焦 誼，劉志鳳，于天源*，張英琦，劉 迪,2，王厚融，徐亞靜，官 乾

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078)

發(fā)熱作為兒科常見的癥狀之一，發(fā)生率為25.7%，每人每年約0.8次[1]。長期發(fā)熱或體溫過高則會損害機體調節(jié)功能，使病情惡化。小兒推拿退熱具有安全性和有效性[2]，其中以開天門[3]、推坎宮[3]、揉太陽[3]、揉耳后高骨[4]、清天河水[5]、推脊[6]手法最為常用。但小兒推拿退熱的最適年齡、最適溫度、最適類型等標準，研究不夠深入。故選取脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）模型模擬臨床細菌性發(fā)熱，選取不同月齡幼兔模擬不同年齡患兒，明確推拿退熱的最適年齡，并進一步選取最適年齡幼兔探究推拿退熱的機理。

視前區(qū)-下丘腦前部（POAH）是體溫調節(jié)的基本中樞，也是最重要的體溫調節(jié)中樞，LPS作為Toll樣受體4（TLR4）公認的配體，能刺激機體產生炎癥反應，核轉錄因子kappaB（NF-κB）參與機體免疫調節(jié)、炎癥反應、感染、細胞周期調控、細胞分化及凋亡等[2]，發(fā)熱過程以炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素IL-1β（interleukin-1β，IL-1β）最為重要，故以退熱六法為例，設計實驗進行深入研究。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級1、3月齡新西蘭雄兔各16只，2月齡新西蘭雄兔24只，肛溫（39.00±0.50）℃，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心[合格證號為SCXK（京）2019-0006]。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗室，溫度（25±0.5）℃，相對濕度（65±5）%，12h/12h明暗周期，自由飲食飲水。適應性飼養(yǎng)3天，排除肛溫波動大于0.4℃的新西蘭兔。隨機將1、3月齡幼兔分為模型組8只、推拿組8只，2月齡幼兔隨機分為正常組8只、模型組8只、推拿組8只。實驗程序經北京中醫(yī)藥大學動物使用和管理委員會批準，符合動物福利與倫理原則。

1.2 主要器材及試劑

1.2.1 主要器材及儀器 MultiSkan3酶標儀（美國THERMO公司）；冷凍離心機（德國EPPENDORF公司）；BL-420N（成都泰盟軟件有限公司）；Bio Drop （Biochrom公 司）；T100TM Thermal Cycler PCR儀、CFX ConnectTMReal-Time System定 量PCR儀、ChemiDoc MP成像儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2.2 主要試劑 大腸桿菌內毒素脂多糖（美國Sigma公司；批號055：B5 L2880）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒、PMSF、RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；TLR4抗體（批號：bs-20594R）、NF-κB p65抗體（批號：bs-0465R）、GAPDH抗體（批號：bsm-0978M）；HRP二抗（批號：ZB-2301、ZB-2305）；高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；HiPure Total RNA Micro Kit（批號：R4114-02）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國THERMO公司；批號：K1622）。

1.3 模型制備

清醒狀態(tài)下，模型組和推拿組耳緣靜脈注射濃度為0.5 μg·mL-1LPS，注射量為1 mL·kg-1，注射后1h內肛溫上升超過0.6℃為造模成功，正常組不予處理[3-4]。

1.4 分組處理

推拿組由推拿學科專業(yè)人員操作，且都為同一人干預。造模后1 h干預1次。1）開天門。定位：兩眉骨內側中點至神庭（前正中線，額頂骨縫交界處）[10]，操作：用拇指自下而上交替直推200次，2 min[11]；2）推坎宮。定位：睛明（內眼角，上下眼瞼交界處）直上至絲竹空（眶上突外端）[10]，操作：用兩拇指橈側自眉心向眉梢做分推200次，2 min[11]；3）揉太陽。定位：太陽（外眼角后上方顳窩中）[10]，操作：用兩拇指橈側推運200次，2 min[11]；4）揉耳后高骨。定位：寰椎翼前緣直上方凹陷處[10]，操作：用兩拇指或中指端揉24次掐3下，2 min[11]；5）清天河水。定位：腕橫紋至肘橫紋[10]，操作：用食中指指面自腕推向肘，推500次，5 min[12]。6）推脊。定位：大椎（背中線上，第7頸椎與第1胸椎棘突間）至尾根[10]，操作：用食中二指自上而下直推300次，作5 min[11]。正常組和模型組正常飼養(yǎng)。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 肛溫監(jiān)測 采用BL-420N監(jiān)測肛溫變化。肛溫探頭涂上適量石蠟油，插入肛門固定為5 cm，待穩(wěn)定后讀數，作為幼兔的肛溫，之后每隔20 min記錄1次肛溫，連續(xù)監(jiān)測6 h。

1.5.2 ELISA檢測血漿、下丘腦TNF-α、IL-1β含量選取二月齡幼兔，于造模后3 h（即推拿后2 h）腹主動脈取血5 mL，置于綠色真空采血管中，室內保存20 min內進行離心，4℃ 3 000 r·m-1離心20 min，取上清置于EP管保存，按ELISA試劑盒方法測定血漿、下丘腦中TNF-α、IL-1β含量。

1.5.3 Western Blot檢測下丘腦組織 TLR4、NF-κB p65蛋白表達 選取二月齡幼兔，于造模后3 h腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL·100 g-1），抽取腹主動脈血后取出下丘腦組織約200 mg，將組織分成兩部分，一部分用于提取細胞核蛋白，另一部分提取細胞膜蛋白。BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量。配置10%分離膠和5%濃縮膠，上樣后穩(wěn)定電泳濃縮膠60V、分離膠80 V，冰上電轉100 V 70 min，10%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（TLR4 1:2 000，NF-κB p65 1:2 000，GAPDH 1:2 000）室溫搖床孵育1 h后4℃冰箱過夜，孵育二抗（羊抗兔IgG 1:10 000，羊抗小鼠 IgG 1:10 000），成像儀顯影，Image Lab圖像分析軟件分析目的條帶，定量分析各蛋白條帶灰度值。

1.5.4 PCR檢測下丘腦組織TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA表達按 HiPure Total RNA Micro Kit試劑盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作步驟提取總RNA，逆轉錄成cDNA。GAPDH上游引物：ACTCTGGCAAAGT GGATGTTGTCG,下游引物：CCGTGGGTGG AATCATACTGGAAC；TLR4上游引物：GAGGAG GCTGTTGGTGGAAGTTG；下游引物：GCACACT GAATACTGACACGCTAATG，NF-κB上游引物：GCATCACAGCAGGCGAACTCTC；下游引物：TGCTTCTCGGCTACCACTGACTC，TNF-α上游引物：CGCCATGAGCACTGAGAGTATGATC； 下 游引物：CAGCCACGAGCAGGAAAGAGAAG；IL-1β上游引物：GGCAGGTCTTGTCAGTCGTTGTG，下游引物：GCAGAGGACGGGTTCTTCTTCAAAG。所有cDNA樣品擴增，分別收集內參GAPDH以及目的基因的Cq值，根據2-△△Cq公式計算相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數據錄入SPSS 26.0軟件進行分析，數據符合正態(tài)分布且方差齊性，以均數±標準差（±s）表示，數據均呈正態(tài)分布并且方差齊，以單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間比較，組間兩兩比較以LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 各月齡幼兔模型組肛溫基礎線比較

見圖1、表1。

圖1 各月齡模型組幼兔肛溫曲線圖（±s ）（8只兔/組）

表 1 各月齡模型組幼兔肛溫6 h變化表（±s，n = 8） ℃

表 1 各月齡模型組幼兔肛溫6 h變化表（±s，n = 8） ℃

注：與正常組比較，# P＜0.05；與1月齡模型組比較，△P＜0.05

組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12 1 月齡模型組 39.14±0.33 40.05±0.12# 40.25±0.26# 40.48±0.37# 40.36±0.31# 39.86±0.45# 39.41±0.43 2月齡模型組 39.16±0.23 40.15±0.40# 40.43±0.50# 40.85±0.67# 40.85±0.56#△ 40.54±0.52#△ 39.98±0.49#△3月齡模型組 39.06±0.39 40.20±0.29# 40.35±0.29# 41.03±0.58#△ 40.93±0.57#△ 40.40±0.60#△ 39.89±0.39#△

2.2 1月齡幼兔退熱情況

見表2、圖2。

圖2 1月齡幼兔肛溫變化曲線圖（±s ）

表 2 1月齡幼兔肛溫變化表（±s，n = 8） ℃

表 2 1月齡幼兔肛溫變化表（±s，n = 8） ℃

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型組 39.14±0.33 40.05±0.12# 40.25±0.26# 40.48±0.37# 40.36±0.31# 39.86±0.45# 39.41±0.43推拿組 39.15±0.27 40.21±0.38# 39.23±0.54△ 39.97±0.66#△ 40.10±0.46# 39.60±0.29# 39.42±0.43

2.3 2月齡幼兔退熱情況

見表3、圖3。

圖3 2月齡幼兔肛溫變化曲線圖（±s ）

表3 2月齡幼兔肛溫變化表（±s，n = 8） ℃

表3 2月齡幼兔肛溫變化表（±s，n = 8） ℃

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型組 39.16±0.23 40.15±0.40# 40.43±0.50# 40.85±0.67# 40.85±0.56# 40.54±0.52# 39.98±0.49#推拿組 39.11±0.14 40.08±0.13# 39.54±0.49#△ 39.82±0.58#△ 40.14±0.59#△ 40.06±0.48#△ 39.87±0.42#

2.4 3月齡幼兔退熱情況

見表4、圖4。

圖4 3月齡幼兔肛溫變化曲線圖（±s ）

表4 3月齡幼兔肛溫變化表（±s，n = 8） ℃

表4 3月齡幼兔肛溫變化表（±s，n = 8） ℃

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常組 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型組 39.06±0.39 40.20±0.29# 40.35±0.29# 41.03±0.58# 40.93±0.57# 40.40±0.60# 39.89±0.39#推拿組 39.08±0.14 40.21±0.27# 39.69±0.81#△ 40.11±0.79#△ 40.36±0.58#△ 40.16±0.34# 39.94±0.28#

2.5 3個不同月齡幼兔的退熱情況

見表5。

表5 3個不同月齡幼兔的退熱情況（±s，n= 8）

表5 3個不同月齡幼兔的退熱情況（±s，n= 8）

注：與1月齡比較，# P＜0.05；與2月齡比較，△P＜0.05

不同月齡 造模1 h肛溫/℃ 推拿后最低肛溫/℃ 推拿降低肛溫最大幅度/℃ 推拿抑制發(fā)熱時程/min 1 月齡 40.21±0.38 38.88±0.58 1.33±0.5 57.50±29.15 2 月齡 40.08±0.13 39.28±0.54 0.80±0.51# 192.50±93.77#3 月齡 40.21±0.27 39.47±0.53# 0.74±0.43# 74.29±55.03△

2.6 2月齡幼兔血漿和下丘腦中炎癥因子的表達情況

見表6。

表6 2月齡LPS致熱幼兔血漿和下丘腦中炎癥因子表達情況（±s，n = 8） ng·mL-1

表6 2月齡LPS致熱幼兔血漿和下丘腦中炎癥因子表達情況（±s，n = 8） ng·mL-1

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 血漿下丘腦TNF-α IL-1β TNF-α IL-1β正常組 231.72±8.93 66.48±2.83 228.21±7.02 50.13±3.42模型組 268.00±15.57# 71.50±2.89# 256.13±12.35# 56.38±1.27#推拿組 242.17±6.30△ 66.87±1.83△ 233.24±6.95△ 51.21±2.30△

2.7 2月齡幼兔下丘腦中TLR4/NF-κB p65 蛋白含量表達情況

見圖5、表7。

表7 2月齡LPS致熱幼兔下丘腦TLR4/NF-κB p65含量表達情況（±s，n= 8）

表7 2月齡LPS致熱幼兔下丘腦TLR4/NF-κB p65含量表達情況（±s，n= 8）

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組別 相對灰度值TLR4/GAPDH 細胞核 NF-κB p65/GAPDH正常組 0.25±0.12 0.15±0.07模型組 0.47±0.08# 0.88±0.45#推拿組 0.34±0.13△ 0.29±0.20△

圖5 2月齡LPS致熱幼兔下丘腦TLR4/NF-κB p65條帶圖

2.8 2月齡幼兔下丘腦中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA表達情況

造模后3 h，模型組下丘腦中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA高于正常組（P＜0.05）；推拿組下丘腦中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA低于模型組（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組2月齡下丘腦相關mRNA表達情況

3 討論

3.1 “退熱六法”對不同月齡幼兔的退熱效果

實驗選取1月、2月、3月齡幼兔模擬臨床發(fā)熱易感的3個年齡段[13-14]，即嬰兒期（28天～1歲）、幼兒期（1歲～3歲）、學齡前期（3歲～6歲），從而初步得出小兒推拿退熱的最適年齡。

研究結果發(fā)現，“退熱六法”干預1月齡幼兔降溫幅度最大，2月齡次之；“退熱六法”干預2月齡幼兔降溫最穩(wěn)定，3月齡次之。所以，臨床上年齡越小的退熱效果可能短時間內較好，長時間可能會出現體溫反復，可增加治療次數，對于年齡較大的患兒，降溫效果比較穩(wěn)定，短期降溫效果雖不如1月齡，但體溫波動較小，從整個退熱過程來看，推拿都起到了正向調節(jié)作用。根據結果顯示，選取2月齡幼兔作為后續(xù)研究退熱機制的實驗動物。

3.2 “退熱六法”對LPS致熱幼兔可能的退熱機制

臨床上推拿退熱效果顯著，推拿能下調發(fā)熱患兒外周血清TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子水平[15]。因此，本研究探討了推拿對炎癥性發(fā)熱的影響，結果提示推拿能明顯抑制發(fā)熱體溫，抑制炎癥反應，可能是通過TLR4/NF-κB p65信號通路實現。

根據研究發(fā)現，耳緣靜脈注射0.5 μg·kg-1的LPS，造模后1 h肛溫明顯升高，造模后3 h肛溫達最高峰，與基礎肛溫相比，約上升1.3～2.0℃，隨后肛溫逐漸下降，持續(xù)約6 h，與研究[9]相符。選取“退熱六法”作為干預方式，其中頭面四大手法屬于“和法”，可調節(jié)陰陽，天人相應，天河水倍受歷代醫(yī)者的推崇，均認為清天河水是“清法”的重要代表，在各種熱證下均可施用，脊椎占督脈近三分之二的循行部位，推脊對督脈氣機有調節(jié)作用。

發(fā)熱是體溫調節(jié)系統(tǒng)紊亂的表現，是反應炎癥性疾病的重要標志，TLR4介導的信號轉導參與了慢性和急性炎癥反應[16]，其中TLR4/NF-κB信號通路是引起發(fā)熱的重要傳導途徑[17]。炎性細胞因子能影響免疫反應，并對各種組織或器官造成損傷[18]，TNF-α、IL-1β參與調節(jié)早期免疫反應[19]，是發(fā)熱的關鍵介質。有研究[20]表明注射TNF-α血清抗體只能影響發(fā)熱的早期階段，這與推拿后能即刻降低體溫相似。脂多糖是一種典型內毒素，作為配體可以激活細胞膜上的TLR4，通過一系列反應誘導NF-κB p65入核，啟動下游炎癥反應，上調促炎細胞因子。

綜上所述，“退熱六法”能下調外周血中炎癥因子的表達，同時下調中樞中TLR4的表達，以及細胞核NF-κB p65的表達。說明推拿可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路起到抗炎解熱作用。