楊曉燕，葉偉偉，魏善強，張 龍，黃 俊

（山東勁牛集團股份有限公司，濟南 250000）

0 引言

磷是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)重要化合物的組成元素，在植物的生長、發(fā)育、遺傳、繁殖等生命活動中都具有重要作用，是決定植物的花芽分化、花粉發(fā)育的重要因素，也是生殖生長與營養(yǎng)生長所必須的元素。土壤中含有豐富的含磷物質(zhì)，它們主要以穩(wěn)定的鋁硅酸鹽和磷灰石狀態(tài)存在[1]，95%以上的磷很難被植物直接吸收利用[2]，而能被植物直接吸收利用的有效態(tài)無機磷很低，一般只占全磷量的2%～3%[3]。為了保持農(nóng)作物的產(chǎn)量人們大量地使用化學肥料來給予土壤充足的養(yǎng)分，隨著時間的積累，反而使土壤惡化狀況更加嚴重，人們不得不開始尋找新的方法解決土壤問題。自然界中有些微生物具有解磷功能，可釋放出土壤中固定態(tài)無效磷，這樣不僅能夠增加作物磷素吸收量，提高作物產(chǎn)量，還能大大提高磷肥利用率，減少農(nóng)業(yè)化學污染。因此，使用解磷菌菌肥是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)綠色持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)是一種植物根系促生細菌[4]，是有益菌，具有對環(huán)境和人畜無害等特點，是微生物肥料中的常用菌種之一；具有解磷功能，對卵磷脂、土壤中植物無法直接吸收利用的有機磷、無機磷有明顯的分解作用，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)[5]，可以提高土壤肥力[6-7]，增加作物的產(chǎn)量[8-9]。20世紀30年代，蘇聯(lián)科學家從土壤里分離到了一株可以解磷的巨大芽孢桿菌，開始投入生產(chǎn)并進行相關研究。而巨大芽孢桿菌具體的解磷機制、作用效果、發(fā)酵方法等領域的研究，近幾十年才進行的比較深入。常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基多采用玉米粉、豆粕粉及其他農(nóng)副產(chǎn)品等[10-11]作為主要原料，培養(yǎng)條件一般為溫度30℃左右，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min左右，初始pH 7.0～8.0等[12-13]，有效活菌數(shù)在10×108cfu/mL左右，但是在工業(yè)生產(chǎn)過程中，由于發(fā)酵條件的放大，不同菌株間的差異性，液體發(fā)酵極易被污染，且有效活菌數(shù)不穩(wěn)定，達不到實驗室水平，不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需要。本文主要研究從土壤中分離的一株巨大芽孢桿菌，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，對其進行中試試驗，并對其解磷機制進行研究，為巨大芽孢桿菌應用到生產(chǎn)實踐中提供強有力的理論基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium)，實驗室前期篩選。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基和初始培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，酵母粉0.5%，蒸餾水1000 mL）。

1.2.2 無機磷培養(yǎng)基 葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H20 0.3 g、NaC1 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、Ca3(PO4)25 g、蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.2.3 有機磷培養(yǎng)基 葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaC1 0.3 g、KC1 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、卵磷脂2 g、CaCO35 g、蒸餾水1 L，pH 7.0[14]。

1.3 巨大芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.1 不同碳源對有效活菌數(shù)的影響試驗 選用不同的碳源，分別以糖蜜、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、可溶性淀粉和麩皮代替酵母粉作為碳源，其濃度均為10 g/L，配方中其他成分同原始發(fā)酵培養(yǎng)基。接種量為2%，裝液量為20%，搖床30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，達到芽孢率95%后，利用平板計數(shù)法[15]測定發(fā)酵液中有效活菌數(shù)，比較不同碳源對有效活菌數(shù)的影響。

1.3.2 不同氮源對有效活菌數(shù)的影響試驗 選用不同的氮源，分別以豆粕粉、硫酸銨、尿素、牛肉膏、硝酸鉀和蛋白胨代替胰蛋白胨作為氮源，其濃度均為10 g/L，配方中其他成分同原始發(fā)酵培養(yǎng)基。其他發(fā)酵條件為：接種量為2%，裝液量為20%，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min振蕩培養(yǎng)，達到芽孢率95%后，利用平板計數(shù)法測定發(fā)酵液中有效活菌數(shù)，比較不同氮源對有效活菌數(shù)的影響。

1.3.3 不同無機鹽對有效活菌數(shù)的影響試驗 選用不同的無機鹽，分別為硫酸錳、碳酸鈣、硫酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂和氯化鈣作為無機鹽，其濃度均為0.5 g/L，配方中其他成分同原始發(fā)酵培養(yǎng)基。其他發(fā)酵條件為：接種量為2%，裝液量為20%，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min振蕩培養(yǎng)，達到芽孢率95%后，利用平板計數(shù)法測定發(fā)酵液中有效活菌數(shù)，比較不同無機鹽對有效活菌數(shù)的影響。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 為了進一步確定單因素中各因素的發(fā)酵最適濃度，進行正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件（表1）。

表1 L9(33)正交設計編碼值及水平 g/L

1.3.5 初始pH對有效活菌數(shù)的影響試驗 選擇pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，其他發(fā)酵條件為：接種量為2%，裝液量為20%，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.3.6 發(fā)酵溫度對有效活菌數(shù)的影響試驗 選擇22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃和36℃作為發(fā)酵溫度，其他發(fā)酵條件為：接種量為2%，裝液量為20%，pH 6.5，轉(zhuǎn)速200 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.3.7 接種量對有效活菌數(shù)的影響試驗 選擇2%、4%、6%、8%、10%和12%作為接種量，其他發(fā)酵條件為：裝液量為20%，溫度30℃，pH 6.5，轉(zhuǎn)速200 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.3.8 轉(zhuǎn)速對有效活菌數(shù)的影響試驗 選擇140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min和220 r/min作為培養(yǎng)轉(zhuǎn)速，其他發(fā)酵條件為：接種量為2%，裝液量為20%，溫度30℃，pH 6.5，振蕩培養(yǎng)。

1.4 巨大芽孢桿菌對磷的降解效果

1.4.1 巨大芽孢桿菌對有機磷的降解效果 用接種環(huán)挑取單菌落接種到50 mL液體LB中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)17 h，以2%的接種量接入有機磷培養(yǎng)基中，對照接入滅活菌液，每組3個平行，接種后，30℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5天，離心機離心，使用鉬銻抗比色法測定上清液中有效磷含量[16-17]。每天測量記錄有效磷濃度。

1.4.2 巨大芽孢桿菌對無機磷的降解效果 用接種環(huán)挑取單菌落接種到50 mL液體LB中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)17 h，以2%的接種量接入無機磷培養(yǎng)基中，對照組接入滅活菌液，每組3個平行，接種后，30℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5天，離心機離心，使用鉬銻抗比色法測定上清液中有效磷含量。每天測量記錄有效磷濃度。

1.5 田間試驗驗證巨大芽孢桿菌對土壤的解磷效果

1.5.1 試驗設計 試驗田設2個處理，重復3次，小區(qū)面積45 m2，隨機排列，小區(qū)設立保護行1.5 m；在剛施入肥料和菌劑時和處理完成2周時對土壤分別進行取樣，測定其有效磷含量；施入肥料和菌劑2周，種植番茄。具體處理如下：

處理1：常規(guī)施肥；

處理2：常規(guī)施肥+微生物菌劑（巨大芽孢桿菌20億/g）(600 kg/hm2)。

1.5.2 土壤有效磷的測定方法 采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對有效活菌數(shù)的影響試驗 不同碳源對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響，如圖1所示，糖蜜、玉米粉、麩皮作為巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源比較好，其活菌數(shù)均高于5×108cfu/mL，明顯高于對照組有效活菌數(shù)3×108cfu/mL。結(jié)果表明巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵的最佳碳源是麩皮，其次是糖蜜。麩皮價格不僅遠遠低于糖蜜且易獲得，考慮到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的成本問題，選用麩皮作為巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵的碳源。

圖1 碳源對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.2 不同氮源對有效活菌數(shù)的影響試驗 不同氮源對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響，如圖2所示，豆粕粉、牛肉膏、硝酸鉀、蛋白胨作為巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源比較好，其活菌數(shù)均高于6×108cfu/mL，明顯高于對照組有效活菌數(shù)3.8×108cfu/mL。結(jié)果表明巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵的最佳碳源是豆粕粉和牛肉膏，其次是硝酸鉀和蛋白胨。使用豆粕粉作為氮源，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)增加最多，且其價格比牛肉膏便宜，故選用豆粕粉作為巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵的氮源。

圖2 氮源對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.3 無機鹽對有效活菌數(shù)的影響試驗 不同無機鹽對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響，如圖3所示，可以看出硫酸錳、碳酸鈣、硫酸鉀和磷酸氫二鉀作為無機鹽對巨大芽孢桿菌的生長有一定的促進作用，其生長量分別為對照組的6、5、2、1.4倍。其中硫酸銨、硫酸鎂和氯化鈣作為無機鹽對巨大芽孢桿菌的生長有明顯的抑制作用。雖然碳酸鈣比硫酸錳價格便宜，但因其不易溶于水，產(chǎn)生沉淀，可操作性差，且化學狀態(tài)不穩(wěn)定易分解產(chǎn)生CO2，而生產(chǎn)過程中無機鹽使用量少，其價格對生產(chǎn)成本影響較小，考慮到使用硫酸錳作為無機鹽對巨大芽孢桿菌的生長促進作用最強，故選用硫酸錳作為巨大芽孢桿菌液體發(fā)酵的氮源。

圖3 無機鹽對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.4 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件 利用L9(33)正交表對其進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，麩皮、豆粕粉、MnSO4共3個因素對巨大芽孢桿菌的生長影響較大，故選用這3個因素進行正交實驗。實驗結(jié)果與分析見表2，最佳組合為麩皮5 g/L、豆粕粉10 g/L、MnSO40.5 g/L，主要影響因子為豆粕粉，其次為麩皮，MnSO4對試驗結(jié)果影響較小。根據(jù)方差分析（表3），麩皮、豆粕粉在α=0.05水平上對實驗結(jié)果的影響存在顯著性差異。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

2.1.5 初始pH對有效活菌數(shù)的影響試驗 如圖4所示，隨著pH的增加菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當pH7.0時，巨大芽孢桿菌生長最好，有效活菌數(shù)最高。在pH≤6和pH≥7.5條件下，有效活菌數(shù)明顯下降，說明強酸堿條件不利于巨大芽孢桿菌生長。

圖4 初始pH值對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.6 發(fā)酵溫度對有效活菌數(shù)的影響試驗 如圖5所示，隨著溫度升高，巨大芽孢桿菌的有效活菌數(shù)呈先增加后降低的趨勢，當溫度為30℃時，有效活菌數(shù)最高；而當溫度大于34℃時極易被環(huán)境中其他芽孢桿菌所代替。

圖5 發(fā)酵溫度對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.7 接種量對有效活菌數(shù)的影響試驗 如圖6所示，接種量在2%～6%范圍內(nèi)時，接種量對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)影響不明顯，當接種量為8%時，巨大芽孢桿菌生長最好，有效活菌數(shù)最高。

圖6 接種量對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.8 轉(zhuǎn)速對有效活菌數(shù)的影響試驗 如圖7所示，當轉(zhuǎn)速為200 r/min時，巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)最高，所以最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速設為200 r/min。

圖7 轉(zhuǎn)速對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響

2.1.9 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗證 按優(yōu)化條件上罐，定容至30 L，121℃滅菌30 min，加消泡劑0.15%，用氨水調(diào)pH 7.0，培養(yǎng)溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，當菌數(shù)不再上升，芽孢率達95%以上視為發(fā)酵結(jié)束。巨大芽孢桿菌發(fā)酵26 h基本達到終點，活菌數(shù)達48.0×108cfu/mL，芽孢率達95%以上，芽孢照片如圖8所示。

圖8 巨大芽孢桿菌芽孢照片

2.2 巨大芽孢桿菌對磷的降解效果

2.2.1 巨大芽孢桿菌對有機磷的降解效果 從圖9中可以看出，巨大芽孢桿菌對有機磷卵磷脂的分解能力很強，在巨大芽孢桿菌培養(yǎng)過程中，在1～3天過程中，培養(yǎng)基中有效磷含量上升最快，在第4天時，卵磷脂中的磷被巨大芽孢桿菌分解釋放達到最高值，有效磷的含量為1.67 mg/L，是對照組含量的約26倍，培養(yǎng)后期有效磷含量趨于平穩(wěn)。培養(yǎng)基接入滅活菌液作為對照組，在整個4天的培養(yǎng)過程中，有效磷的含量在

圖9 巨大芽孢桿菌對有機磷的降解效果

2.3 田間試驗驗證巨大芽孢桿菌對土壤的解磷效果

2.3.1 巨大芽孢桿菌對土壤的解磷效果 在剛施入肥料和菌劑時，測得土壤的有效磷含量為132.8 mg/kg；處理完成2周時，測得土壤的有效磷含量為165.3 mg/kg。結(jié)果說明巨大芽孢桿菌對土壤的解磷效果非常明顯，0.065 mg/L左右。

2.2.2 巨大芽孢桿菌對無機磷的降解效果 從圖10中可以看出，巨大芽孢桿菌具有較強的分解Ca3(PO4)2的能力，在整個培養(yǎng)過程中，第1天培養(yǎng)基中的有效磷含量上升最快，在第3天后，巨大芽孢桿菌對Ca3(PO4)2中磷的釋放趨于平穩(wěn)，有效磷的含量約為83 mg/L，是對照組含量的17倍。對照組培養(yǎng)基接入的是滅活菌液，在整個試驗過程中有效磷的含量基本維持在5.0 mg/L左右?？梢悦黠@提高土壤有效磷含量。

圖10 巨大芽孢桿菌對無機磷的降解效果

2.3.2 巨大芽孢桿菌對番茄生物學性狀的影響 處理2與處理1相比，株高增加，葉片濃綠肥厚，單果重明顯增加（見表4）。說明施用巨大芽孢桿菌通過解磷作用能夠明顯提高農(nóng)作物的品質(zhì)，增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。

表4 生物學性狀及品質(zhì)統(tǒng)計表

3 討論

巨大芽孢桿菌是一種功能性有益菌，其對環(huán)境無污染、對植物安全、對人畜無害，受到人們廣泛的關注和系統(tǒng)的研究[18]。同時，具有較強的解磷作用，而磷是植物生長所必需的微量元素，是核酸、磷脂及糖代謝中間產(chǎn)物的重要組成成分，為植物生長發(fā)育提供所能量[19]。20世紀中葉，為了解決農(nóng)作物產(chǎn)量低和土壤缺磷問題，人們開始對巨大芽孢桿菌進行一系列相關研究，并將其作為提高作物產(chǎn)量、土壤有效磷含量的解磷微生物肥料生產(chǎn)使用[20]。

近年來，隨著微生物菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應用，巨大芽孢桿菌以其在土壤中的解磷作用而被深入研究，并將其優(yōu)化培養(yǎng)生產(chǎn)為微生物菌劑使用。解磷微生物進入土壤后定殖在植物根際系統(tǒng)，通過自身的生長繁殖來改善土壤，提高土壤有效磷含量，增加作物產(chǎn)量，所以農(nóng)作物生長過程中使用解磷菌是土壤中無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷的最安全高效的方式之一，可以促進植物的生長發(fā)育，促使植物能夠適應堿化、酸化及缺磷的不良土壤環(huán)境[21-24]。研究發(fā)現(xiàn)，碳源、氮源及Mn2+、Ca2+、K+、NH4+、Mg2+等離子對巨大芽孢桿菌的發(fā)酵具有明顯的影響[25]，能夠促進其生長繁殖和提高芽孢率，但是通常有效活菌數(shù)僅能達到10億左右，芽孢率在90%左右，并且在實際生產(chǎn)時往往低于實驗室水平；而且巨大芽孢桿菌相對敏感，很容易被其他芽孢桿菌污染，在工業(yè)生產(chǎn)中對工藝參數(shù)要求較高，需要各種條件匹配。本研究通過改變培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件對巨大芽孢桿菌的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)使用麩皮可以大幅度提高有效活菌數(shù)及其芽孢率，并且降低工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)污染率，生產(chǎn)成本也能得到極大降低。使用鉬銻抗比色法測定有機磷和無機磷含量研究巨大芽孢桿菌的解磷效果；通過田間試驗也驗證了巨大芽孢桿菌對土壤的解磷效果，番茄使用巨大芽孢桿菌菌劑后，株高增加，葉片濃綠肥厚，單果重明顯增加，說明施用巨大芽孢桿菌通過解磷作用能夠明顯提高農(nóng)作物的品質(zhì)，增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有及其重要的意義。

后續(xù)我們將在前期工作基礎上繼續(xù)深入研究巨大芽孢桿菌的發(fā)酵條件、放大工藝及其制粉工藝，在保證高芽孢率的基礎上獲得最高有效活菌數(shù)，目的是降低工業(yè)生產(chǎn)成本，增加產(chǎn)量；再通過研究巨大芽孢桿菌與其他菌株的拮抗作用，進行菌株間的優(yōu)勢互補，以期開發(fā)出高效復合多功能的系列微生物菌劑，能夠更好地為農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供強有力保障。

4 結(jié)論

本研究通過單因素實驗和正交實驗，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基組成為：麩皮10 g，豆粕粉5 g，氯化鈉10 g，MnSO40.5 g，H2O 1000 mL，pH 7.0，培養(yǎng)溫度30℃，接種量為8%，培養(yǎng)時間26 h，轉(zhuǎn)速200 r/min。主要影響因子為豆粕粉，其次為麩皮，根據(jù)方差分析，麩皮、豆粕粉在α=0.05水平上對實驗結(jié)果的影響存在顯著性差異。采用優(yōu)化條件上罐，30℃培養(yǎng)26 h進入穩(wěn)定期，有效活菌數(shù)48×108cfu/mL，芽孢率達95%以上。本實驗中巨大芽孢桿菌具有較強的解磷能力，在第4天時，巨大芽孢桿菌對卵磷脂中磷的釋放達到最大值，有效磷的含量為1.67 mg/L，是對照組含量的約26倍；在第3天時，巨大芽孢桿菌對Ca3(PO4)2中磷的釋放趨于平穩(wěn)，有效磷的含量約為83 mg/L，是對照組含量的17倍；說明該菌株從有機磷和無機磷中釋放有效磷的效果比較明顯。通過田間試驗也驗證了巨大芽孢桿菌對土壤的解磷效果，在剛施入肥料和菌劑時，土壤的有效磷含量為132.8 mg/kg；處理完成2周時，土壤的有效磷含量為165.3 mg/kg。通過對巨大芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及解磷效果的研究，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠?qū)⑼寥乐泄袒牟灰桌玫牧揍尫艦樽魑锟焖傥绽玫挠行Я?，降低化肥的使用，減少土壤化學污染；為巨大芽孢桿菌的深入研究和工業(yè)化應用提供了強有力的理論依據(jù)。