徐超逸，陳海燕，陳賽玲，張銘瑤，梁宗文，段萍

1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 婦產科，浙江 溫州 325027；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 婦產科，黑龍江 哈爾濱 150086

子宮內膜異位癥的特征是有活性的子宮內膜樣組織種植在子宮體以外的部位[1]，引起盆腔包塊、進行性加重的痛經、性交痛以及不孕等[2]。有10%～15%的育齡期女性受其困擾[3]，但目前其發(fā)病機制尚不明確[4]。環(huán)狀RNA（circularRNAs,circRNA）是一類廣泛存在于真核細胞內，且具有調控基因表達作用的內源性非編碼RNA[5-6]。根據競爭性內源性RNA理論，circRNAs可以作為內源性分子海綿與微小RNAs（miRNAs）競爭性結合，調控靶mRNA表達[7]。本課題組前期研究結果表明miR-200c-3p可以抑制異位子宮內膜間質細胞（ectopic endometrial stromal cells,EESCs）增殖及遷移能力[8]。本研究進一步利用基因芯片篩選出與miR-200c-3p相互作用的circRNAs。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）結果顯示circRNA_000809在子宮內膜異位癥組織中表達上調，miR-200c-3p表達下調；同時靶基因預測顯示miR-200c-3p與circRNA_000809存在結合位點，且在子宮內膜異位癥組織中miR-200c-3p與circRNA_000809的表達量呈負相關。敲低circRNA_000809引起的EESCs增殖、遷移能力及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相關蛋白ZEB1/ZEB2的表達下降，可以一定程度被miR-200c-3pinhibitor逆轉。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本：收集2020年1月至2022年1月于溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院行卵巢囊腫剝除術患者的卵巢巧克力囊腫組織25例，設為子宮內膜異位癥組；收集25例因早期宮頸癌行子宮切除術或者行宮腔鏡檢查的育齡期非子宮內膜異位癥患者的子宮內膜組織，設為正常子宮內膜組。納入研究的25例子宮內膜異位癥組年齡為25～39（32.0±3.1）歲，25例正常內膜組年齡為26～41（32.5±3.1）歲，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有患者的月經周期正常，并且至少在6個月內沒有性激素藥物治療。所有的組織樣品均在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院手術時收集，將標本快速儲存到液氮中以備后用。本研究已獲得溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準（編號：LCKY2020-88），患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑：Lipofectamine3000購自杭州禹揚科技有限公司；si-NC、si-circRNA_000809、inhibitor NC與miR-200c-3p inhibitor購自廣州銳博生物公司；TRIzol試劑購自杭州禹揚科技有限公司；反轉錄試劑購自日本東洋紡公司；qRT-PCR試劑購自美國Thermo Fisher公司；EdU試劑盒購自上海碧云天科技有限公司；兔抗人ZEB1、ZEB2和Vimentin抗體購自武漢三鷹科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和qRT-PCR：使用TRIzol試劑從冷凍組織的異位子宮內膜和正常子宮內膜中提取總RNA，并用200 mL無核酸酶的水洗脫，NanoDrop ND-1000分光光度計檢測RNA濃度，樣品在260 nm/280 nm的吸光度比要求在1.8～2.0間。取1.0 μg總RNA于反轉錄試劑盒中進行反轉錄反應。將反轉錄產物在PCR擴增儀中進行擴增，反應條件為94 ℃、10 min預變性；95 ℃、30 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，循環(huán)40次。以小核RNA（snRNA）U6作為內參，使用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達水平。

1.2.2 人EESCs的原代培養(yǎng)：人EESCs的提取參照文獻[9-10]。用含2%青霉素-鏈霉素的枸櫞酸鹽緩沖液（PBS）沖洗異位子宮內膜組織，然后將其切成約1 mm3的碎片，并在膠原酶IV（5 mg/mL，15 U/mg）溶液中水浴消化1 h。通過400目的過濾器（美國紐約Falcon公司）分離EESCs，并用含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基懸浮EESCs。將細胞置入75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，在含5% CO2的37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。利用波形蛋白（vimentin）的免疫熒光化學染色進行細胞純度鑒定。

1.2.3 細胞轉染：si-NC、si-circRNA_000809、inhibitor NC與miR-200c-3pinhibitor均使用Lipofectamine 3000作為脂質體進行轉染。inhibitor NC與miR-200c-3pinhibitor的濃度為100 nmoL/L，si-NC與si-circRNA_000809的濃度為50 nmoL/L。siNC（小干擾RNA陰性對照）+inhibitor NC（核酸抑制劑陰性對照），si-circRNA_000809（circRNA_000809小干擾RNA）+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor（miR-200c-3p核酸抑制劑）。

1.2.4 細胞增殖能力測定：先將EESCs在無血清培養(yǎng)基中饑餓24 h。轉染24 h后使用5-乙炔基-2’-脫氧尿苷（EdU）分析試劑盒檢測細胞增殖能力。通過將EdU陽性細胞的數量除以DAPI染色的細胞總數，可以計算出EdU陽性細胞的百分比。所有實驗需進行至少3次。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移能力：取各組轉染24 h的EESCs，懸浮在200 μL DMEM中加至上層小室，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加700 μL至下層小室，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，應用顯微鏡測量遷移細胞數。

1.2.6 蛋白質印跡（Western blot）法：以含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μL提取轉染48 h的EESCs總蛋白，吸取蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE電泳，并用300 mA的電流將蛋白轉移至PVDF膜，快速封閉液封閉15 min后，分別于4 ℃孵育一抗稀釋液（兔抗人ZEB1、ZEB2及ACTB抗體，均為1:500）18 h，于室溫孵育二抗稀釋液（HRP標記的山羊抗兔二抗，1:3 000）1 h，在ECL中顯影，采用ImageJ軟件分析各條帶相對于內參ACTB的灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用Graphpad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。相關性采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組子宮內膜組織中circRNA_000809表達比較circRNA_000809在異位子宮內膜組的表達水平較正常子宮內膜組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測circRNA_000809在正常子宮內膜組織和異位子宮內膜組織中的表達水平

2.2 EESCs中circRNA_000809與miR-200c-3p相關性分析 qRT-PCR結果顯示，與正常內膜組織比，miR-200c-3p在異位內膜組織中表達下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2A。StarBase軟件預測，circRNA_000809與miR-200c-3p間存在結合位點，見圖2B。circRNA_000809和miR-200c-3p相關性分析顯示，EESCs中兩者表達呈負相關（r=-0.56，P=0.03），見圖2C。為證實circRNA_000809與miR-200c-3p間調控關系，用si-circRNA_000809（circRNA_000809小干擾RNA）轉染EESCs，結果顯示敲低circRNA_000809可以上調miR-200c-3p的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.32，P＜0.05），見圖2D。

圖2 EESCs中circRNA_000809與miR-200c-3p相關性分析

2.3 敲低circRNA_000809對EESCs增殖能力的影響 分別用siNC+inhibitor NC、si-circRNA_000809+inhibitor NC和si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor共轉染EESCs。與siNC+inhibitor NC組比，si-circRNA_000809+inhibitor NC組EESCs增殖能力減弱，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor組EESCs增殖能力較si-circRNA_000809+inhibitor NC組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A和圖3B。這表明miR-200c-3pinhibitor使EESCs增殖能力一定程度回升，敲低circRNA_000809通過下調miR-200c-3p表達逆轉EESCs增殖能力。

圖3 敲低circRNA_000809對EESCs增殖能力的影響

2.4 敲低circRNA_000809對EESCs遷移能力的影響 與siNC+inhibitor NC組比，si-circRNA_000809+inhibitor NC組EESCs遷移能力減弱，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor組與si-circRNA_000809+inhibitor NC組比EESCs遷移能力增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4A和圖4B。敲低circRNA_000809通過下調miR-200c-3p表達逆轉EESCs遷移能力。

圖4 敲低circRNA_000809對EESCs遷移能力的影響

2.5 敲低circRNA_000809對ZEB1/ZEB2蛋白表達的影響 與siNC+inhibitor NC組比，si-circRNA_000809+inhibitor NC組ZEB1/ZEB2蛋白水平顯著下調，而si-circRNA_000809+miR-200c-3pinhibitor組ZEB1/ZEB2蛋白水平較si-circRNA_000809+inhibitor NC組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）見圖5A-C。敲低circRNA_000809通過下調miR-200c-3p表達逆轉EESCs ZEB1/2蛋白表達水平。

圖5 敲低circRNA_000809對ZEB1/2蛋白表達水平的影響

3 討論

子宮內膜異位癥指有活性的子宮內膜組織生長在子宮體以外的部位，常見于卵巢、子宮骶韌帶以及子宮直腸陷凹，引起盆腔包塊、進行性加重的痛經、性交痛以及不孕等，嚴重影響患者身心健康及生活質量[11-12]。子宮內膜異位癥的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，在育齡期女性中發(fā)病率為10%～15%，在不孕患者中發(fā)病率高達30%～50%，給患者帶來了巨大的經濟負擔[13-14]。但其發(fā)病機制仍不清楚，目前主要包括一些理論學說，經血逆流學說，體腔上皮化生學說，淋巴、血行轉移及炎癥免疫學說等[15]，但這些學說均不能完全解釋子宮內膜異位癥的發(fā)病機制，因此探討其發(fā)病機制是當前子宮內膜異位癥的研究熱點。

非編碼RNA，如circRNA和miRNA是無蛋白編碼能力的功能性RNA分子。circRNAs結構上以共價閉合環(huán)的形式替代了5’末端帽子和3’末端的多聚腺苷酸尾結構[6]。隨著相關研究的深入，越來越多的證據表明circRNAs參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，而且circRNAs可作為miRNAs的內源競爭性RNA（competing endogenouse,ceRNA）參與子宮內膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展過程[16]。下調circ_0000673通過miR-616-3p/PTEN軸促進子宮內膜異位癥細胞增殖和遷移[17]。circZFPM2通過調控miR-205-5p/ZEB1信號通路促進子宮內膜異位癥EMT[18]。miR-200c-3p是一個良好的抑癌基因[19]，且前期研究結果表明miR-200c-3p可以抑制EESCs的眾多表型，但是在子宮內膜異位癥中尚未見報道內源性競爭miR-200c-3p從而共同調控子宮內膜異位癥進程的circRNAs。

本研究利用生物信息學分析發(fā)現circRNA_000809與miR-200c存在結合位點，且用qRT-PCR實驗檢測到，與正常內膜組織相比，circRNA_000809在異位內膜組織中呈高表達，提示circRNA_000809可能在子宮內膜異位癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要調控作用。進一步研究發(fā)現敲低circRNA_000809后miR-200c-3p的表達量上調。miR-200c-3p在子宮內膜異位癥中呈低表達，相關性分析表明circRNA_000809與miR-200c-3p在子宮內膜異位癥中的表達量呈負相關。以上結果說明，circRNA_000809可作為miR-200c-3p的ceRNA參與子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。利用回復實驗對該結論進行了驗證，其結果也表明敲低circRNA_000809對EESCs增殖能力及遷移能力的抑制，可以通過共轉染miR-200c-3pinhibitor得到逆轉，進一步說明circRNA_000809與miR-200c-3p的相互作用可以調控子宮內膜異位癥進程。

研究表明，EMT在子宮內膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。EMT參與了子宮內膜異位癥局部病灶的形成，局部炎癥的損傷、修復和纖維化過程[20]。EMT相關蛋白ZEB1和ZEB2是miR-200c-3p已知的靶基因[19]。本研究發(fā)現敲低circRNA_000809可以抑制EMT相關蛋白ZEB1/ZEB2的表達，并可以被miR-200c-3p在一定程度上逆轉。這些結果表明circRNA_000809通過作用于miR-200c-3p調控ZEB1/ZEB2的表達，進而調控EMT的進展，從而影響子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，circRNA_000809在子宮內膜異位癥中表達水平升高，而miR-200c-3p的表達水平降低。circRNA_000809通過ceRNA機制調控miR-200c-3p，進而調控EESCs的增殖、遷移及EMT相關蛋白ZEB1/ZEB2的表達。circRNA_000809/miR-200c-3p/EMT軸可能成為子宮內膜異位癥分子治療的潛在靶點。