李富祥,洪瓊花,朱 沛,王金萍,楊仕標(biāo),宋建領(lǐng),高華峰* (.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室,云南 昆明 6504;.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省畜禽遺傳資源保護和種質(zhì)創(chuàng)新工程實驗室,云南 昆明 6504)
無枝菌酸棒狀桿菌(Corynebacteriumamycolatum)是1988年英國COLLINS等[1]命名的一個種,屬于棒狀桿菌屬的一個成員。C.amycolatum是一種重要的條件致病菌[2],能引起人的陰道炎[3]、心內(nèi)膜炎[4]、敗血癥[5]、腹膜炎[6]、關(guān)節(jié)炎[7],乳腺炎[8]和角膜潰瘍[9]等多種疾病。到目前為止,僅見美國[4]、英國[7]、德國[5]、中國[3]和土耳其[2]等十多個國家有C.amycolatum分離鑒定的報道,但絕大部分分離株均來自于人,來自動物分離株的報道罕見[9-10]。
2021年8月,云南省彌勒縣某規(guī)?;驁霭l(fā)生一種慢性腹瀉疾病,頭孢類抗生素治療有一定的效果,但停藥后容易再次發(fā)生腹瀉,該病的發(fā)病率為2.0%,病死率為10.0%,給養(yǎng)殖場造成較大的經(jīng)濟損失。為對該病例進行實驗室診斷,本研究采集10份腹瀉病羊的直腸棉拭子樣品進行細菌分離鑒定,結(jié)果分離到10株革蘭陽性多形桿菌,分離株經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA基因同源性比對和遺傳進化分析鑒定為C.amycolatum。本研究首次從羊分離到C.amycolatum,并分析分離株的耐藥性和耐藥基因特征,為羊C.amycolatum感染的預(yù)防和控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1.1 主要試劑哥倫比亞瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix和Trans 2K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;青霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢呋辛、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、紅霉素、氯霉素、阿米卡星、諾氟沙星、四環(huán)素和磺胺甲惡唑藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;氟苯尼考藥敏紙片購自英國OXOID公司。
1.2 引物設(shè)計細菌16S rDNA上下游引物27F(A)/1492R(T)參照文獻[11]設(shè)計;細菌耐藥基因引物參照文獻[12]設(shè)計;引物均由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。
1.3 細菌分離將10份直腸棉拭子樣品分別劃線接種哥倫比亞瓊脂平板,37℃、5.0% CO2培養(yǎng)24 h,挑取優(yōu)勢菌落進行純培養(yǎng),將分離株革蘭染色鏡檢,觀察菌體形態(tài)。同時將分離株接種麥康凱瓊脂平板,37℃、5.0% CO2培養(yǎng)24 h,觀察生長特性。
1.4 16S rDNA基因測序用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取10株分離株基因組DNA作為PCR模板,采用27F(A)/1492R(T)引物PCR擴增16S rDNA基因,擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后,送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序,將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得基因收錄號。
1.5 16S rDNA基因BLAST比對鑒定分別將10株分離株16S rDNA基因在NCBI數(shù)據(jù)中進行BLAST比對鑒定。
1.6 16S rDNA基因遺傳進化分析利用MegAli-gn軟件分析分離株與其16S rDNA基因遺傳進化相關(guān)細菌種的同源性,利用MEGA 4.0.2軟件構(gòu)建16S rDNA基因(1 368 bp)系統(tǒng)進化樹(Neighbor-Joining進化樹),bootstrap values值設(shè)定為1 000,選擇棒狀桿菌屬模式菌株C.diphtheriaeNCTC 11397T(LN831026)作為進化樹的外群,對分離株進行遺傳進化分析鑒定。
1.7 藥敏試驗按照王剛等[13]介紹的方法和 CLSI20013推薦的Kirby-Bauer方法進行藥敏試驗,分析分離株對15種抗菌藥物的耐藥性。
1.8 耐藥基因PCR檢測按照楊守深等[14]介紹的煮沸法分別提取分離株的DNA作為PCR模板。20.0 μL PCR反應(yīng)體系:ddH2O 7.6 μL,2×Easy Taq PCR SuperMix 10.0 μL,上、下游引物(25.0 μmol/L)各0.2 μL,DNA模板2.0 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s、各引物退火溫度退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察耐藥基因檢測結(jié)果。
2.1 細菌分離10份直腸棉拭子樣品分別劃線接種哥倫比亞瓊脂平板,培養(yǎng)過夜后,均長出大量灰白色圓形、凸起、邊緣整齊、表面干燥的小菌落。挑取優(yōu)勢菌落進行純培養(yǎng),共分離到10株細菌,編號依次為YN21083~YN210812(即YN21083~YN210-89、YN210810~YN210812),分離株在麥康凱瓊脂上均不生長。分離株革蘭染色均呈陽性多形桿菌,菌體一端膨大呈棒狀,2個菌體常呈V字形排列,其中分離株YN21083的革蘭染色形態(tài)見圖1。
圖1 分離株YN21083的革蘭染色形態(tài) (×1 000)
2.2 16S rDNA基因BLAST比對鑒定10株分離株P(guān)CR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳均得到約為1 500 bp的條帶,與預(yù)期相符,PCR產(chǎn)物鑒定正確。將YN21083~YN210812分離株測序得到的16S rDNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,得到基因登錄號依次為MZ841808~MZ841817。BLAST比對結(jié)果顯示:10株分離株與C.amycolatum德國分離株FDAARGOS_991的同源性最高,其同源性在99.3%~100.0%之間,將10株分離株初步鑒定為C.amycolatum。
2.3 16S rDNA基因遺傳進化分析MegAlign同源性比對結(jié)果顯示,10株分離株與10株C.amycolatum參考株之間的同源性為97.2%~100.0%,與C.amycolatum模式菌株ATCC 49368T之間的同源性為98.3%~99.2%,10株分離株之間的同源性為99.0%~100.0%。系統(tǒng)進化樹顯示,10株分離株與10株C.amycolatum參考株形成同一個進化分支,4株乳酸棒狀桿菌(C.lactis)形成另一個進化分支(圖2),進一步將10株分離株鑒定為C.amycolatum。
圖2 分離株16S rDNA基因進化分析
2.4 藥敏試驗藥敏試驗結(jié)果顯示,10株分離株均對卡那霉素和磺胺甲惡唑耐藥;對慶大霉素和氯霉素中度耐藥;對青霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢呋辛、阿米卡星和氟苯尼考敏感,可作為治療的首選藥物。4株分離株(YN21087、YN21088、YN21089和YN210810)對鏈霉素耐藥;2株分離株(YN21085和YN21086)對諾氟沙星耐藥;9株分離株(YN21086除外)對紅霉素耐藥。
2.5 耐藥基因PCR檢測23種耐藥基因檢測結(jié)果顯示,10株分離株共檢測到8種耐藥基因aadA1、aadA2、tetA、tetM、qnrS、Sul1、Sul2和Sul3,其檢出率分別為30.0%,30.0%,100.0%,60.0%,60.0%,100.0%,10.0%,20.0%(表1);均未檢測到blaTEM、blaCTXM、blaCIT、blaEBC、aacA4、tetB、tetG、tetL、ermA、ermB、ermC、qnrB、qnrC、qnrD和floR耐藥基因。
表1 分離株耐藥基因檢測結(jié)果
C.amycolatum是近年來才被認(rèn)識到的一種重要的條件致病菌,常引起人的乳房炎、陰道炎、腹膜炎、角膜潰瘍、耳炎等多種疾病。動物C.amycolatum感染的報道十分少見,目前僅見豬(尿道感染)、犬(耳炎)和奶牛(乳房炎)感染的報道[9-10,15],未見其他動物C.amycolatum感染的報道。本研究分別從彌勒縣某規(guī)?;驁?個圈舍的10只腹瀉山羊直腸棉拭子樣品各分離到1株C.amycolatum,共分離到10株C.amycolatum,首次證實了羊C.amycolatum感染的存在,并研究分離株的遺傳進化、耐藥性和耐藥基因特征,為羊C.amycolatum感染的實驗室診斷、預(yù)防和控制具有重要意義。
國內(nèi)外C.amycolatum耐藥性研究中,青霉素和紅霉素是研究最多的2種抗菌藥物。本研究中的10株分離株均為多重耐藥菌株,其耐藥種數(shù)為3~5種。其中,青霉素耐藥率為0%,與CHEN等[3]報道的中國人源分離株耐藥率一致,而與DRAGOMIRESCU等[16]報道的羅馬尼亞分離株(7株)耐藥率100.0%,ZALAS等[17]報道的波蘭分離株(70株)耐藥率71.4%和RIEGEL等[18]報道的法國分離株(54株)耐藥率56.0%均存在很大的差異。10株分離株紅霉素耐藥率為90.0%,顯著高于YAGUE等[19]報道的西班牙分離株(57株)耐藥率52.3%和BALCI等[20]報道的土耳其分離株(4株)耐藥率75.0%。10株分離株磺胺甲惡唑耐藥率為100.0%,與CHEN等[3]報道的中國人源分離株耐藥率一致,而遠遠高于NEEMUCHWALA等[20]報道的加拿大分離株(190株)耐藥率33.2%。耐藥性研究表明,中國分離株耐藥性與國外分離株存在很大差異,可能與不同國家抗菌藥物應(yīng)用頻率有關(guān)。青霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢呋辛和阿米卡星可作為我國治療C.amycolatum感染的首選藥物。
國內(nèi)外C.amycolatum耐藥基因檢測的研究報道很少,僅見喹諾酮類耐藥基因gryA[21]和紅霉素類耐藥基因ermB和ermX[22]的檢測報道。本研究對10株分離株β-內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaCTXM、blaCIT和blaEBC)、氨基糖苷類(aadA1、aadA2和aacA4)、四環(huán)素類(tetA、tetB、tetG、tetL和tetM)、大環(huán)內(nèi)酯類(ermA、ermB和ermC)、喹諾酮類(qnrB、qnrC、qnrD和qnrS)、磺胺類(Sul1、Sul2和Sul3)和氯霉素類(floR)共23種耐藥基因進行檢測,共檢出8種耐藥基因(表1)。10株分離株ermA、ermB和ermC耐藥基因檢出率為0%,其中ermB檢出率與ORTIZ-PéREZ等[22]報道的西班牙分離株(66株)檢出率一致,而本研究中的10株分離株紅霉素耐藥率高達90.0%,因此紅霉素耐藥性與ermA、ermB和ermC耐藥基因無相關(guān)性。10株分離株sul1耐藥基因檢出率為100.0%,并且磺胺甲惡唑耐藥率也為100.0%,因此磺胺甲惡唑耐藥性與sul1耐藥基因具有很好的相關(guān)性。10株分離株aadA1和aadA2檢出率僅為30.0%,而卡那霉素耐藥率高達100.0%,因此卡那霉素耐藥性與aadA1和aadA2無相關(guān)性。僅3株分離株YN21087、YN21088和YN21089檢出aadA2,并且只有這3株分離株對鏈霉素耐藥,因此鏈霉素耐藥性與aadA2耐藥基因具有很好的相關(guān)性。10株分離株tetA和tetM檢出率分別高達100.0%和60.0%,而四環(huán)素耐藥率為0%,因此四環(huán)素耐藥性與tetA和tetM無相關(guān)性。
目前,國內(nèi)外均無從人和動物腹瀉病例樣品中分離到C.amycolatum的研究報道,本研究從彌勒縣某規(guī)?;驁?個圈舍的10只腹瀉山羊的直腸棉拭子樣品中各分離到1株C.amycolatum,共分離到10株C.amycolatum。而同圈舍的10只健康山羊直腸棉拭子均未分離到C.amycolatum,因此,推測C.amycolatum是引起山羊腹瀉的一種重要病原,應(yīng)引起重視,其致病性和致病機制有待下一步深入研究。