劉立天 王家琦 謝悅陶 張飛飛 黨懿 齊曉勇

1河北省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（石家莊050051）；2河北北方學(xué)院研究生院（河北張家口075000）

心力衰竭（heart failure，HF）是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，嚴(yán)重增加了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)和/或功能異常導(dǎo)致充盈和/或射血能力受損以致不能滿(mǎn)足機(jī)體供血需求的一種臨床綜合征［1-2］。沙庫(kù)巴曲纈沙坦作為一種血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑，可阻滯血管緊張素Ⅱ受體和抑制腦啡肽酶，抑制細(xì)胞肥大，發(fā)揮擴(kuò)張血管、利鈉、利尿、改善心肌重構(gòu)作用［3-5］，以其獨(dú)特的作用機(jī)制給心衰的治療帶來(lái)了新的希望［6］。但其療效觀察的依據(jù)還較為匱乏，急需進(jìn)一步闡釋其具體機(jī)制并評(píng)估該藥的安全性及有效性。本研究通過(guò)建立慢性心力衰竭兔模型后給予沙庫(kù)巴曲纈沙坦干預(yù)，通過(guò)觀察及測(cè)定心臟彩超、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、心肌組織病理、Ⅰ型膠原（collagenⅠ，ColⅠ）、Ⅲ型膠原（collagen Ⅲ，ColⅢ）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidases，MMP）及TGFβ/Smad 信號(hào)通路表達(dá)，探討沙庫(kù)巴曲纈沙坦對(duì)慢性心衰心室肌重構(gòu)的影響及其機(jī)制，旨在為臨床更好地治療心力衰竭提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔30 只，雌雄不限，體質(zhì)量約3.0～3.5 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2016-002。飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨研中心動(dòng)物房，室溫條件下分籠飼養(yǎng)。本研究已經(jīng)過(guò)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要儀器和試劑 注射用青霉素鈉160 萬(wàn)單位/支購(gòu)自華北制藥有限公司，戊巴比妥鈉，液氮，4%甲醛，沙庫(kù)巴曲纈沙坦100 mg/片購(gòu)自北京諾華制藥有限公司，兔N 末端腦鈉肽前體（N-terminal proBNP，NT-proBNP）試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技有限公司，抗TGF-β 抗體購(gòu)自博士德生物工程有限公司，抗α-SMA 抗體購(gòu)自萊恩生物科技有限公司，抗Col-1 及抗Col-3 抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗為山羊抗兔抗體購(gòu)自易瑞生物技術(shù)有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立慢性心力衰竭動(dòng)物模型 用3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）通過(guò)耳緣靜脈注射，充分麻醉后，將兔固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，備皮并消毒后于胸骨左緣肋間區(qū)打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，在升主動(dòng)脈根部遠(yuǎn)端1 cm 處游離約3～5 mm，于游離處環(huán)扎升主動(dòng)脈使其為原周長(zhǎng)60%，關(guān)閉胸腔。術(shù)后3 d均給予注射用青霉素鈉1.6 × 106U 肌肉注射。以術(shù)后12 周出現(xiàn)進(jìn)食減少、精神差等心衰癥狀同時(shí)行心臟彩超示左室射血分?jǐn)?shù)≤40%視為慢性心力衰竭模型制作成功。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 30 只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組開(kāi)胸但未行升主動(dòng)脈環(huán)扎術(shù)；心衰組開(kāi)胸并環(huán)扎升主動(dòng)脈；沙庫(kù)巴曲纈沙坦組行開(kāi)胸、環(huán)扎升主動(dòng)脈并于慢性心衰模型制作成功后給予8 周的沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療。假手術(shù)組因出血死亡1 只，心衰組因急性左心衰竭死亡1 只，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因麻醉意外死亡2 只。最終假手術(shù)組、心衰組存活9 只，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組存活8 只。心衰組、沙庫(kù)巴曲纈沙坦組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均滿(mǎn)足心衰標(biāo)準(zhǔn)，并于術(shù)后12 周模型制作成功后，予以沙庫(kù)巴曲纈沙坦組以每天10 mg/kg沙庫(kù)巴曲纈沙坦（北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20171054，規(guī)格：100 mg×14 片），進(jìn)行8 周灌胃干預(yù)。心衰組及假手術(shù)組均給予8 周生理鹽水灌胃。

1.3.3 心臟彩超檢測(cè) 藥物干預(yù)8 周末，使用IU22彩色超聲儀檢查心臟彩超，于M 型圖像測(cè)定各組左室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室縮短率（fractional shortening，LVFS）和左室收縮末內(nèi)徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）。以上各測(cè)量值連續(xù)測(cè)量3 次取平均值。

1.3.4 血清NT-proBNP檢測(cè) 藥物干預(yù)8周末，經(jīng)兔耳緣靜脈取血5 mL，使用離心機(jī)以3 000 r/min 離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）檢測(cè)各組血清NT-proBNP水平。

1.3.5 HE 染色及Masson 染色 藥物干預(yù)8 周末完成心臟彩超檢查后，處死同時(shí)留取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌組織標(biāo)本，使用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋心肌組織后切取5 μm 厚切片，并進(jìn)行Masson 染色及HE 染色，在光鏡下觀察各組心肌組織病理形態(tài)及纖維化程度。在Masson 染色后膠原纖維呈現(xiàn)綠色，采用Image Pluse6.0 軟件分析檢測(cè)各組心肌組織膠原纖維。

1.3.6 Western blot 采用Western blot 法檢測(cè)α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、MMP2、MMP9、TIMP1、TGF-β、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7 蛋白表達(dá)水平。將蛋白樣品加入凝膠孔中，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入5 ×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液與20 μg 相應(yīng)體積的總蛋白樣品并混合，應(yīng)用SDS-PAGE 凝膠于95 ℃變性10 min 后進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，采用轉(zhuǎn)移電泳將分離得到的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，并分別使用非標(biāo)記一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育并檢測(cè)。將轉(zhuǎn)移膜放入室溫?fù)u床上的封閉液中封閉緩慢搖動(dòng)1 h，將封閉的轉(zhuǎn)移膜放入一抗工作液中在4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，之后取出反應(yīng)膜放入平皿并充分洗去游離二抗，曝光洗片后，使用Image J 軟件分析各樣本的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26.0 進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示各組計(jì)量數(shù)據(jù)，采用方差分析及SNK-q檢驗(yàn)比較各組組間均數(shù)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟彩超檢測(cè)結(jié)果 藥物干預(yù)8 周后，與心衰組相比，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組的LVFS、LVESD 及LVEF 指標(biāo)明顯改善（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組心臟超聲圖像Fig.1 Echocardiographicindifferentgroup

2.2 各組血清NT-proBNP 檢測(cè)結(jié)果 藥物治療8 周后，與心衰組相比，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組血清NT-proBNP 水平明顯降低，但仍明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 藥物干預(yù)后心臟彩超及NT-proBNP 檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Echocardiography paramaters and NT-proBNP after drug intervention ±s

表1 藥物干預(yù)后心臟彩超及NT-proBNP 檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Echocardiography paramaters and NT-proBNP after drug intervention ±s

注：LVESD 為左心室收縮末期內(nèi)徑、LVEDD 為左心室舒張末期內(nèi)徑、LVEF 為左心室射血分?jǐn)?shù)、LVFS 為左心室短軸縮短率；NT-proBNP為N 末端B 型利鈉肽原；與假手術(shù)組相比，aP ＜0.05；與心衰組相比，bP ＜0.05

指標(biāo)LVESD（mm）LVEDD（mm）LVEF（%）LVFS（%）NT-proBNP（ng/mL）假手術(shù)組（n=9）6.78±0.833 11.06±0.73 57.56±5.41 34.56±2.59 296.36±18.05心衰組（n=9）12.44±1.01a 12.50±0.61a 35.56±2.70a 17.17±1.85a 391.59±28.35a沙庫(kù)巴曲纈沙坦組（n=8）10.38±0.92ab 12.00±2.00 45.00±2.51ab 25.69±1.51ab 343.71±11.35ab F 值86.447 3.155 74.904 161.021 47.229 P 值＜0.001 0.062＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 各組心肌組織病理檢查結(jié)果 藥物干預(yù)8 周后，心肌組織HE 染色示心衰組心肌組織肌纖維排列紊亂，細(xì)胞肥大。沙庫(kù)巴曲纈沙坦組較心衰組改善。Masson 染色示與假手術(shù)組相比，心衰組膠原纖維含量明顯增加（P＜0.05），沙庫(kù)巴曲纈沙坦組心肌組織膠原纖維沉積較心衰組明顯下降（P＜0.05）。Masson 染色后心肌組織中的膠原纖維呈綠色，肌纖維及纖維素則呈紅色。Masson 染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心衰組心肌組織中膠原纖維含量明顯增加［（10.01 ± 1.74）%vs.（4.36 ±0.93）%，P＜0.05］，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組心肌組織膠原纖維沉積較心衰組明顯下降［（10.01 ± 1.74）%vs.（5.43±1.12）%，P＜0.05］。見(jiàn)圖2。

圖2 HE、Masson 染色下的心肌組織病理（×200）Fig.2 Pathological of myocardial tissue in HE and Masson staining（×200）

2.4 心肌組織蛋白表達(dá)水平 各組心肌組織蛋白表達(dá)水平比較，與假手術(shù)組比較，心衰組α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Mmp2、Mmp9、TIMP1、TGF-β、Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Smad6、Smad7 蛋白表達(dá)下降；與心衰組相比，沙庫(kù)巴曲纈沙坦組心肌組織中α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、Mmp2、Mmp9、TGFβ、Smad2 及Smad3 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Smad6及Smad7 蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 及表2。

表2 心肌組織的蛋白表達(dá)水平Tab.2 Protein expression levels in myocardial tissues ±s

表2 心肌組織的蛋白表達(dá)水平Tab.2 Protein expression levels in myocardial tissues ±s

注：與假手術(shù)組相比，aP ＜0.05；與心衰組相比，bP ＜0.05

指標(biāo)α-SMA ColⅠColⅢMMP2 MMP9 TIMP1 TGF-β Smad2 Smad3 Smad6 Smad7假手術(shù)組（n=9）7 980.67±1 155.52 18 619.00±869.36 9 052.89±586.32 15 379.78±1 000.08 19 689.44±1 346.57 20 513.00±1 232.67 11 815.56±1 253.84 16 343.78±1 754.83 15 388.00±2 026.15 19 552.22±2 272.11 20 549.89±3 306.26心衰組（n=9）21 553.00±2 858.89a 23 448.56±867.52a 13 908.11±923.44a 18 976.33±1 741.46a 26 976.11±1 877.52a 26 031.89±3 309.79a 18 552.56±1 104.66a 21 439.44±962.25a 22 107.78±5 133.34a 14 366.56±696.02a 13 504.89±1 751.67a沙庫(kù)巴曲纈沙坦組（n=8）17 779.25±2 993.95ab 20 893.38±603.69ab 10 732.38±835.77ab 16 862.13.33±984.47ab 24 287.75±1 328.96ab 24 261.25±3 788.78 15 044.88±2 910.96ab 20 113.50±750.32ab 16 922.38±1 029.54ab 16 655.13±2 066.66ab 16 713.88±2 175.02ab F 值72.837 82.658 86.820 17.306 50.950 8.181 28.780 39.986 10.153 18.615 17.743 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001 0.002＜0.001＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

圖3 心肌組織蛋白Western blot 圖Fig.3 Western blot map of myocardial tissues Protein

3 討論

心肌重構(gòu)是慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，是以神經(jīng)內(nèi)分泌及血液動(dòng)力學(xué)共同介導(dǎo)，可引起膠原纖維增加以及心肌細(xì)胞肥大、凋亡、壞死，出現(xiàn)瘢痕形成及心肌纖維化，進(jìn)而發(fā)生心室壁肥厚。室腔形態(tài)改變及順應(yīng)性降低，心功能逐漸進(jìn)入失代償期，最終導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生［7］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活在HF 心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用，可激活成纖維細(xì)胞使膠原纖維合成增多，并可作用于基質(zhì)金屬蛋白，影響心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞凋亡及蛋白合成。研究表明，利鈉肽系統(tǒng)對(duì)RAAS 具有抑制作用，具有利鈉及擴(kuò)張血管作用，可改善心室組織纖維化及重構(gòu)［8-9］。

LEE等［10］研究發(fā)現(xiàn)，非缺血性心肌病患者經(jīng)沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療后，LVEF明顯改善。沙庫(kù)巴曲纈沙坦可改善HF 患者NT-proBNP、LVEF、LVEDD［11-12］，并可降低HF 患者再次住院率及死亡率［4］。本研究通過(guò)升主動(dòng)脈根部套扎法成功建立CHF 動(dòng)物模型，并根據(jù)既往相關(guān)研究中以10 mg/kg 沙庫(kù)巴曲纈沙坦給予HF 新西蘭兔可平衡利鈉肽系統(tǒng)與RAAS 為基礎(chǔ)給予干預(yù)［13］，研究結(jié)果與既往研究一致，給予CHF 兔8 周沙庫(kù)巴曲纈沙坦治療可改善LVFS、LVESD 及LVEF，降低血清NT-proBNP 水平，明顯改善心功能。

研究發(fā)現(xiàn)影響心臟纖維化和心肌重塑的信號(hào)蛋白，主要包括TGFβ/smad 家族成員2/3、ColⅢ、磷脂酰肌醇3-激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、MMP2、MMP9 及TIMP1，其中Smad 信號(hào)級(jí)聯(lián)在心臟纖維化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用［14-15］。BURKE 等［16］研究表明沙庫(kù)巴曲纈沙坦對(duì)HF 大鼠心肌組織中成纖維細(xì)胞有明顯抑制作用，可明顯改善因心臟后負(fù)荷增加而引起的心肌組織纖維化。本研究結(jié)果與既往研究一致，HE 染色結(jié)果表明，沙庫(kù)巴曲纈沙坦可降低心肌細(xì)胞變形壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度，并可改善HF 心肌組織中心肌纖維排列。膠原纖維蛋白沉積增加是心肌纖維化的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，Masson 染色結(jié)果顯示HF 心肌組織膠原纖維增生，且呈網(wǎng)狀分布于心肌纖維束之間，沙庫(kù)巴曲纈沙坦可改善CHF 兔心肌纖維化程度。正常心肌組織中膠原纖維主要由成纖維細(xì)胞分泌，在CHF 等病理狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞可增生并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力明顯提高，在心肌組織纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，α-SMA 是區(qū)分纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞的重要分子［17］。有研究表明，應(yīng)用腹主動(dòng)脈環(huán)扎法建立的慢性心力衰竭大鼠模型，檢測(cè)MMP2、MMP9、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達(dá)明顯增加，并可出現(xiàn)心功能不全及心臟結(jié)構(gòu)改變，提示其導(dǎo)致心室肌重構(gòu)的機(jī)制為促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及膠原纖維沉積［18］。研究表明沙庫(kù)巴曲纈沙坦可改善心肌重構(gòu)，降低死亡率，改善臨床預(yù)后［19］。本研究采用Western blot 技術(shù)發(fā)現(xiàn)慢性心衰兔心肌組織中MMP2、MMP9、TIMP1、TGF-β、Smad3 及Smad2 蛋白表達(dá)明顯增加，而Smad6、Smad7 蛋白表達(dá)降低；沙庫(kù)巴曲纈沙坦可明顯降低MMP2、MMP9、TGF-β、Smad3 及Smad2 蛋白表達(dá)水平，并可明顯提高Smad6 及Smad7 蛋白的表達(dá)水平。

在生理狀態(tài)下，TGF-β可提高Smad7表達(dá)水平，TGFβ/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受Smad7 負(fù)反饋調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)Smad7 蛋白表達(dá)增加，可減少由TGF-β 誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化，并可減少成纖維細(xì)胞合成膠原纖維［20］。本研究證實(shí)，在心衰組心肌組織中，TGF-β、Smad2 及Smad3 表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，Smad6、Smad7 表達(dá)減少，提示慢性心衰心肌組織中TGF-β/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，Smad7 對(duì)纖維化抑制作用減弱。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)沙庫(kù)巴曲纈沙坦可通過(guò)調(diào)節(jié)HF 心肌組織TGFβ/Smad 信號(hào)通路影響膠原纖維的沉積、降解，降低心肌纖維化，改善慢性心衰兔心室肌重構(gòu)。