李晨晨，吳亞星，劉翠翠，孟 箭，張 靜,,3

牙周組織的慢性、持續(xù)性炎癥導(dǎo)致牙槽骨病理性吸收，最終造成牙齒松動甚至脫落，為成年人失牙的主要原因[1-2]，如何促進(jìn)牙周骨組織再生成為目前研究的熱門話題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)具有取材方便、易在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增等優(yōu)勢，在一定條件下具有成骨分化的潛能，是組織工程技術(shù)常用的種子細(xì)胞[3-4]。

大量文獻(xiàn)[5-6]顯示炎性環(huán)境下BMMSCs具有免疫調(diào)控功能，通過與免疫細(xì)胞相互作用，分泌多種具有生物活性的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-1β、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等，參與不同的信號通路。當(dāng)處于炎癥環(huán)境時，BMMSCs通過減少炎癥因子分泌、調(diào)節(jié)局部炎癥微環(huán)境發(fā)揮其抗炎及免疫抑制作用[7-8]。在BMMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)時，堿性磷酸酶(ALP)、Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx 2)、骨鈣素(OCN)等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)增高。但是，炎癥環(huán)境下BMMSCs成骨相關(guān)蛋白表達(dá)及骨向分化機(jī)制尚不完全清楚。本研究擬通過檢測炎性環(huán)境下BMMSCs各成骨相關(guān)蛋白表達(dá)、上清液內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)以及這些炎癥因子對BMMSCs骨向分化中的影響?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(ScienCell,美國)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)；人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(Peprotech,美國)；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州四季青生物公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-Tek,美國)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天)；化學(xué)發(fā)光Western blotting試劑盒(Pierce公司)；ELISA檢測試劑盒(R&D Systems，美國)；BCA細(xì)胞蛋白提取試劑盒(碧云天)；ALP抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)；Runx 2抗體(Millipore，美國)；HRP標(biāo)記抗鼠二抗(博士德，武漢)；OCN抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)；HRP標(biāo)記抗兔二抗(Promega，美國)。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting檢測炎性環(huán)境下BMMSCs內(nèi)成骨相關(guān)蛋白(ALP、OCN、Runx2)的表達(dá) 將2×104細(xì)胞密度的BMMSCs細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，分為4組：空白對照組(僅更換培養(yǎng)液)；成骨誘導(dǎo)組(osteogenic medium，OM)；TNF-α炎癥刺激組；TNF-α刺激+OM組。10 %FBS的DMEM 培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至50 %時空白對照組僅更換培養(yǎng)液，OM組換礦化誘導(dǎo)液(含有50 μg/mL維生素C、10 % FBS的DMEM培養(yǎng)液、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1×10-8mol/L地塞米松)，炎癥因子刺激組為培養(yǎng)液內(nèi)加入100 ng/mL TNF-α，第4組更換礦化誘導(dǎo)液，同時加入100 ng/mL TNF-α，每3 d換液1次，7 d 后提取細(xì)胞總蛋白，GAPDH為內(nèi)參，采用 Image J對成骨相關(guān)蛋白(ALP、OCN、Runx2)的表達(dá)進(jìn)行條帶灰度分析，計算各目的蛋白的相對吸光度值(OD值)=目的蛋白/GAPDH。

1.2.2 ELISA 檢測炎性環(huán)境下BMMSCs上清液中各細(xì)胞因子的表達(dá) BMMSCs以1×105個/孔接種于24孔板中，含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁伸展匯合至50 %后棄原培養(yǎng)液，更換為礦化誘導(dǎo)液，實驗組同時加入100 ng/mL TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后收集各個培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，離心后取上清液進(jìn)行ELISA檢測。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選取450 nm波長進(jìn)行測定各組OD值并記錄檢測結(jié)果。每組樣本設(shè)3個復(fù)孔，每個實驗重復(fù)3次。

1.2.3 各炎癥因子對BMMSCs骨向分化的影響 將2×104細(xì)胞密度的BMMSCs細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用10%FBS的DMEM 進(jìn)行培養(yǎng)，待匯合至50%時，更換礦化誘導(dǎo)液，對照組不做處理，實驗組分別加入100 ng/mL IL-6、IL-8、IL-1β、TGF-β1、TGF-β2，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，礦化誘導(dǎo)7 d，提取細(xì)胞總蛋白，其中GAPDH為內(nèi)參，檢測成骨相關(guān)蛋白(ALP、OCN、Runx2)的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析、SNK-q檢驗和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 炎癥環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的影響 TNF-α作用7 d時，Western blotting結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)組及TNF-α作用下的成骨誘導(dǎo)組中成骨相關(guān)蛋白ALP、OCN、RUNX2表達(dá)水平均高于相應(yīng)的對照組(P<0.05)；TNF-α作用下的成骨組ALP表達(dá)水平較正常條件下的成骨組高，而OCN、RUNX2表達(dá)水平卻較正常條件下的成骨組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖1、表1)。

表1 不同培養(yǎng)條件下BMMSCs內(nèi)ALP、OCN、RUNX2蛋白表達(dá)的影響

2.2 炎癥環(huán)境下BMMSCs上清液中各細(xì)胞因子表達(dá) TNF-α作用下BMMSCs上清液中IL-6、IL-8、IL-1β、TGF-β1、TGF-β2細(xì)胞因子水平均較對照組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)水平在TNF-α作用后增加幅度較大，其中TGF-β1增幅最大(見表2)。

2.3 不同細(xì)胞因子作用下BMMSCs骨向分化蛋白的表達(dá) 各細(xì)胞因子組中ALP、RUNX2、OCN蛋白表達(dá)與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中ALP蛋白在TGF-β1組中表達(dá)水平均值為0.84±0.03，較IL-6、IL-8、IL-1β組中ALP蛋白表達(dá)水平高，較TGF-β2組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而RUNX2和OCN蛋白在TGF-β1組中表達(dá)最高，且與其他各組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2、表3)。

表3 分別加入不同細(xì)胞因子對不同組成骨相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的影響

3 討論

牙周炎主要是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁中脂多糖刺激導(dǎo)致牙周支持組織的破壞[8]。脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種炎癥因子共同參與炎癥過程，其中TNF-α是免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的最主要的促炎因子之一[10-11]，它可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。作為機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，TNF-α通過多種復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激機(jī)體局部炎癥反應(yīng)發(fā)生，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，能直接或間接地抑制成骨前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞并影響礦化結(jié)節(jié)的形成[12-13]。ALP是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，為骨向分化的標(biāo)志酶，與硬組織鈣化和修復(fù)有關(guān)。ALP的表達(dá)與細(xì)胞成骨分化狀態(tài)密切相關(guān)，在礦化組織形成中發(fā)揮著十分重要的作用[14]；Runx2或稱核心結(jié)合因子(core binding factora1，Cbfa1)，因其能激活間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系分化并能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成熟，而被作為成骨分化的關(guān)鍵因子，能調(diào)控多種成骨細(xì)胞標(biāo)記基因(包括ALP、Col-1、BSP和OCN)的表達(dá)及最終礦化的發(fā)生[15]；同時OCN主要在骨組織礦化形成期出現(xiàn)，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞向礦化發(fā)生期分化的標(biāo)志之一。JIANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后，干細(xì)胞成骨分化能力降低，成骨相關(guān)蛋白表達(dá)降低。相反，TNF-α抑制劑可下調(diào)miR-31的表達(dá)，直接促進(jìn)RUNX2的表達(dá)，增加干細(xì)胞成骨分化[17]。

在炎癥因子刺激下，BMMSCs具有抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有性免疫應(yīng)答的功能[18]。當(dāng)TNF-α等炎癥因子刺激后，BMMSCs才表現(xiàn)出其抗炎及免疫調(diào)節(jié)能力[19]。因此本實驗對在炎癥微環(huán)境中BMMSCs的成骨分化及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α作用下成骨誘導(dǎo)組ALP蛋白相對表達(dá)較正常環(huán)境的成骨誘導(dǎo)組高，但是OCN、RUNX2蛋白相對表達(dá)較正常組低，表明TNF-α作用的炎癥微環(huán)境下BMMSCs成骨分化能力并沒有明顯減弱，可能由于BMMSCs具有抗炎特性。

炎癥環(huán)境下BMMSCs可從骨髓中募集，向炎癥及損傷部位遷移、增殖并分化為相應(yīng)的受損細(xì)胞，通過分泌可溶性的細(xì)胞因子如抗炎因子(IL-10、TGF-β等)、促炎因子(IL-6、IL-8等)、吲哚胺2，3雙加氧酶等，發(fā)揮其抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，進(jìn)而促進(jìn)牙槽骨的修復(fù)再生[20-21]。有研究[22]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞在炎癥刺激后的早期會分泌較多的炎癥因子如IL-6、IL-8、IL-1β等，通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與破骨分化的過程，促進(jìn)骨組織吸收，而在炎癥刺激后期，為了維持自身免疫穩(wěn)定，間充質(zhì)干細(xì)胞減少炎癥因子分泌，增加抗炎因子的分泌，建立抗炎環(huán)境，發(fā)揮其免疫抑制作用，由炎癥初期以骨吸收為主的破骨過程轉(zhuǎn)化為后期以骨形成為主的成骨過程，促進(jìn)骨組織生成。為進(jìn)一步驗證BMMSCs是否具有抗炎特性及何種細(xì)胞因子主要參與發(fā)揮間充質(zhì)干細(xì)胞抗炎功能，我們對正常環(huán)境與炎癥刺激48 h時BMMSCs的上清液提取并采用ELISA法檢測上清液中IL-6、IL-8、IL-1β、TGF-β1、TGF-β2濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎癥組各細(xì)胞因子濃度均較正常組高，其中以TGF-β家族尤其TGF-β1增高最為顯著，說明炎癥刺激后BMMSCs可分泌抗炎因子TGF-β，證實了BMMSCs的抗炎特性，因此我們推測炎性環(huán)境誘導(dǎo)BMMSCs分泌的TGF-β(主要為TGF-β1)可能參與了BMMSCs骨向分化過程。為進(jìn)一步明確不同細(xì)胞因子對BMMSCs成骨分化的影響，我們在正常條件下，向各組中分別加入不同的細(xì)胞因子，結(jié)果顯示TGF-β1組成骨相關(guān)蛋白表達(dá)較高，證實TGF-β1主要參與BMMSCs的抗炎及其骨向分化的調(diào)控。

TGF-β是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族，在特定的條件下能有效地介導(dǎo)免疫反應(yīng)，抑制TNF-α表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)BMMSCs骨向分化。其中TGF-β1、TGF-β2都屬于TGF-β家族中的成員，功能相似。在本實驗中炎癥作用下TGF-β1表達(dá)增加量較TGF-β2顯著，且在正常條件下加入TGF-β1后BMMSCs成骨相關(guān)蛋白表達(dá)較加入TGF-β2高，表明TGF-β1抗炎能力較TGF-β2強(qiáng)。YU等[23]通過在BMMSCs礦化誘導(dǎo)液中加入TGF-β1和TGF-β2，檢測培養(yǎng)液中成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與TGF-β2相比，TGF-β1可以增加BMMSCs成骨能力；以往也有研究[24]顯示TGF-β2抑制劑可使炎癥下牙囊干細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)增加，茜素紅染色和ALP活性增加，這說明TGF-β1較TGF-β2可以增加炎癥環(huán)境下干細(xì)胞的成骨分化能力。

TGF-β通過參與BMMSCs成骨信號通路、與免疫細(xì)胞相互作用、結(jié)合相關(guān)蛋白等方式誘導(dǎo)成骨。最近研究[25-26]證實在炎癥環(huán)境下TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞具有抑制IFN-γ和TNF-α刺激產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，減少BMMSCs的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)BMMSCs成骨。同時Treg細(xì)胞也可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如TGF-β調(diào)控干細(xì)胞成骨分化的過程[27]。但目前關(guān)于炎性環(huán)境下TGF-β如何與免疫細(xì)胞相互作用促進(jìn)牙周骨組織再生的機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。