臧偉偉，齊文革，楊 賀，張玉敏

輸血可能傳播乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，感染人體可出現(xiàn)慢性肝炎、肝硬化和肝癌等疾病，對血液使用安全提出了更高的要求[1]。以往，我國主要采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測無償獻(xiàn)血人群HBV感染情況。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟和發(fā)展，核酸檢測(nucleic acid testing，NAT)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于HBV篩查，并發(fā)現(xiàn)血液樣本存在ELISA檢測HBsAg陰性而NAT檢測陽性情況[2]。臨床上將這種HBsAg陰性但HBV DNA陽性的感染稱為隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)，屬于HBV感染的特殊類型，也可經(jīng)輸血或血制品等途徑傳播。OBI可在機體處于免疫抑制狀態(tài)或免疫功能低下時促使HBV活化，造成肝損傷。在無償獻(xiàn)血人群中，可能存在一定的OBI流行[3]。由于全球各地檢測血清HBV DNA方法、病毒流行性和人口學(xué)特征存在差異，目前仍無法明確OBI的流行病學(xué)特征[4]。為確保用血安全，降低HBV輸血感染風(fēng)險，本研究對無償獻(xiàn)血人群中的OBI者展開調(diào)查，并進(jìn)行血清學(xué)和分子生物學(xué)特征分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 血清樣本來源 2021年1月～2021年12月于我站采集的無償獻(xiàn)血者血液樣本107397份，男性57146例，女性50251例；年齡為19～55歲，平均年齡為(35.2±5.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)獻(xiàn)血者符合國家衛(wèi)生部、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布的《獻(xiàn)血者健康檢查要求(GB 18467-2011)》的規(guī)定[5]；(2)獻(xiàn)血前均經(jīng)血清HBsAg和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶初篩合格；(3)符合《赫爾辛基宣言》及其附錄準(zhǔn)則中的倫理學(xué)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)獻(xiàn)血者近期有服藥史；(2)標(biāo)本存在溶血或脂血；(3)未能在4 h內(nèi)完成NAT檢測。

1.2 血清HBsAg檢測 采用ELISA法檢測2次血清HBsAg(廈門英科新創(chuàng)科技有限公司和上?？迫A生物工程股份有限公司)；采用PCR法對兩次ELISA檢測血清HBsAg均陰性樣本進(jìn)行HBV DNA檢測(上?？迫A生物工程股份有限公司)；使用瑞士羅氏公司的Cobas e601全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測血清HBV DNA陽性樣本HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗HBe和抗-HBs；使用中國賽默飛世爾科技有限公司的Step One Plus實時熒光定量PCR分析儀測定OBI樣本HBV DNA載量；采用熒光PCR法檢測OBI樣本HBV基因分型(廈門泰普生物科學(xué)有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 血清HBsAg檢測情況 在107397例無償獻(xiàn)血人群血清中，兩次ELISA法檢測HBsAg均為陰性樣本106953例，至少1次HBsAg陽性樣本444例；在兩次ELISA法檢測HBsAg均為陰性的樣本中，經(jīng)NAT檢測HBV DNA陽性34例，經(jīng)再次血清標(biāo)志物檢測后HBsAg陽性3例，判為無癥狀慢性感染，血清學(xué)標(biāo)志物檢測均陰性2例，判為窗口期感染，血清抗-HBs、抗-HBe或抗-HBc陽性29例，確認(rèn)為OBI。OBI感染率為0.27‰(29/106953/1:3688)。

2.2 OBI樣本血清學(xué)模式分布情況 見表1。

表1 29例OBI患者血清學(xué)模式(%)分布情況

2.3 不同年齡、性別和獻(xiàn)血次數(shù)人群OBI感染率比較 自19～55歲的各年齡段獻(xiàn)血人群均存在OBI感染情況，OBI感染率自0.09‰～0.41‰不等；19～29歲年齡段獻(xiàn)血人群OBI感染率最低，50～55歲年齡段獻(xiàn)血人群OBI感染率最高，且該年齡段重復(fù)獻(xiàn)血者OBI感染率占比較高(表2)。

表2 不同年齡、性別和獻(xiàn)血次數(shù)人群OBI感染率[n(‰)]比較

2.4 不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者血清病毒載量和基因分型比較 血清抗-HBs/抗-HBc陽性和抗-HBs/抗-HBe/抗-HBc陽性O(shè)BI獻(xiàn)血者病毒載量>1000 IU/mL的比率顯著多于僅血清抗-HBc陽性者(P<0.05，表3)；不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者HBV基因分型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表3 不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者血清病毒載量[n(%)]比較

表4 不同血清學(xué)模式OBI獻(xiàn)血者HBV基因分型[n(%)]比較

3 討論

OBI指人體血清HBsAg陰性，但血清或肝組織可檢測到HBV DNA陽性的一種HBV感染。在處于免疫抑制狀態(tài)的人群、HBV感染恢復(fù)人群、獻(xiàn)血者、慢性肝病患者均可存在OBI[6]。OBI能夠增加輸血、器官移植、血液透析等患者感染HBV的風(fēng)險，誘導(dǎo)免疫抑制群體HBV二次激活，引發(fā)急性或慢性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌等疾病[7]。本研究采用ELISA法檢測聯(lián)合NAT技術(shù)對無償獻(xiàn)血人群血液樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示血清HBsAg陰性仍可能系窗口期感染可能。在血清抗-HBc陽性的29例人群被確認(rèn)為OBI，其感染率為0.027%(1∶3688)，遠(yuǎn)低于西非國家感染率(1：67)[8]，也低于國內(nèi)韶關(guān)地區(qū)(1∶1126)[9]或常州地區(qū)(1∶1216)[10]的感染率。目前，OBI在不同地區(qū)的感染率存在較大差異的原因可能與各地區(qū)的人口學(xué)特征及HBsAg檢測手段的靈敏度不一致有關(guān)[11]。

研究表明，OBI可伴有抗-HBc、抗-HBs、抗-HBe陽性，其中抗HBc與HBV的自然感染有關(guān)，半衰期長，可在血清中保持長期穩(wěn)定狀態(tài)，出現(xiàn)于人群HBV感染的全過程，被認(rèn)為是OBI血清學(xué)的一種重要特征，常作為OBI的常規(guī)檢測標(biāo)志物[12,13]。本研究顯示，抗-HBc陽性例數(shù)最多，占比為35.3%；其次為抗-HBc陽性/抗-HBe陽性或抗-HBc陽性/抗-HBs陽性，占比分別為23.5%和17.7%；抗-HBc陽性/抗-HBs陽性/抗-HBe例數(shù)最少，占比為8.8%，與深圳地區(qū)[14]調(diào)查結(jié)果較為一致，說明抗-HBc陽性在診斷OBI方面具有重要的提示作用，需重視對此指標(biāo)的檢測和分析，可在窗口期感染篩查或?qū)o償獻(xiàn)血人群進(jìn)行追蹤調(diào)查時使用該指標(biāo)，以了解HBV感染的血清學(xué)狀態(tài)。研究表明，獻(xiàn)血人群血清抗-HBc單獨陽性者居多，其存在與HBV的再激活密切相關(guān)[15]?？?HBc陽性/抗-HBe陽性/抗-HBs陽性血清學(xué)模式在OBI人群中的占比最低，說明OBI人群存在三種抗HBV抗體同時存在的情況，其血液作為血制品仍具有傳播HBV的風(fēng)險。血清抗-HBs是一種保護性抗體，可與人體內(nèi)其他免疫機能共同發(fā)揮作用清除HBV感染?？?HBe則是判斷HBV復(fù)制活躍性的指標(biāo)，兩者同時存在提示OBI感染者可能存在HBV免疫逃亡情況[16]。本研究中，19～29歲年齡段的獻(xiàn)血人群OBI感染率最低，50～55歲年齡段的獻(xiàn)血人群OBI感染率最高且該年齡段重復(fù)獻(xiàn)血者OBI感染率占比較高，提示獻(xiàn)血人群長期反復(fù)暴露在HBV易感環(huán)境中是引起OBI的主要因素。低年齡段群體OBI感染率低的原因也可能與該群體接受了乙肝疫苗的計劃免疫接種有關(guān)，疫苗的接種降低了該年齡段獻(xiàn)血者HBV感染風(fēng)險[17]。

研究發(fā)現(xiàn)，人體血清HBV DNA載量呈低水平狀態(tài)是OBI獻(xiàn)血人群最為顯著的特征。由于血液檢測靈敏度不穩(wěn)定或HBV基因組S區(qū)出現(xiàn)變異可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，OBI可能存在漏診風(fēng)險，通過對其他血清學(xué)標(biāo)志物及病毒載量的研究，可進(jìn)一步了解HBV感染模式，提高OBI的診斷率[18]?；诖?，本研究采用實時熒光PCR技術(shù)進(jìn)一步對OBI人群血清病毒水平進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示可定量的OBI獻(xiàn)血者病毒載量一般不超過100 IU/mL，證實OBI獻(xiàn)血人群存在低水平HBV DNA的結(jié)論?？?HBc陽性/抗-HBs陽性或抗-HBc陽性/抗-HBs陽性/抗-HBe陽性血清學(xué)模式的OBI獻(xiàn)血者病毒載量大于1000 IU/mL的比率顯著高于抗-HBc陽性者，此情況可能為HBV基因的S區(qū)逃逸突變或啟動子突變所致[19]。此外，有8例樣本未檢測出病毒載量，可能因?qū)崟r熒光定量PCR檢測受限而產(chǎn)生假陰性結(jié)果，也可能是獻(xiàn)血者本身真陰性而NAT檢測結(jié)果為假陽性造成的[20]。本研究尚未對上述樣本采取進(jìn)一步HBV DNA檢測及追蹤樣本的感染情況，會在后續(xù)研究中開展這些調(diào)查分析。本研究還顯示，OBI獻(xiàn)血者HBV C型基因感染占比為62.1%，B型基因感染占比為27.6%，未能分型占比為10.3%，與我國HBV基因型分布特征一致。一般認(rèn)為，我國南方地區(qū)以B型感染為主，北方地區(qū)以C型感染為主[21]。

綜上所述，血清HBsAg陰性樣本可能存在OBI，低年齡段獻(xiàn)血人群OBI感染率較低，OBI獻(xiàn)血人群的血清學(xué)表現(xiàn)模式以抗-HBc陽性為主，病毒載量呈低水平狀態(tài)，HBV基因型中以C型感染占比多。結(jié)合上述特征，針對當(dāng)前備受關(guān)注的HBV殘存感染風(fēng)險問題，若引入血清抗-HBc檢測，有可能大幅降低輸血感染HBV風(fēng)險，保證了用血的進(jìn)一步安全。