余治國，李延光

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)傳統(tǒng)治療方式主要包括放療、化療、手術等，據(jù)統(tǒng)計病人的5年生存率僅約15%[1]。已知NSCLC細胞的遷移和侵襲能力與病人的預后密切相關，因此，有必要深入研究調(diào)控NSCLC細胞遷移和侵襲的關鍵因子，為NSCLC的治療提供新思路[2-4]。目前已發(fā)現(xiàn)許多具有遷移能力的癌細胞都存在Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族成員3(WASF3)高表達的情況，WASF3的功能與細胞運動有關，可參與神經(jīng)元遷移、創(chuàng)傷修復以及細胞應激等過程[5]，在正常細胞中處于沉默狀態(tài)，WASF3基因的異常表達通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重組，誘導了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-7]，因此推測該基因或成為降低癌細胞遷移能力的重要靶向目標，目前該基因在NSCLC中的表達及其作用機制目前尚不明確。有研究[8-11]證實，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路是促進肺癌細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進程的主要調(diào)節(jié)途徑，可使腫瘤細胞運動及遷移能力增強。本研究選擇NSCLC病人A549細胞和正常肺細胞MRC-5為研究對象，比較2種細胞中WASF3表達水平；設計針對WASF3的反義寡核苷酸(WASF3-AS)，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，觀察其對A549細胞增殖和遷移能力的影響，并探討其作用機制?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人NSCLC細胞A549和人正常肺細胞MRC-5購自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。TRIzol和脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；WASF3-NC、WASF3-AS及PCR引物序列均由上?？党缮锕こ逃邢薰驹O計合成，其中WASF3-NC序列為：5′-AGU CAC AAU CCU GAU UAG ACA U-3′，WASF3-AS為：5′-AUC ACU UAC UUA CGA GUG UUG A-3′；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海玉博生物科技有限公司；RNA提取試劑、PCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑購于上海威奧生物科技有限公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；鼠抗人磷酸酶和緊張素同系物PTEN、磷酸化蛋白激酶 B(p-Akt)單克隆抗體，兔抗人磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)單克隆抗體，鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞轉(zhuǎn)染使用陽離子脂質(zhì)體法：將A549細胞分為空白對照組、WASF3-NC組(陰性對照組)、WASF3-AS組(反義寡核苷酸 WASF3組)，轉(zhuǎn)染前將細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至70%～80%融合后，按照脂質(zhì)體2000說明書，使用無胎牛血清的培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后孵育6 h，更換為含10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR法 Trizol法提取A549和MRC-5細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。WASF3、PTEN、PI3K、p-Akt和GAPDH引物序列均由上?？党缮锕こ逃邢薰驹O計合成，WASF3上游5′-GTG GAT CGT ACA TGC G-3′，下游5′-GCA TGC CAT ATG ATT CCG GCC-3′；PTEN上游5′-TCT CCT ATT CGG TGT GGA AGC AC-3′，下游5′-CCT TAC AGT GCA CTT ATA TTA A-3′；PI3K上游 5′-CCT GTT GAC CAG CTA GGT G-3′，下游5′-CAG TCT AGC AGA CAAG AC-3′；p-Akt上游5′-ACA CCG GGA CTT CGT CCG AG-3′，下游5′-TGC TGC TAC ACA GGC TTA TA-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-GTT CTC TAG GTC GAG AGA G-3′，下游5′-CTT CTC ACG ACT CGA GGA G-3′。反應條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃ 30 s，退火延伸30 s，72 ℃ 1 min，32～35個循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min，中止反應。瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)(GENE GENIUS)采集圖片，然后應用Quantity one(Bio-Rad，CA)凝膠分析軟件得出電泳譜帶吸光度值，計算各組目的基因譜帶與GAPDH基因譜帶吸光度值的比值，并進行基因表達差異分析。

1.2.3 CCK-8法 取對數(shù)生長期的3組A549細胞，0.25%胰蛋白酶消化后計數(shù)，按1.5×106個/孔，加入96孔板，設4個復孔分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，每孔加入CCK-8液10 μL作用2 h，使用酶標儀讀取各孔490 nm波長處的吸光度值。

1.2.4 細胞克隆實驗 取對數(shù)生長期的A549細胞，以400個/孔接種于6孔板，輕微搖晃細胞板，使細胞分散均勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2～3周，當細胞克隆肉眼可見時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，再用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，甲醛固定15 min，吉姆薩染色20 min，沖洗后干燥，拍照、計數(shù)細胞克隆數(shù)目，計算細胞克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))× 100%。

1.2.5 Transwell細胞遷移實驗 取對數(shù)生長期各組細胞懸浮液，將細胞濃度調(diào)節(jié)至5×105/mL，每組設5個復孔。上室中加入200 μL細胞懸浮液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h；PBS漂洗去除上室中未遷移的細胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下每孔取 5個視野觀察并拍照，統(tǒng)計各組遷移細胞數(shù)目。

1.2.6 Western blotting法 A549細胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入全蛋白提取液，離心收集上清液，應用BCA法測定蛋白濃度。各組收集等量的目標蛋白樣本，行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入鼠抗人PTEN單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人PI3K單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人p-Akt單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，滴加HRP標記的二抗，室溫靜置1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯色，暗室中曝光、顯影、定影，Quantity one軟件對掃描圖像進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中WASF3表達水平比較 RT-qPCR實驗結(jié)果顯示，與人正常肺細胞MRC-5比較，A549細胞各組中WASF3的mRNA相對表達量均增加(P<0.05～P<0.01)；空白對照組和WASF3-NC組的WASF3的mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但均高于WASF3-AS組(P<0.05和P<0.01)(見表1)。

表1 各組細胞中WASF3表達水平比較

2.2 A549各組細胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染后24 h，3組A549細胞增殖水平之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與WASF3-NC組比較，轉(zhuǎn)染后48、72、96 h WASF3-AS組細胞增殖水平明顯降低(P<0.05)(見表2)。

表2 A549各組細胞增殖能力(吸光度值)比較

2.3 A549各組細胞克隆形成率和細胞遷移數(shù)目比較 細胞轉(zhuǎn)染14 d后，觀察培養(yǎng)皿中克隆形成結(jié)果顯示，與空白對照組和WASF3-NC組比較，WASF3-AS組細胞克隆形成率和細胞遷移數(shù)目均明顯降低(P<0.05)(見表3及圖1、2)。

表3 A549各組細胞克隆形成率和細胞遷移數(shù)目比較

2.4 各組A549細胞中PTEN、PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相對表達量比較 與空白對照組比較，WASF3-NC組PTEN、PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與WASF3-NC組比較，WASF3-AS組細胞的PTEN mRNA和蛋白相對表達量明顯增加，PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相對表達量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表4、圖3)。

表4 各組A549細胞中PTEN、PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相對表達量比較

3 討論

肺癌是我國致死率較高的惡性腫瘤之一，其中85%～90%的肺癌為NSCLC[12]。隨著肺癌免疫治療和分子靶向治療的發(fā)展，針對肺癌發(fā)生的分子機制和腫瘤關鍵標志物值得進一步探討[13]。近年研究證實WASF3基因在正常細胞中處于沉默狀態(tài)，而在多種腫瘤細胞中異常激活，有研究[14-15]認為WASF3基因的異常表達可通過重組肌動蛋白骨架進而促進惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

PI3K/Akt 信號通路是多種腫瘤發(fā)生的關鍵調(diào)控路徑，在多種人類腫瘤中普遍存在，在肺癌中也發(fā)現(xiàn) p-AKT的表達明顯高于正常組織，并促進肺癌的遷移[16]。PTEN是人染色體缺失的張力蛋白同源基因，同時具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，可使PI3K激活后產(chǎn)生的三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化，進而抑制PI3K/Akt信號通路的活性，因此PTEN是PI3K/Akt信號通路的主要負調(diào)控基因，具有抑癌活性。PTEN基因在胃癌、肺癌、宮頸癌等腫瘤中存在不同程度的突變、缺失或低表達，導致P13K/Akt信號通路活化，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]，目前認為PTEN-PI3K/Akt信號通路可調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞生長增殖、凋亡、遷移、浸潤等過程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLCA549細胞的WASF3相對表達量明顯高于人正常肺細胞MRC-5細胞，提示W(wǎng)ASF3基因的異常激活可能參與了NSCLC的發(fā)生與發(fā)展。轉(zhuǎn)染W(wǎng)ASF3-AS后，WASF3-AS組的WASF3相對表達量明顯減少，提示轉(zhuǎn)染成功；WASF3-AS組的A549細胞增殖水平、細胞克隆形成率、細胞遷移個數(shù)均明顯低于空白對照組與WASF3-NC組，提示W(wǎng)ASF3-AS能抑制A549細胞的增殖和遷移；WASF3-AS組細胞PTEN mRNA和蛋白表達水平明顯高于空白對照組與WASF3-NC組，PI3K、p-Akt mRNA和蛋白表達水平明顯低于空白對照組與WASF3-NC組，提示NSCLC細胞可能通過激活PTEN基因負向調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，進而抑制NSCLC細胞的增殖、克隆形成和遷移。