崔玉瑩，戴繼鴻，李村院，郭 濤，李曉悅，姚 瑞，胡瑞瑞，劉開(kāi)平，米桃桃，倪 偉*，胡圣偉* (.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種以腹瀉、脫水和嘔吐為主要臨床特征的高度傳染性的腸道致死性疾病[1]。PEDV是一種影響所有年齡段豬的腸道病原體，在哺乳仔豬中通常是致命的，發(fā)病率相當(dāng)高，病死率達(dá)80%～100%。在成年豬中，發(fā)病率很高，但病死率低[2]。20世紀(jì)70年代在英國(guó)首次報(bào)道該病，隨后傳播到歐洲和亞洲的其他地區(qū)[3-4]。2010年，我國(guó)在血清學(xué)呈陽(yáng)性的眾多不同地區(qū)的豬場(chǎng)暴發(fā)了PED[5]，發(fā)現(xiàn)了高發(fā)病率的新變異毒株[6]，同時(shí)美國(guó)、加拿大等一些國(guó)家的豬場(chǎng)也未能幸免，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了重大經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV基因組為單鏈RNA，全長(zhǎng)約為28 kb[7]，編碼纖突糖蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、核衣殼蛋白(N)、基質(zhì)蛋白(M) 4種結(jié)構(gòu)蛋白以及其他3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3編碼[8])，其中S蛋白在PEDV感染中起著至關(guān)重要的作用，主要表現(xiàn)在N端S1亞基與受體結(jié)合和C端S2亞基的膜融合[9]。S蛋白是主要的包膜糖蛋白，在S1亞基上含有的核心中和表位(COE)位于S蛋白的499～638位氨基酸處，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PEDV的中和抗體[10]，可被用作抗PEDV的潛在候選免疫原[11]。因此，S蛋白被認(rèn)為是PEDV中和抗體的靶標(biāo)位點(diǎn)。

微折疊細(xì)胞(microfold cell，M細(xì)胞)主要位于腸道相關(guān)淋巴組織(GALT)中派氏結(jié)的濾泡相關(guān)上皮(FAE)、鼻咽相關(guān)淋巴組織(NALT)的淋巴濾泡和結(jié)膜組織的淋巴濾泡中[12-13]。M細(xì)胞的主要作用是將腸腔內(nèi)抗原攝取和胞吞到GALT中，因?yàn)樗鼈兙哂懈咄淌珊桶棠芰?，?fù)責(zé)將抗原快速轉(zhuǎn)運(yùn)到抗原呈遞的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞中[14-15]。隨后，這些樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)歷成熟并激活抗原特異性初始T細(xì)胞，這些T細(xì)胞使B細(xì)胞活化，最終激發(fā)可產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞[16]，誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。M細(xì)胞表面有很多特異性受體，如C5aR[17]、GP2[18]、α(1,2)-Fucose[19]、Claudin 4[20]等，其配體也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。將抗原與黏膜免疫細(xì)胞的配體進(jìn)行融合表達(dá)后就可以借助受體與配體的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抗原準(zhǔn)確地靶向遞送。本試驗(yàn)使用的是M細(xì)胞表面受體C5aR與其配體Col，將Col基因序列連接至PEDV的核心中心表位COE基因序列上，克隆基因COE和COE-Col，構(gòu)建PET-32a(+)-COE和PET-32a(+)-COE-Col重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至表達(dá)載體TransB(DE3)使其誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行純化濃縮，為后續(xù)制備M細(xì)胞靶向的黏膜免疫疫苗提供材料。

1 材料與方法

1.1 菌種、載體和質(zhì)?？寺≥d體菌株DH5α、載體PET-32a(+)、表達(dá)載體菌株TransB(DE3)、pET-28a-COE-DH5α質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑及儀器胰蛋白胨、瓊脂糖、酵母提取物、SDS、丙烯酰胺、NaOH、過(guò)硫酸銨、甘氨酸等均由上海生工生物公司提供；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、DNA純化試劑盒等由北京天根生物科技有限公司提供；EcoRⅠ、XhoⅠ、DNA連接酶等酶由TaKaRa公司提供。

BIORAD凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自BIORAD 公司；PCR 擴(kuò)增儀、微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀、微型離心機(jī)購(gòu)自北京東林昌盛生物公司；超凈工作臺(tái)、ZX-3D 電熱恒溫水槽購(gòu)自金壇科興有限公司；JY600C電泳儀購(gòu)自北京君意東方有限公司。

1.3 方法

1.3.1COE和COE-Col引物的設(shè)計(jì) 利用生物學(xué)軟件DNAMAN 7.0對(duì)自2010年以后國(guó)內(nèi)PEDV流行株S基因的COE(499～638 aa)氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取相對(duì)保守的毒株CH/PDS/2015 (GenBank 登錄號(hào)：KU237224，中國(guó) 河南)，根據(jù)大腸桿菌系統(tǒng)對(duì)密碼子的偏好性，優(yōu)化序列中存在的稀有密碼子，設(shè)計(jì)特異性引物，并在5′末端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和起始密碼子ATG，3′末端引入酶切位點(diǎn)XhoⅠ，獲得了COE-F1和COE-R1沒(méi)有靶向肽的COE基因引物。COE-R2為包含了Col下游引物，COE-R2中的C端與Col序列結(jié)合，再將柔性氨基酸接頭序列(GS)插入到COE基因和Col之間[21]。引物序列見(jiàn)表1(用于克隆的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)以下劃線(xiàn)顯示)，由上海生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(20.0 μL)：2×Taq PCR Master Mix 10.0 μL，模板質(zhì)粒1.0 μL，上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col重組表達(dá)載體的構(gòu)建COE和COE-Col基因克隆后使用DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收并純化，用EcoRⅠ、XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)純化后的目的基因和載體pET-32a(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系見(jiàn)表2，放至37℃水浴鍋中酶切1 h。將酶切產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠鑒定后切膠回收，并將得到的目的基因與載體連接。COE和pET-32a(+)連接體系：10.00 μL SolutionⅠ(酶溶液)，6.46 μL pET-32a(+)，3.54 μLCOE，總體積為20.00 μL 。COE-Col和pET-32a(+)連接體系：10.00 μL SolutionⅠ，6.72 μL pET-32a(+)，3.28 μLCOE-Col，總體積為20.00 μL。在16℃條件下連接4 h。將連接好的2個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至已制好的感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布于含氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.3重組表達(dá)載體的驗(yàn)證 在培養(yǎng)完畢后的平板上挑取陽(yáng)性單克隆菌落至LB液體培養(yǎng)基(Amp+)中，37℃、200 r/min搖至渾濁。(1)菌落PCR：取1 μL搖好的菌液做菌落PCR，反應(yīng)體系和程序與1.3.1相同，再使用1%瓊脂糖凝膠鑒定。(2)雙酶切：經(jīng)菌落PCR鑒定出有條帶的擴(kuò)大培養(yǎng)，小提重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，體系同1.3.2。(3)將經(jīng)菌落PCR和雙酶切都鑒定正確的重組質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.3.4重組COE和COE-Col蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序驗(yàn)證基因序列正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TransB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，將其涂布至含Amp抗性的LB固體平板上過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單菌落，菌液PCR鑒定，將鑒定正確的重組菌株命名為pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)和pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)。

取鑒定正確過(guò)夜培養(yǎng)的pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)和pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)菌液，接種于20 mL含Amp 的液體LB培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm=0.6。按比例加入1‰的誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度達(dá)到1 mmol/L，對(duì)照樣品不加誘導(dǎo)劑，37℃、200 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6 h。

1.3.5重組蛋白可溶性鑒定 將pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)和pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)完成后，在4℃ 條件下，8 000 r/min離心5 min收集所有菌體，棄上清，加入35 mL裂解緩沖液置于4℃過(guò)夜裂解菌體。將過(guò)夜裂解的菌液離心管放入液氮中冷凍5 min，再置于37℃水浴鍋內(nèi)反復(fù)搖晃使其快速融化，如此反復(fù)凍融3次，此時(shí)菌液應(yīng)呈黏稠狀。隨后使用超聲破碎儀對(duì)菌液進(jìn)行超聲，程序設(shè)置為超聲3 s，停2 s，破碎至菌液澄清，超聲時(shí)離心管始終置于冰水混合物中。取超聲破碎后的菌液1 mL，12 000 r/min 離心10 min，分離上清樣品(可溶性蛋白)與沉淀中樣品(包涵體蛋白)，加入蛋白上樣緩沖溶液煮沸處理后，SDS-PAGE 鑒定目的蛋白可溶性表達(dá)情況。

1.3.6重組蛋白的親和純化 向沉淀中加入25 mL 的8 mol/L尿素溶液，置于搖床上室溫過(guò)夜溶解，使用0.45 μm濾膜過(guò)濾。使用GE公司His標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝柱 HisTrapTMFF Crude純化目標(biāo)蛋白，基本步驟如下：使用一次性注射器吸取5倍柱床體積的蒸餾水，緩慢推入蛋白純化預(yù)裝柱內(nèi)， 洗去柱內(nèi)的20%乙醇溶液，推薦流速約為2 mL/min；柱平衡： 5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液平衡柱，流速約為2 mL/min；上樣：吸取過(guò)濾后的蛋白溶液5 mL緩慢推入蛋白純化柱內(nèi)，流速控制在1 mL/min以?xún)?nèi)，當(dāng)推入2 mL蛋白液體后將純化柱置于冰上靜置3～5 min。在此步操作中應(yīng)注意放緩上樣速度，減小因目標(biāo)蛋白未充分與純化柱中的鎳結(jié)合而造成的損失，影響純化效率。雜蛋白洗脫：10 倍柱床體積的結(jié)合緩沖液洗脫雜蛋白，流速約為2 mL/min；目的蛋白洗脫：10倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，流速約為1 mL/min，收集前20 mL洗脫液。

1.3.7脫鹽與復(fù)性 將3 kDa分子截留的透析袋于EDTA-NaHCO3溶液中煮沸10 min，蒸餾水充分清洗后裝入蛋白溶液，透析袋夾封口，放入透析液中透析。透析溶液依次為8，6，4，2 mol/L尿素及1×PBS 緩沖液，每次透析6 h。使用后的透析袋經(jīng)蒸餾水清洗干凈后，保存于20%乙醇溶液中。

1.3.8重組蛋白濃縮及質(zhì)量濃度測(cè)定 蛋白溶液經(jīng)1×PBS緩沖液透析結(jié)束后，將蔗糖撒在透析袋外，待透析袋中剩余液體量適宜時(shí)，即可收集蛋白溶液，分裝至無(wú)菌EP管中，置于-80℃保存?zhèn)溆?。使用康為世紀(jì)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃縮后的重組COE和COE-Col蛋白相對(duì)分子質(zhì)量濃度。

1.3.9重組蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu) 使用在線(xiàn)網(wǎng)站工具Expasyprotparam預(yù)測(cè)重組蛋白的理化性質(zhì)；使用SOPMA預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1COE和COE-Col基因克隆根據(jù)pET-32a(+)載體序列和COE序列引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)COE基因引物。在此基礎(chǔ)上插入靶向肽序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的基因COE和COE-Col，使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。經(jīng)鑒定，得到了約為423(COE)和471 bp(COE-Col)明亮的單一條帶(圖1)，與預(yù)期的2個(gè)目的基因條帶大小相符，表明成功克隆了目的基因。

M.DL1000 DNA Marker； 1.基因COE的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；D1.基因COE的PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照；D2.基因COE-Col的PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照；2.基因COE-Col的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 COE和COE-Col基因的PCR擴(kuò)增

2.2COE、COE-Col和載體pET-32a(+)的酶切使用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)目的基因和載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠結(jié)果顯示，得到了423 bp的COE片段、471 bp的COE-Col片段和5 900 bp的pET-32a(+)載體片段(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；D.未酶切的空載體pET-32a(+)；1～3.pET-32a(+)質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；4～6.基因COE酶切產(chǎn)物；7～9.基因COE-Col酶切產(chǎn)物圖2 COE和COE-Col基因及載體pET-32a(+)的酶切產(chǎn)物

2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定回收酶切后的COE、COE-Col基因與pET-32a (+)載體片段，用SolutionⅠ進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含氨芐抗性的LB固體平板上篩選菌落，隨機(jī)選擇若干單菌落進(jìn)行菌落PCR，并通過(guò)瓊脂糖凝膠鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖3。 其中，pET-32a(+)-COE-DH5α菌落1～3均可擴(kuò)增出約423 bp的目的片段，pET-32a(+)-COE-Col-DH5α菌落4～6均可擴(kuò)增出約471 bp的目的片段。選取3和4號(hào)菌擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，如圖4A中3號(hào)菌得到了約5 900,423 bp 2條片段，圖4B中4號(hào)菌得到了約5 900,471 bp 2條片段，即2個(gè)重組表達(dá)載體中都含有所預(yù)期的目的基因片段。經(jīng)鑒定無(wú)誤的質(zhì)粒交由上海生物工程有限公司測(cè)序，利用DNAMAN將已知的基因序列與測(cè)序結(jié)果比對(duì)，測(cè)序結(jié)果顯示兩者完全一致，證明重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col連接正確，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體。

M.DL1000 DNA Marker；D1.pET-32a(+)-COE菌液PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照；1～3.pET-32a(+)-COE菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；D2.pET-32a(+)-COE-Col菌液PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照；4～6.pET-32a(+)-COE-Col菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖3 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col的菌落PCR鑒定

M.DL1000 DNA Marker；D1.未酶切的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE；1.重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE的雙酶切；D2.未酶切的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE-Col；2.重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE-Col的雙酶切圖4 重組質(zhì)粒pET-32a(+)-COE(A)和pET-32a(+)-COE-Col(B)的雙酶切鑒定

2.4 重組COE和COE-Col蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化將獲得的重組表達(dá)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)并進(jìn)行超聲處理后，離心分離上清與沉淀樣品，通過(guò)SDS-PAGE鑒定，圖5A泳道4的COE沉淀?xiàng)l帶和圖5B泳道4的COE-Col沉淀?xiàng)l帶證明2個(gè)重組蛋白都以包涵體形式表達(dá)，結(jié)果表明pET-32a(+)-COE-TransB(DE3)能表達(dá)出大小約為35 kDa的COE蛋白，pET-32a(+)-COE-Col-TransB(DE3)能表達(dá)出大小約為37 kDa的COE-Col蛋白。利用HisTrapTMFF Crude 親和層析柱純化蛋白，SDS PAGE結(jié)果顯示，成功純化獲得了圖5A泳道5的重組COE蛋白和圖5B 泳道5的重組COE-Col蛋白的單一條帶。將重組COE和COE-Col蛋白純化、復(fù)性及濃縮后通過(guò)BCA法測(cè)定質(zhì)量濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：y=1.234 4x+0.112 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 0，將在酶標(biāo)儀上測(cè)得的D570 nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，計(jì)算得到重組COE蛋白質(zhì)量濃度為1.05 g/L，COE-Col蛋白質(zhì)量濃度為0.64 g/L。

A.重組COE蛋白SDS-PAGE鑒定結(jié)果(M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET-32a(+)-COE；2.誘導(dǎo)的pET-32a(+)-COE；3.pET-32a(+)-COE誘導(dǎo)上清；4.pET-32a(+)-COE誘導(dǎo)沉淀；5.純化的COE蛋白)；B.重組COE-Col蛋白SDS-PAGE鑒定結(jié)果(M.蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET-32a(+)-COE-Col；2.誘導(dǎo)的pET-32a(+)-COE-Col；3.pET-32a(+)-COE-Col誘導(dǎo)上清；4.pET-32a(+)-COE-Col誘導(dǎo)沉淀；5.純化的COE-Col蛋白)圖5 重組COE和COE-Col蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

2.5 重組蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)使用ProtParam工具預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果COE蛋白含有140個(gè)氨基酸，分子式為C686H1022N164O215S4，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為15 134.87，等電點(diǎn)理論值為4.78，平均親水性為0.151，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。COE-Col蛋白有156個(gè)氨基酸，分子式C762H1141N189O236S4，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為16 853.81，等電點(diǎn)理論值為5.82，平均親水性為0.059，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。使用SOPMA預(yù)測(cè)COE蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示其含有5.00% α螺旋，45.00%延伸鏈，2.86% β轉(zhuǎn)角及47.14%無(wú)規(guī)則卷曲(圖6A)；COE-Col蛋白含有4.49% α螺旋，38.46%延伸鏈，2.56% β轉(zhuǎn)角及54.49%無(wú)規(guī)則卷曲(圖6B)，2個(gè)重組蛋白均不易形成β折疊。使用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)重組蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示COE和COE-Col蛋白均主要由無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果相類(lèi)似。

A.重組COE蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果；B.重組COE-Col蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果；紅線(xiàn).延伸鏈；藍(lán)線(xiàn).α螺旋；綠線(xiàn).β轉(zhuǎn)角；紫線(xiàn).無(wú)規(guī)則卷曲圖6 重組COE和COE-Col蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

新生哺乳仔豬由于免疫系統(tǒng)不成熟，感染PEDV后會(huì)出現(xiàn)急性腹瀉等癥狀，還會(huì)使妊娠母豬腹瀉、無(wú)乳和生殖周期異常[22]。PEDV主要通過(guò)豬的腸黏膜進(jìn)入宿主體內(nèi)，在豬小腸的絨毛上皮細(xì)胞中復(fù)制，并且毒株會(huì)不斷變異，可能會(huì)逃逸現(xiàn)有疫苗的預(yù)防體系，因此開(kāi)發(fā)能夠誘導(dǎo)強(qiáng)有力的體液和黏膜免疫反應(yīng)的黏膜疫苗是非常需要的。為了提高疫苗抗原在黏膜免疫組織的傳遞效率，近年來(lái)提出了一種使用M細(xì)胞的靶向黏膜疫苗，以定點(diǎn)靶向性的增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)。利用M細(xì)胞靶向性開(kāi)發(fā)黏膜免疫疫苗已經(jīng)有很多報(bào)道，比如微折疊細(xì)胞依賴(lài)性抗原轉(zhuǎn)運(yùn)并通過(guò)誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫緩解感染性結(jié)腸炎[23]；使用M細(xì)胞表面受體C5aR與其配體Col設(shè)計(jì)口蹄疫靶向疫苗，激發(fā)了局部黏膜免疫應(yīng)答和全身性免疫應(yīng)答[24]；使用M細(xì)胞表面的GP2受體，特異性地與細(xì)菌外膜Ⅰ型菌毛(FimH)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了M細(xì)胞靶向性病毒性心肌炎疫苗，顯著增強(qiáng)了T細(xì)胞免疫應(yīng)答和黏膜IgA的分泌[25]。由此可見(jiàn)，利用M細(xì)胞表面的特異性受體開(kāi)發(fā)靶向性疫苗來(lái)誘導(dǎo)高效的抗原特異性免疫應(yīng)答，提高疫苗的傳遞和利用效率已經(jīng)成為制備黏膜免疫疫苗的一種重要手段。

本試驗(yàn)使用的是PEDV S蛋白中S1區(qū)段的核心中心表位，若使用S2區(qū)段中的某個(gè)中和表位或S2區(qū)段全長(zhǎng)來(lái)表達(dá)蛋白也可以進(jìn)行試驗(yàn)。由于PEDV的S蛋白是一種高度糖基化的蛋白，也是一種三聚體跨膜蛋白，因此本試驗(yàn)所使用的原核表達(dá)系統(tǒng)中有一定的挑戰(zhàn)性，重組表達(dá)載體誘導(dǎo)之后蛋白表達(dá)量較少，但純化濃縮后質(zhì)量濃度有所提高。除了原核表達(dá)，還可以采用酵母表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，可以分泌目的蛋白到菌體外，操作方便，探索合適的分泌信號(hào)肽、強(qiáng)啟動(dòng)元件等可能會(huì)影響蛋白表達(dá)量，這都將為后續(xù)結(jié)合利用M細(xì)胞靶向性治療PED及其他疾病提供方向。

本試驗(yàn)將M細(xì)胞靶向肽Col基因插入至PEDVCOE基因的C端，從而使PEDV抗原COE靶向到M細(xì)胞表面特異性受體，發(fā)揮M細(xì)胞向黏膜免疫系統(tǒng)輸送抗原的遞送作用。設(shè)計(jì)引物克隆COE和COE-Col基因序列，并構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a(+)-COE和pET-32a(+)-COE-Col。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TransB(DE3)中進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)和SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白為包涵體表達(dá)后，使用HisTrapTMFF Crude 親和層析柱純化并進(jìn)行復(fù)性濃縮，最終得到了單一條帶的目的蛋白，為后續(xù)制備利用M細(xì)胞遞送PEDV抗原的靶向疫苗奠定基礎(chǔ)。