李小妹 ，王利利，李 想 ，杜麗艷

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是最常見的甲狀腺癌病理類型，約占所有類型的80%。最新調(diào)查結(jié)果顯示，過去的30年間，全球PTC的發(fā)病率增加了約58%，因此對于PTC臨床和基礎(chǔ)研究的價值逐漸凸顯[1]。作為一種內(nèi)分泌腫瘤，PTC受到多種基因影響，尤其是BRAFV600E基因突變被認(rèn)為是目前最常見的基因變異，在PTC形成過程中發(fā)揮重要作用，影響其發(fā)生、侵襲及預(yù)后，被公認(rèn)為是PTC最主要的不良影響因子之一[2]。131I是PTC的主要治療方法，其發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)依賴細(xì)胞基底膜表達(dá)的鈉碘轉(zhuǎn)運體(NIS)，以保證細(xì)胞必須具有較強的攝碘能力，然而，NIS在PTC組織內(nèi)的表達(dá)是下降或者缺失的，從而導(dǎo)致131I治療效果不佳，也有研究[3]表明BRAF突變可能影響NIS蛋白表達(dá)，因此本文將繼續(xù)探討PTC中常見的遺傳學(xué)事件BRAFV600E突變與NIS表達(dá)的相互關(guān)系，為PTC病人放射性131I治療效果的預(yù)測提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2019年1月我院收治104例行手術(shù)治療的PTC病人，其中男25例，女79例，年齡23～68歲，平均年齡(42.5±3.9)歲，留取全部病人術(shù)中新鮮PTC組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本進(jìn)行觀察研究，組織標(biāo)本均分成2份，1份置于液氮中保存，1份置于10%甲醛溶液中固定后用于免疫組織化學(xué)(免疫組化)檢測。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)標(biāo)本均經(jīng)2位病理科高資歷醫(yī)生確認(rèn)為PTC病例；(2)術(shù)前未進(jìn)行甲狀腺素類藥物、生物制劑、放射及手術(shù)治療；(3)癌旁正常組織標(biāo)本選擇準(zhǔn)確，排除橋本性甲狀腺炎等病理類型干擾；(4)術(shù)前完善頸部彩超及甲狀腺功能檢查；(5)病人及家屬知曉研究目的，并簽署知情同意書。

1.3 BRAFV600E基因突變檢測 全部病理標(biāo)本經(jīng)石蠟處理后經(jīng)10%中性甲醛固定。復(fù)查HE切片，并選擇合適的石蠟標(biāo)本進(jìn)行試驗研究，5 μm厚度連續(xù)切片，每例樣本5片，置于1.5 mL Eppendorf管中，寄送上海生工生物工程有限公司，采用Sanger測序技術(shù)對組織樣本進(jìn)行測序(Sanger測序儀ABI3730，德國Qiagen 公司)

1.4 Real-Time PCR檢測NIS mRNA表達(dá) 取PTC組織2 g，立即置液氮中，-70 ℃保存待用。采用TRIzol試劑盒(Gibco) 提取PTC組織總RNA，用作Real-Time PCR模板。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，準(zhǔn)備八聯(lián)排，倒轉(zhuǎn)反應(yīng)預(yù)混試劑管，短暫離心管，使內(nèi)容物沉積并除去氣泡，吸取反應(yīng)預(yù)混試劑到八聯(lián)排每一個孔中，樣本吸取至反應(yīng)孔中，用光學(xué)蓋膜覆蓋八聯(lián)排，將八聯(lián)排置于冰上，直到將其裝入定量PCR ABI7500儀。

1.5 免疫組織化學(xué)(免疫組化)

1.5.1 免疫組化步驟 石蠟包埋標(biāo)本切片，厚度為5μm，進(jìn)行組織化學(xué)染色。應(yīng)用PV-6000-G二步法免疫組化，具體步驟為：脫蠟、水化；3%H2O2去離子水孵育5 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗2～3 min；滴加一抗(NIS)4 ℃過夜后37 ℃復(fù)溫，PBS洗3次各2～3 min；滴加通用型IgG(二抗)37 ℃孵育15 min，PBS洗3次各2～3 min；應(yīng)用DAB顯色；蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明封片。

1.5.2 免疫組化評定標(biāo)準(zhǔn) 陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]:NIS蛋白表達(dá)定位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞基底部質(zhì)膜、周邊質(zhì)膜側(cè)或細(xì)胞質(zhì)，染色呈淡黃色到棕褐色不等。以PBS代替一抗作為陰性對照，以癌旁正常甲狀腺組織作為陰性對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用秩和檢驗和χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PTC BRAFV600E基因突變情況分析 BRAFV600E基因突變檢測標(biāo)本共104例，結(jié)果表明，BRAFV600E基因突變型共70例，突變率為67.3%，野生型34例，突變率為32.7%，同樣來源于104例PTC觀察對象的癌旁正常組織一起進(jìn)行BRAFV600E基因突變檢測，結(jié)果提示均為野生型。組間突變率比較差異明顯(χ2=105.51,P<0.01)。

2.2 不同甲狀腺組織NISmRNA和NIS蛋白表達(dá) 所提取的總RNA經(jīng)微量核算定量分析儀檢測濃度，結(jié)果提示：PTC組織中NISmRNA的表達(dá)濃度低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與癌旁正常組織相比，NISmRNA表達(dá)下調(diào)90例(86.5%)，14例表達(dá)上調(diào)(13.5%)。免疫組化檢測結(jié)果顯示，PTC組織中，NIS蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織(P<0.01)(見表1)。

2.3 不同甲狀腺組織中NISmRNA及NIS蛋白表達(dá)的關(guān)系 熒光定量PCR檢測及免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織比較，PTC組織中NISmRNA表達(dá)下降的同時，有76例NIS蛋白表達(dá)上調(diào)，14例NIS蛋白表達(dá)下調(diào)，NISmRNA表達(dá)上調(diào)時，14例NIS蛋白表達(dá)上調(diào)，PTC組織中NISmRNA表達(dá)下調(diào)同時NIS蛋白表達(dá)上調(diào)的比例明顯高于癌旁正常組織。

2.4 PTC NISmRNA及NIS蛋白表達(dá)與BRAFV600E基因突變的關(guān)系 PTC BRAFV600E基因突變病人NISmRNA表達(dá)濃度為1.57×106copies/mL，明顯低于野生型NISmRNA表達(dá)濃度1.74×106copies/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；PTC BRAFV600E基因突變病人中NIS蛋白表達(dá)陽性者49例，陽性率為70.0%，野生型病人中NIS蛋白表達(dá)陽性者28例，陽性率為82.4%，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 PTCNISmRNA及NIS蛋白表達(dá)與BRAFV600E基因突變的關(guān)系

3 討論

近年來，相關(guān)研究中通過基因組技術(shù)和癌基因的篩查發(fā)現(xiàn)BRAF基因是特異性較強的PTC基因，BRAF突變也是目前PTC中最為常見的基因變異，表現(xiàn)為第15外顯子上第1 799位核苷酸上的胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)換為腺嘌呤(A)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物中第600位的織氨酸(V)轉(zhuǎn)換為谷氨酸(E)所致[2]。國外報道稱PTC中BRAFV600E基因突變發(fā)生率明顯高于其他相關(guān)通路蛋白編碼基因，為28%～80%，且其突變率可能與病人年齡、地區(qū)分布及檢測方法相關(guān)[5]。本研究中共104例PTC標(biāo)本中，BRAFV600E基因突變率為67.3%，與西方國家的報道值相比偏高，但是與韓國等亞洲國家的報道水平相當(dāng)[6]，考慮可能為種族因素所導(dǎo)致，同時也與樣本數(shù)量、納入標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法相關(guān)，如本研究中我們的全部納入對象均為單純PTC診斷，無并發(fā)橋本甲狀腺炎病人，同時并未對病理分期進(jìn)行篩選，這與其他文獻(xiàn)中的納入對象存在性質(zhì)差異。同時我們觀察到雖然癌旁正常組織中無BRAFV600E基因突變發(fā)生，但PTC組織中依然存在約30%以上的假陰性可能，因此說明BRAFV600E基因突變檢測在目前只適用于特異性診斷。而ZATELLI等[7]2009年的研究中也特別提出，BRAFV600E基因突變檢測可提高病理診斷敏感性，但對于PTC診斷的局限性不可忽視。

NIS是鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)體家族的一種膜蛋白,它主要介導(dǎo)碘的轉(zhuǎn)運,NIS對碘的攝取和濃集作用是甲狀腺激素合成的主要步驟，PTC病人甲狀腺細(xì)胞殘留一定水平的攝碘功能，這也是臨床上131I治療的理論基礎(chǔ)，但最近研究發(fā)現(xiàn)部分病人由于甲狀腺細(xì)胞“去分化”失去聚碘功能，導(dǎo)致131I初治或復(fù)治的效果不佳[8]，BASTOS等[9]研究中發(fā)現(xiàn)NIS表達(dá)強度低于正常組織，于是認(rèn)為是NIS低表達(dá)或不表達(dá)所致，而某些研究則提出相反結(jié)論，認(rèn)為NIS是正常表達(dá)，甚至過度表達(dá)，但定位錯誤，使細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)與膜表達(dá)顛倒而出現(xiàn)功能障礙。本研究中，NIS蛋白表達(dá)強度明顯高于癌旁正常組織，且發(fā)現(xiàn)NIS蛋白多定位于基膜兩側(cè)或細(xì)胞質(zhì)中，與既往的研究結(jié)論基本一致，而與相反結(jié)論的研究對比分析，認(rèn)為可能是其他調(diào)節(jié)因子調(diào)控作用所造成的差異[10]。同時本研究結(jié)果中NISmRNA表達(dá)水平為1.56×106copies/mL，與癌旁正常組織相比水平較低，分析原因認(rèn)為這種看似不合理的現(xiàn)象可能與各因素對于轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后同時施加影響所致。

BRAFV600E基因突變的遺傳學(xué)事件和NIS表達(dá)之間是否存在聯(lián)系？2012年高衛(wèi)厲[11]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比較，BRAFV600E基因突變型PTC病人對于131I治療的效果較差，2017年茹曉婷等[12]進(jìn)一步研究說明，BRAFV600E基因突變可通過TGF-β等因子介導(dǎo)影響NIS正常表達(dá)秩序，在破壞甲狀腺細(xì)胞正常攝碘能力的同時，加重PTC病人惡性程度。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E基因突變型PTC病人NISmRNA表達(dá)水平低于野生型，但是在NIS蛋白表達(dá)強度比較中則無明顯差異，這可能與樣本量，免疫組化石蠟組織中癌組織偏小等有關(guān)，但同時也說明對于野生型PTC病人其131I治療效果可能相對較佳。

綜上所述，PTC病人中BRAFV600E基因突變的發(fā)生，可作為重要的遺傳學(xué)事件獨立預(yù)測PTC的預(yù)后，指導(dǎo)基因靶向治療，同時BRAF與NIS之間緊密的生物學(xué)行為聯(lián)系，可使BRAF成為PTC病人131I治療療效新的預(yù)測指標(biāo)，我們會繼續(xù)跟進(jìn)研究。