(zhǎng)度，為降低其生產(chǎn)成本打下了一定的基礎(chǔ)(Katarinaetal., 2015)。

5.2 蜜蜂抗菌肽在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

Knappe等人首次成功地利用滲透泵持續(xù)皮下輸注來(lái)輸送抗菌肽，在感染部位與給藥途徑明顯分離的情況下，同樣證明了Apidaecin類似物具有作為新型抗生素的潛力(Knappeetal., 2019)；Bucekova等人用免疫化學(xué)方法檢測(cè)并克隆了西方蜜蜂Defensin-1，重組表達(dá)的Defensin-1可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌MMP-9，促進(jìn)未感染切除傷口的再上皮化和傷口閉合(Bucekovaetal., 2017)。西方蜜蜂Defensin對(duì)傷口病原菌有著較好的抑制作用，能顯著降低金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物膜內(nèi)的活性，此外對(duì)于有著極強(qiáng)抗生素抗藥性的糞腸球菌，蜜蜂Defensin對(duì)其生物膜形成也有顯著影響，但尚不能有效抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)。蜂毒肽在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用研究比較多，因?yàn)槠渚哂幸种坪艘蜃?κB的作用，而這些途徑的最終作用是釋放細(xì)胞外介質(zhì)或血管中的促炎分子，如炎性細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子(TNF)、一氧化氮(NO)或前列腺素E2(PGE2)等，這些分子會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生炎癥作用，因此蜂毒肽已經(jīng)在抗炎癥上取得了廣泛的應(yīng)用(Lee G and Bae H, 2016; Leeetal., 2020)。而最新的研究表明蜂毒肽可以參與病毒包膜或衣殼蛋白之間的相互作用，而將納米技術(shù)用于蜂毒肽后證明其能夠抑制HIV-1NLHX和HIV-1NLYU2病毒株的傳染性，并使病毒包失活，故在抗病毒方面有著廣闊的應(yīng)用(Hoodetal., 2013; Shietal., 2016; Memarianietal., 2020)。此外在醫(yī)療上，蜂毒肽還可用于抗癌(Gajski and Garaj-Vrhovac, 2013)、降血糖(Hossenetal., 2017)、抗病原微生物(Memarianietal., 2019)、抗HIV(Shietal., 2016)以及作為佐劑(Bramwelletal., 2003)等。

5.3 蜜蜂抗菌肽的其他應(yīng)用

抗菌肽不僅在醫(yī)療行業(yè)運(yùn)用廣泛，其在食品、化妝品等多個(gè)行業(yè)都有著廣泛的應(yīng)用，但蜜蜂抗菌肽在這些方面研究較少。在養(yǎng)殖方面，添加Apidaecin改良肽Api-PR19可顯著提高肉雞法氏囊器官指數(shù)和H9亞型抗體水平，抑制腸道有害菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)雞的腸道菌群，改善腸道的發(fā)育、吸收和免疫功能(Wuetal., 2020)。

6 展望

蜜蜂是世界上最重要的授粉昆蟲，全球三分之一的食物與蜜蜂授粉密切相關(guān)(Aizenetal., 2008)?？梢哉f(shuō)蜜蜂與人類的存亡息息相關(guān)，而影響蜜蜂健康的因素有很多，其中包括病原體、農(nóng)藥、營(yíng)養(yǎng)條件、氣候變暖、電磁波以及人類活動(dòng)等等(Goulsonetal., 2015; Ravoetetal., 2015; Calatayud-Vernichetal., 2017)，蜜蜂依靠自身免疫抵御大部分的不良影響，因此研究蜜蜂抗菌肽有助于解析蜜蜂免疫反應(yīng)的過(guò)程以及蜜蜂抗菌肽基因的進(jìn)化方式，有助于人為的提升蜜蜂的免疫能力，減緩蜜蜂正在減少的趨勢(shì)，維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。除此之外，蜜蜂作為昆蟲膜翅目中較具有代表性的昆蟲之一，其本身抗菌肽資源豐富，抗菌效果強(qiáng)，還具有十分廣闊的運(yùn)用前景。

隨著近年來(lái)抗生素的廣泛使用，各種致病微生物對(duì)抗生素抗藥性越來(lái)越強(qiáng)，新型抗菌制劑的開發(fā)也變得越來(lái)越重要，而抗菌肽以其分子質(zhì)量較小、不易產(chǎn)生抗藥性、具有熱穩(wěn)定性、抗菌譜廣、水溶性好以及通常對(duì)正常細(xì)胞沒有明顯毒副作用等優(yōu)勢(shì)成為了新型抗菌制劑中十分重要的一員。而解析抗菌肽的作用機(jī)制，以及對(duì)抗菌肽進(jìn)行進(jìn)一步改造(拓展其抗菌譜，降低其對(duì)于哺乳動(dòng)物活性)是抗菌肽應(yīng)用的重要前提。但蜜蜂抗菌肽中，對(duì)于蜜蜂天然免疫抗菌肽的作用機(jī)制，尤其是幾種抗菌肽的協(xié)同研究以及對(duì)蜜蜂天然免疫抗菌肽進(jìn)一步改造的研究目前還尚少，應(yīng)用方面也尚沒有研究將蜜蜂抗菌肽運(yùn)用在養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)上。因此改造蜜蜂抗菌肽，解析蜜蜂抗菌肽的作用位點(diǎn)減少合成成本，將蜜蜂抗菌肽與其他抗菌物質(zhì)相結(jié)合，組成更為有效的混合劑型并探究其作用原理，不僅能拓寬我們對(duì)蜜蜂甚至昆蟲抗菌肽的認(rèn)知，同時(shí)還能對(duì)新的綠色抗菌制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和研究方向。