陸海旺，賓彬，林思偉，王德勝，王杰，藍(lán)艷梅

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

近年來，男性不育癥的發(fā)生率逐漸升高，嚴(yán)重影響患者家庭和諧，少精子癥是男性不育癥常見的臨床表現(xiàn)，是指男性精子濃度＜15×106/mL 或一次射精的精子總數(shù)＜39×106（需嚴(yán)格禁欲2～7 d，且優(yōu)先考慮精子總數(shù)）。少精子癥的發(fā)生，常由于睪丸發(fā)育障礙、生精細(xì)胞功能缺陷，或由于輸精管不完全梗阻、炎癥、感染等多方面因素引發(fā)，也有較大比例原因不明的少精子癥，即特發(fā)性少精子癥，可能涉及內(nèi)分泌、基因、染色體和免疫等多方面與生精功能密切相關(guān)的環(huán)節(jié)，需進(jìn)一步深入探討和闡明其機(jī)理?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏針對(duì)特發(fā)性少精子癥療效確切的藥物，更多停留在經(jīng)驗(yàn)性治療階段，常用手段有抗氧化、抗雌激素、補(bǔ)充微量元素等，大多療效不確切或存在爭(zhēng)議。輔助生殖技術(shù)雖然解決了眾多患者的生育問題，但并沒有從病因上去干預(yù)，本質(zhì)上是繞開病因的一種手段。輔助生殖技術(shù)還存在倫理爭(zhēng)議、成本高昂、成功率令人不甚滿意、對(duì)女方潛在的各種損害等缺陷。通過治療改善精子質(zhì)量而實(shí)現(xiàn)自然生育，仍然是臨床醫(yī)師和患者共同追求的愿望，也更符合優(yōu)生優(yōu)育的要求。中醫(yī)藥治療男性不育歷史悠久，經(jīng)驗(yàn)豐富，療效獨(dú)特，優(yōu)勢(shì)顯著，但其作用機(jī)理尚未完全闡明。強(qiáng)精煎為筆者多年來用于治療少、弱精子癥的經(jīng)驗(yàn)方，具有健脾益腎、清熱利濕活血的功效，前期實(shí)驗(yàn)和臨床研究已證實(shí)［1］，強(qiáng)精煎可通過抗氧化［2］和抗生精細(xì)胞凋亡［3］等多方面作用，有效改善精子數(shù)量和活力。

近年有研究表明PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1信號(hào)通路可調(diào)控生精細(xì)胞增殖、分化和精子發(fā)生，對(duì)少精子癥的轉(zhuǎn)歸起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［4］。中醫(yī)藥通過調(diào)控以上通路，以干預(yù)精子發(fā)生，改善少精子癥，增加精子數(shù)量的相關(guān)報(bào)道比較少見，研究大多僅涉及通路的一部分。本研究采用環(huán)磷酰胺（CTX）誘導(dǎo)大鼠少精子癥模型，探討強(qiáng)精煎對(duì)少精子癥模型大鼠的治療作用及其對(duì)PI3K/Akt/mTOR 通路及其下游通路（p70S6 K/4EBP1）的調(diào)控作用，以進(jìn)一步揭示強(qiáng)精煎治療少精子癥的分子生物學(xué)機(jī)制，豐富中醫(yī)藥治療少精子癥的理論依據(jù)和內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來源與分組

清潔級(jí)雄性SD 大鼠75 只，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)公司，8～10 周齡，體質(zhì)量（250 ± 10）g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2014－0011。本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)已經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查備案通過。大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、mTOR 通路抑制劑組（雷帕霉素組）和強(qiáng)精煎+雷帕霉素組和強(qiáng)精煎組，每組15只。

1.1.2 主要試劑、儀器及藥物

各免疫組化一抗試劑盒（PI3K：sc－376112、Akt：sc－377457、mTOR：ab32028、p70S6K：sc－8418、4EBP1：sc－9977、Ki－67：ab15580，均采購(gòu)于Santa Cruz 公司）；免疫組化二抗試劑盒（貨號(hào)：SP0041，北京索萊寶公司）；PCR 試劑盒（貨號(hào)：RR047A）、引物均由寶生物公司提供。

ASP300S 全自動(dòng)組織脫水機(jī)、ST5020 多功能染色機(jī)、DM3000 生物顯微鏡、圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國(guó)Leica公司）；LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（羅氏公司）；Mastercycle Nexus PCR循環(huán)儀（eppendoff公司）。

強(qiáng)精煎（當(dāng)歸10 g，枸杞子20 g，黃芪30 g，益母草30 g，鹿角霜15 g，五味子10 g，續(xù)斷20 g，黨參15 g，生牡蠣30 g，神曲10 g，菟絲子20 g和紫河車10 g）由天江藥業(yè)有限公司提供（機(jī)配免煎）；環(huán)磷酰胺凍干粉（Baxter Oncology GmbH 公司，批號(hào)：0C371A）；雷帕霉素（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C11542563）。

1.2 方法

1.2.1 造模與給藥

預(yù)實(shí)驗(yàn)參考其他文獻(xiàn)［5］采用大劑量（50 mg）環(huán)磷酰胺短期（5 d）連續(xù)腹腔注射誘導(dǎo)少精子癥大鼠模型，成模率不理想且病死率過高，實(shí)驗(yàn)的可靠性有限，筆者經(jīng)反復(fù)嘗試后證實(shí)，采用較低劑量20 mg/（kg·d）環(huán)磷酰胺經(jīng)腹腔注射給藥，連續(xù)14 d可獲得穩(wěn)定可靠的少精子癥大鼠模型，造模病死率相對(duì)較低，經(jīng)長(zhǎng)期（8周）觀察，睪丸仍處于萎縮－低生精狀態(tài)，彌補(bǔ)了生精功能自然恢復(fù)導(dǎo)致的數(shù)據(jù)不可靠的缺陷。見圖1。

根據(jù)徐淑云主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，使用基于人和大鼠之間的體表面積轉(zhuǎn)換的等效劑量比，計(jì)算出大鼠的等效劑量。測(cè)算后強(qiáng)精煎高劑量（等效劑量4 倍）為12 g/（kg·d），前期研究已證實(shí)該給藥劑量可顯著增加少精子癥大鼠的精子數(shù)量和活動(dòng)力［6］。造模成功后，雷帕霉素組給予雷帕霉素2 mg/（kg·d）腹腔注射［7］；強(qiáng)精煎+雷帕霉素組在雷帕霉素組基礎(chǔ)上給予強(qiáng)精煎配方顆粒12 g/（kg·d）灌胃；強(qiáng)精煎組給予強(qiáng)精煎配方顆粒12 g/（kg·d）灌胃；空白對(duì)照組和模型組大鼠每天給予生理鹽水灌胃。每周復(fù)測(cè)大鼠體質(zhì)量作為動(dòng)態(tài)調(diào)整給藥劑量的依據(jù)。連續(xù)給藥38 d，足1個(gè)大鼠生精周期［8］。

1.2.2 標(biāo)本采集與制備

于末次給藥24 h后，以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉各組大鼠，剪開腹腔，將雙側(cè)睪丸拖出，去除附睪、脂肪等組織，完整分離睪丸，吸干血跡，一側(cè)睪丸迅速置于-80 ℃超低溫冰箱中待測(cè)，剩余睪丸組織放入10%濃度的甲醛溶液中，4 ℃冷藏24 h固定，待下一步操作。

1.2.3 采用IHC（免疫組化）法檢測(cè)Ki－67、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1蛋白表達(dá)

樣品處理按IHC 試劑盒要求進(jìn)行，基本步驟有脫蠟－修復(fù)－封閉－加抗體－染細(xì)胞核－脫水封片等。對(duì)每個(gè)樣本，在顯微鏡200 倍條件下隨機(jī)采集5 個(gè)視野，每個(gè)視野用IPP 進(jìn)行陽性總面積、平均光密度和總光密度（IOD）測(cè)量，并統(tǒng)計(jì)分析各組總光密度（IOD）差異。

1.2.4 RT－PCT 檢 測(cè)PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1基因表達(dá)

采用Trizol 法提取RNA：將大約50 mg 的睪丸組織加入到Trizol EP管中勻漿，轉(zhuǎn)到無RNase EP管中裂解。加入氯仿，低溫高速離心15 min。轉(zhuǎn)移到新的EP管，加異丙醇混勻。低溫高速離心獲得RNA 沉淀。去掉上清，加去酶75%乙醇，混勻，低溫離心。去掉上清，將沉淀空氣干燥，其后以DEPC 水溶解，吸取該溶解液1 μL以DEPC水稀釋，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄：①去除DNA 反應(yīng)條件為42 ℃2 min；②4 ℃逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃10 min。引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（TB GreenTM Premix ExTaqTM Ⅱ：RR820 A）部分樣本的cDNA 做10 倍稀釋，反應(yīng)條件：95 ℃30 s，1 cycle；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 cycles。繪制溶解曲線。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過程中，進(jìn)行3個(gè)重復(fù)孔實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最后結(jié)果2－△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果要求3個(gè)重復(fù)孔間CP、Tm數(shù)值相差在±0.5之間，以保證實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定，重復(fù)性好。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表達(dá)，組間比較采用單因素方差分析，事后組間多重比較采用LSD－t檢驗(yàn)（即主要進(jìn)行有專業(yè)意義的組間比較），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，以P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠睪丸組織PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1、Ki－67蛋白表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型組和雷帕霉素組PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1、Ki－67蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，雷帕霉素組mTOR蛋白表達(dá)水平降低更為顯著（P＜0.01）；與模型組比較，強(qiáng)精煎+雷帕霉素組、強(qiáng)精煎組mTOR、PI3K、Akt、p70S6K、Ki－67、4EBP1 蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，從免疫組化切片也可以看出，空白對(duì)照組大鼠睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)完整，生精細(xì)胞連接緊密，精子密集分布填充于管腔，提示生精活躍；而模型組大鼠睪丸組織生精上皮結(jié)構(gòu)明顯破壞，生精細(xì)胞層次不完整，精子數(shù)量銳減現(xiàn)象普遍存在，提示生精功能受到明顯抑制；雷帕霉素組生精細(xì)胞減少和缺失等病理損傷現(xiàn)象尤為明顯，精子數(shù)量更少；經(jīng)干預(yù)后，強(qiáng)精煎+雷帕霉素組、強(qiáng)精煎組大鼠睪丸組織生精上皮病理損傷得到明顯修復(fù)，生精細(xì)胞層次較為完整，生精較為活躍，提示在強(qiáng)精煎干預(yù)下，大鼠損傷的生精功能已得到明顯改善。見圖2～圖7。

圖2 各組大鼠睪丸組織PI3K蛋白表達(dá)比較

圖3 各組大鼠睪丸組織Akt蛋白表達(dá)比較

圖4 各組大鼠睪丸組織mTOR蛋白表達(dá)比較

圖5 各組大鼠睪丸組織4EBP1蛋白表達(dá)比較

圖6 各組大鼠睪丸組織p70S6K蛋白表達(dá)比較

圖7 各組大鼠睪丸組織Ki－67蛋白表達(dá)比較

2.2 各組大鼠睪丸組織PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1基因表達(dá)比較

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型組和雷帕霉素組PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1 基因表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，雷帕霉素組表達(dá)水平降低更為顯著（P＜0.01）；與模型組、雷帕霉素組相比，強(qiáng)精煎+雷帕霉素組、強(qiáng)精煎組PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1 基因表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見，以上基因表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化蛋白表達(dá)結(jié)果是基本相同的。見圖8。

圖8 各組大鼠睪丸組織PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1基因表達(dá)比較

3 討論

除梗阻因素等特殊情況外，精子數(shù)量主要取決于精子發(fā)生的活躍程度。精子發(fā)生是指從精原細(xì)胞到形成精子的過程?；具^程包括精原細(xì)胞分裂增殖成精母細(xì)胞、精母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成單倍體的精子細(xì)胞、精子細(xì)胞變態(tài)形成精子這三個(gè)階段［9］，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)停滯和障礙，都將影響最后的精子數(shù)目，可以說是少精子癥發(fā)生的根本原因。少精子癥與睪丸組織基因表達(dá)異?；蛐盘?hào)傳導(dǎo)異常所致的生精障礙關(guān)系密切。其中，精原細(xì)胞分裂增殖是精子發(fā)生數(shù)量的基礎(chǔ)，復(fù)雜的基因和蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控著這一細(xì)胞增殖進(jìn)程，其中信號(hào)因子和信號(hào)通路有著突出作用［9］，這也是近年來有關(guān)生精細(xì)胞增殖和精子發(fā)生的研究熱點(diǎn)。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一［10］，該信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和存活中扮演中心調(diào)控角色［11］。細(xì)胞信號(hào)分子與細(xì)胞膜受體及受體底物結(jié)合后，能夠激活RTK/P13K/Akt 及其下游mTOR 信號(hào)級(jí)聯(lián)［12－13］，抑制PI3K/Akt/mTOR則可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡［14］。

雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是Akt 的重要底物之一，屬于磷酸肌醇相關(guān)激酶家族成員，是一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子［9］，是細(xì)胞代謝的中樞調(diào)節(jié)器之一［15］，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期、能量代謝等細(xì)胞活動(dòng)。PI3K/Akt 信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)mTOR 信號(hào)及其下游靶因子p70S6K/4EBP1 的表達(dá)，進(jìn)而影響靶細(xì)胞或靶器官的結(jié)構(gòu)和功能［16－19］。精原干細(xì)胞和精母細(xì)胞均有mTOR、p70S6 K、4EBP1 及相應(yīng)磷酸化蛋白（p－mTOR、p－p70S6K、p－4EBP1）的 表 達(dá)［4］，且mTOR 信號(hào)對(duì)早期生精細(xì)胞和精原干細(xì)胞表型維持及分化有重要作用［20］。抑制mTORC1 通路可阻斷精原細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)未分化精原細(xì)胞在生精小管中的積聚，并阻斷睪丸組織中編碼酪氨酸激酶受體ckit（kit）基因的翻譯［21］，精原細(xì)胞p70S6K 磷酸化水平也受其調(diào)控。雷帕霉素可抑制睪丸中mTOR 蛋白的表達(dá)，抑制睪丸精原細(xì)胞的增殖和分化。同時(shí)，mTOR 蛋白下游的p－p70S6K 和p－4EBP1 表達(dá)降低，維甲酸8 激活基因的表達(dá)也受到抑制，而維甲酸8是啟動(dòng)減數(shù)分裂的關(guān)鍵基因［20］，抑制p70S6K/4EBP1信號(hào)可能導(dǎo)致哺乳動(dòng)物睪丸毒性，如生精小管退化和生精細(xì)胞數(shù)量減少［7］。mTOR、p－p70S6K 和p－4EBP1在大鼠睪丸組織中的表達(dá)隨著大鼠年齡增長(zhǎng)而降低，這表明mTOR 及其下游通路p70S6K/4EBP1 參與調(diào)節(jié)精原細(xì)胞增殖及其向精子的分化［7］。綜上所述，以上通路控制了生精細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖，最終影響精子數(shù)量。

雷帕霉素類似物治療可影響精原細(xì)胞分化增殖，同時(shí)抑制下丘腦－垂體－性腺軸，干擾生殖內(nèi)分泌。使用雷帕霉素治療腫瘤或腎臟移植后免疫抑制反應(yīng)的過程中，可導(dǎo)致男性患者生精功能障礙，表現(xiàn)為少精子癥、無精子癥［22］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，雷帕霉素可導(dǎo)致大鼠睪丸萎縮、生精上皮空泡化、曲細(xì)精管管腔萎縮稀疏、生精細(xì)胞層數(shù)減少甚至缺如、腔內(nèi)精子減少或無精子、間質(zhì)細(xì)胞增生等［23］。Ki－67 作為細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活躍度呈正相關(guān)，常用作評(píng)估細(xì)胞增殖程度的標(biāo)記物［24］。

國(guó)醫(yī)大師王琦認(rèn)為“腎虛夾濕、熱、瘀、毒、蟲”是少、弱精子癥的根本病機(jī)［25］。筆者以為，治療少、弱精子癥，應(yīng)先天、后天并重，生精、強(qiáng)精當(dāng)脾腎氣血并調(diào)，在補(bǔ)腎生精的同時(shí)，注重兼顧脾胃后天之本，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化水谷精微的能力，使得生精有源，切勿“徒補(bǔ)其腎”。強(qiáng)精煎方中黨參健脾益氣，菟絲子、枸杞子“以子補(bǔ)子”，共為君藥。黃芪－當(dāng)歸藥對(duì)實(shí)為當(dāng)歸補(bǔ)血湯，功能益氣補(bǔ)血養(yǎng)血；續(xù)斷補(bǔ)肝腎、壯腰膝，精不足者補(bǔ)之以味，紫河車、鹿角霜助君藥生精，共為臣藥。益母草清熱活血散瘀，五味子“益男子精”，生牡蠣潛陽固精，共為佐藥。六神曲健脾和胃為使藥，諸藥合用共奏健脾益腎、清熱散瘀、生精強(qiáng)精之效。強(qiáng)精煎的前期臨床研究提示，該方可明顯改善少、弱精子癥患者的精子數(shù)量和活力，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)該方有抗氧化、抗生精細(xì)胞凋亡等作用，但對(duì)其調(diào)控精子發(fā)生的作用尚未深入探討。本研究在對(duì)重度少精子癥大鼠模型進(jìn)行強(qiáng)精煎干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，經(jīng)中藥強(qiáng)精煎干預(yù)的兩組大鼠睪丸萎縮現(xiàn)象得到改善，睪丸生精上皮得到較好的修復(fù)，精子數(shù)量上升，表明強(qiáng)精煎可拮抗生精上皮病理損傷，促進(jìn)少精子癥大鼠精子發(fā)生，改善睪丸低生精狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠睪丸組織中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1、Ki－67 蛋白表達(dá)均低于空白對(duì)照組，提示模型組大鼠睪丸生精受損與PI3K/Akt/mTOR 通路及其下游靶因子（p70S6K、4EBP1）、細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki－67 表達(dá)受到抑制，生精細(xì)胞增殖分化減弱有關(guān)。給予mTOR 通路抑制劑雷帕霉素后，雷帕霉素組大鼠mTOR 蛋白及基因表達(dá)降低尤為明顯，下游靶因子p70S6K、4EBP1 表達(dá)亦顯著下調(diào)，睪丸病理損傷最為嚴(yán)重，這提示mTOR 通路被抑制后，大鼠睪丸生精發(fā)生明顯受阻。給予強(qiáng)精煎干預(yù)后的兩組大鼠PI3K、Akt、mTOR 通路蛋白，下游靶蛋白p70S6K、4EBP1，Ki－67 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，同時(shí)PI3K、Akt、mTOR、p70S6K、4EBP1 基因表達(dá)水平也顯著上調(diào)，提示強(qiáng)精煎改善少精子癥大鼠模型生精作用可能是通過激活PI3K/Akt/mTOR 通路及其下游靶基因/蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，強(qiáng)精煎可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路蛋白及其下游靶基因/蛋白（p70S6 K、4EBP1）以及細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki－67 的表達(dá)，改善少精子癥大鼠的生精功能，修復(fù)睪丸病理損傷，促進(jìn)精子發(fā)生，增加精子數(shù)量。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K/4EBP1 通路調(diào)控精子發(fā)生作用機(jī)制較為復(fù)雜，而且強(qiáng)精煎為復(fù)方中藥制劑，其發(fā)揮治療作用的具體有效成分和更精細(xì)的機(jī)制尚有待深一步研究探索。