楊志強，黃燕燕，何慧，溫媛媛

舟山醫(yī)院，浙江 舟山 316021，1.呼吸與危重癥科；2.分子生物實驗室；3.病理診斷中心

在世界范圍內(nèi)，肺癌在所有惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率均居首位[1]，組織學(xué)上大部分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）。盡管治療方式多樣，但預(yù)后仍較差[2]。新的分子標(biāo)志物的研究對于早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后分析至關(guān)重要。

SWI/SNF是一種復(fù)合型核突變小體，以ATP依賴的方式參與基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在DNA修復(fù)與DNA復(fù)制、細胞生長和細胞分化中發(fā)揮重要作用[3-5]。SMARCA5屬于SWI/SNF家族的一種蛋白，具有解旋酶和ATPase活性[6-10]。SMARCA5通過組蛋白八聚體控制DNA的敏感性，該功能有助于基因表達、DNA復(fù)制、DNA修復(fù)和染色質(zhì)高階結(jié)構(gòu)的維持[6，11-18]。SMARCA5已被證明具有致癌功能，特別是已有研究報道其與肝癌、乳腺癌和胃癌細胞增殖有關(guān)[19-21]。然而，SMARCA5在NSCLC中是否表達，及其表達情況如何鮮見相關(guān)研究。本研究采用免疫組化、RT-PCR及Western blot檢測SMARCA5在NSCLC的表達情況，同時采用MTT法和Transwell法檢測肺癌細胞的增殖和侵襲能力，以期闡明SMARCA5在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源與患者資料 收集2009年1月1日至2010年12月31日舟山醫(yī)院住院患者131例肺組織標(biāo)本。根據(jù)世界衛(wèi)生組織肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)（2015年），分為47例肺鱗癌和84例肺腺癌。所有入組患者均行根治性手術(shù)切除，未行化療或放療。新鮮組織標(biāo)本用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，進行組織切片。常規(guī)染色采用HE染色。入組患者的腫瘤采用國際抗癌聯(lián)盟（2009年）的TNM分期系統(tǒng)進行分期。本研究經(jīng)舟山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。對患者進行門診和電話隨訪。生存時間是從手術(shù)日期到因復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移死亡日期或最后一次隨訪日期。本研究隨訪數(shù)據(jù)截止日期為2016年12月31日，1例患者失訪。

1.2 主要試劑 S-P免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）；SMARCA5抗體、SMARCA5 siRNA（hSNF2H siRNA）（美國Santa Cruz公司）；β-actin抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒（大連TaKaRa公司）；MTT增殖試劑盒（美國Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色及結(jié)果判讀：組織采用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，制備4 μm切片。免疫染色采用Streptavidin過氧化物酶（S-P）法。按照S-P法進行染色：脫蠟，水化，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原修復(fù)，封閉，滴加多克隆小鼠抗SMARCA5抗體（1:600）4 ℃過夜，PBS清洗后加入對應(yīng)的二抗、室溫孵育1 h，DAB顯色，復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下判讀。陰性對照為非免疫血清。所有樣本均由兩名獨立的高年資病理醫(yī)師進行評估。細胞核/細胞質(zhì)中存在棕黃色顆粒被認為是陽性染色。染色強度分為三個等級（0，陰性；1，中等著色；2，強著色），染色百分率分為5個等級（0，0%；1，1%～25%；2，26%～50%；3，51%～75%；4，76%～100%），在至少5個高倍鏡視野（400倍）評估，以陽性細胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分，評分為4～8分判定為SMARCA5陽性表達或高表達，0～4分為陰性表達或低表達[20]。

1.3.2 細胞培養(yǎng)：選取人類正常支氣管上皮細胞系（HBE），人類肺腺癌（adenocarcinoma,ACC）細胞株A549和Lu165，人類鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）細胞系SK-MES-1和NCI-H520，均接種于RPMI 1640與10%胎牛血清和100 U/mL的青-鏈霉素培養(yǎng)基中，于37 ℃含5% CO2濕潤空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 siRNA干擾實驗：細胞接種于六孔板中，接種密度為5×105/孔。實驗分3組：未處理組，control siRNA組和SMARCA5 siRNA組，每個實驗均重復(fù)3次。未處理組和control siRNA組為陰性對照，siRNA濃度為20 μm。在室溫下，將10 μg SMARCA5 siRNA和10 μg control siRNA與1.5 mL培養(yǎng)基混合。未處理組在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將60 μL Lipofectamine 2000與1.5 mL培養(yǎng)基混合，室溫孵育5 min。將稀釋后的siRNA與Lipofectamine 2000混合，室溫孵育30 min。將該混合物轉(zhuǎn)染A549和SK-MES-1細胞。6 h后，將細胞轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)36 h。然后收集細胞進行研究。

1.3.4 蛋白提取與Western blot：收集細胞，加入500 μL細胞裂解液和蛋白酶抑制劑復(fù)合物，冰浴下超聲處理。取上清液，10 000×g，4 ℃離心30 min，收集含總蛋白的上清液。上樣蛋白量為60 μg，經(jīng)聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳1.5 h后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入Western封閉液室溫封閉60 min，洗凈，分別加入一抗SMARCA5（1:1 000）和β-actin（1:2 000）在4 ℃下孵育過夜。TTBS洗膜3次，后加入對應(yīng)的二抗（1:2 000）室溫下孵育2 h，ECL顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以目的條帶與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.3.5 RT-PCR：使用TRIzol試劑分離提取總RNA。采用RNA PCR kit反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并擴增SMARCA5。β-actin作為內(nèi)參。cDNA的合成條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃5 min。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴增mRNA。引物序列：SMARCA5上游引物5’-CCTTTGAAGATGAAACCAGGGCGC-3’，下游引物5’-CTGTTAATAGCTCTTCATCCTCCTC-3’；β-actin上游引物5’-AAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游引物5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。PCR產(chǎn)物用溴化乙酯染色，電泳后用生物成像系統(tǒng)進行分析。使用NIH圖像軟件測定相對表達強度。實驗重復(fù)3次。

1.3.6 基質(zhì)膠侵襲實驗（Transwell侵襲小室測定）：采用孔徑為8 mm的24孔Transwell室評估細胞侵襲。將Matrigel基質(zhì)膠涂于膜的上表面。轉(zhuǎn)染24 h后，將細胞接種在上室（5×104個細胞/孔）并培養(yǎng)24 h。浸潤至膜表面的細胞用甲醇固定，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，置載玻片上，顯微鏡下計數(shù)侵襲至濾膜下表面的細胞數(shù)，每張濾膜隨機計數(shù)10個視野，取均值。實驗重復(fù)3次。

1.3.7 MTT實驗：將各組細胞懸液分別接種于96孔培養(yǎng)板中（1×104個細胞/孔），培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO，490 nm波長下測定各孔吸收值，以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以表示。兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，多組樣本比較采用隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗進行生存分析，Cox回歸分析肺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMARCA5高表達與NSCLC中高pTNM分期、低分化和胸膜浸潤相關(guān) 為明確SMARCA5蛋白在肺癌組織中的表達，采用免疫組化方法檢測了131例肺癌組織中SMARCA5蛋白的表達。SMARCA5蛋白在正常的支氣管上皮或肺泡上皮中不表達，在肺鱗狀細胞癌與腺癌細胞中陽性表達，定位于細胞核。見圖1。78例（59.5%）肺癌組織中SMARCA5高表達（評分≥4分），53例（40.5%）肺癌組織SMARCA5低表達（評分＜4分。同時分析了SMARCA5蛋白表達與NSCLC臨床病理的關(guān)系，SMARCA5的高表達與低分化（P＜0.001）、高TNM分期（P＜0.001）和胸膜浸潤（P=0.032）顯著相關(guān)。SMARCA5的表達與年齡、性別、組織學(xué)、腫瘤大小、腫瘤位置和淋巴結(jié)狀態(tài)無相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

表1 131例NSCLC中SMARCA5表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析（例)

2.2 SMARCA5高表達與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān) 采用生存曲線分析術(shù)后隨訪記錄完整的患者，在131例NSCLC患者中，SMARCA5高表達患者的總生存率顯著低于SMARCA5低表達患者（P=0.001），見圖2。多因素生存分析顯示，SMARCA5高表達（HR=3.807，P=0.005）、腫瘤直徑大（HR=4.626、3.564，P=0.004、0.029）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=2.554，P=0.009）、腫瘤分化程度低（HR=6.245、16.077，P=0.001、＜0.001）、低臨床分期（HR=12.903，P=0.010）是肺癌預(yù)后的獨立危險因素，見表2。

圖2 SMARCA5表達與患者總生存率之間的關(guān)系

表2 131例NSCLC患者生存預(yù)后因素的多因素分析

2.3 NSCLC中沉默SMARCA5可以下調(diào)SMARCA5表達 Western blot和RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMARCA5在HBE細胞株中的表達明顯低于肺癌細胞株（A549、Lu165、SK-MES-1和NCI-H520（）蛋白：F=8.221、4.334、8.967、4.219，P＜0.05；mRNA：F=7.650、5.328、9.218、4.671，P＜0.05）。見圖3。在A549和SKMES-1細胞株中采用SMARCA5 siRNA來沉默SMARCA5的表達。將SMARCA5 siRNA片段導(dǎo)入A549和SKMES-1細胞36 h后，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與未處理組和control siRNA組相比，兩組肺癌細胞中SMARCA5 mRNA（F=9.245、7.204，P＜0.05）和蛋白（F=5.114、3.235，P＜0.05）的表達均顯著下調(diào)，見圖4。

圖3 SMARCA5在正常支氣管上皮和肺癌細胞株中的表達

圖4 在肺癌細胞株中沉默SMARCA5后可以下調(diào)SMARCA5的表達

2.4 在NSCLC中沉默SMARCA5表達可抑制細胞增殖和侵襲 MTT法測定結(jié)果表明在細胞培養(yǎng)第2～第4天，與control siRNA組或未處理組比，轉(zhuǎn)染SMARCA5 siRNA后A549與SK-MES-1細胞的增殖率明顯下降（P＜0.05），見圖5。在細胞培養(yǎng)第2～第4天，Transwell檢測結(jié)果顯示，SMARCA5 siRNA組與control siRNA組和未處理組相比，侵入Transwell基質(zhì)膠下表面的細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），見圖6。

圖5 沉默SMARCA5表達可以抑制肺癌細胞的增殖

圖6 沉默SMARCA5表達可以抑制肺癌細胞的侵襲

3 討論

新近有研究表明，SMARCA5在原始細胞向腫瘤細胞進化的過程中是必要的，包括白血病、胃癌、乳腺癌等[22-23]。本研究旨在明確SMARCA5蛋白在NSCLC中的表達情況及在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMARCA5蛋白在NSCLC組織中表達水平增加，而在正常的支氣管上皮或肺泡上皮不表達。同時半定量RT-PCR和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，SMARCA5在肺癌細胞株中表達高于正常上皮細胞株。有研究顯示，SMARCA5在胃癌中表達高于正常胃黏膜上皮[21]，這與本研究肺癌中觀察到的結(jié)果相似：SMARCA5可能在惡性腫瘤中的表達高于正常上皮細胞。此外，本研究進一步分析了肺癌組織中SMARCA5表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)SMARCA5過表達與TNM晚期、胸膜浸潤和腫瘤分化不良顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明，SMARCA5高表達可能在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，SMARCA5可能發(fā)揮癌基因的作用，促進肺癌惡性表型形成。

本研究中發(fā)現(xiàn)SMARCA5在人類肺癌中普遍表達上調(diào)，然而它在肺癌發(fā)展中的生物學(xué)作用仍不清楚。為了進一步明確SMARCA5對肺癌細胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響，本研究使用SMARCA5 siRNA干擾了SMARCA5的表達及其引起的生物學(xué)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾SMARCA5表達后，A549（肺腺癌細胞系）和SK-MES-1（肺鱗癌細胞系）細胞的增殖能力均較對照組顯著減弱。上述結(jié)果與TOMAS等[24]的研究結(jié)果有相似之處，其研究認為SMARCA5表達缺失可抑制AML細胞增殖，影響干細胞的正常功能。WANG等[19]也報道，在BEL-7402細胞中過表達SMARCA5可促進細胞生長，而在Huh7細胞中下調(diào)SMARCA5的表達可抑制細胞的生長。

此外，我們還觀察到，沉默SMARCA5的表達會抑制肺癌細胞侵襲。有研究發(fā)現(xiàn)，SMARCA5表達缺失可以通過下調(diào)MMP2來抑制乳腺癌細胞的侵襲能力[20]。因此，這些結(jié)果均提示，沉默SMARCA5表達有可能抑制肺癌細胞的惡性進展；在肺癌的發(fā)生發(fā)展進程中，SMARCA5可能發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲的作用，具體機制還有待進一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)SMARCA5高表達水平的患者比低表達水平的患者生存率更短。進一步運用多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，SMARCA5蛋白高表達是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，以上結(jié)果說明SMARCA5的表達可能影響NSCLC患者的預(yù)后。值得我們關(guān)注的是，JIN等[20]在乳腺癌中觀察到，SMARCA5過表達與乳腺癌的高TNM分期、大小、高增殖指數(shù)、較短的生存期相關(guān)，這也與本研究結(jié)果相似。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SMARCA5在NSCLC組織中表達增加，與腫瘤TNM分期、胸膜浸潤和腫瘤分化不良相關(guān)。利用RNA干擾敲除SMARCA5可降低NSCLC細胞的增殖和侵襲活性。SMARCA5高表達與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)，初步揭示了SMARCA5在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮一定作用，SMARCA5有潛力成為未來肺癌治療的靶點。