賈波，孔永奎，趙言騰

（1.濟(jì)源市中心血站質(zhì)控科，河南 濟(jì)源459000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，河南 鄭州450052）

ABO 血型系統(tǒng)在臨床輸血和移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有重要意義，ABO 血型不合能引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病及移植排斥反應(yīng)等[1]。 ABO 血型系統(tǒng)中存在一些變異型或亞型， 影響常規(guī)血型血清學(xué)的檢測(cè)和判定。 近些年隨著單克隆抗體的應(yīng)用，對(duì)于B(A)亞型的鑒定逐漸引起國(guó)內(nèi)輸血工作者的重視，分子生物學(xué)試驗(yàn)越來(lái)越多地應(yīng)用于B(A)亞型的分析研究[2]，這極大降低了誤定血型而造成的輸血風(fēng)險(xiǎn)。 本文通過(guò)對(duì)1 例疑難的女性獻(xiàn)血者ABO 血型血清學(xué)的鑒定， 結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)最終確定其血型基因型為ABO*B(A).04/O.01.01，并探討分析其未來(lái)獻(xiàn)血、輸血等策略。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 無(wú)償獻(xiàn)血者，女性，19 歲，漢族，籍貫為河南省開(kāi)封市，在校大學(xué)生。 于2018 年11 月14 日第一次參加無(wú)償獻(xiàn)血， 血型血清學(xué)鑒定結(jié)果提示其ABO 血型正反定型不符，既往體健，無(wú)輸血史。

1.2 試劑與儀器 單克隆抗-A、 抗-B 血型定型試劑（批號(hào):20180306），抗-A1 試劑（批號(hào)：20180501），抗H 試劑（批號(hào)：20180808），人ABO 血型反定型用紅細(xì)胞試劑盒（批號(hào)：20185331），以上試劑由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供；人源抗-A 血清（本實(shí)驗(yàn)室制備，效價(jià)≥128）；DNA 基因組提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）；LATaqDNA聚合酶（大連TaKaRa 公司）；KA-2200 臺(tái)式離心機(jī)（日本久保田公司）、 三目顯微鏡 （萊卡DM500）、3730 基因測(cè)序儀（美國(guó)ABI）。

1.3 血型血清學(xué)方法 參照文獻(xiàn)[3]采用鹽水試管法進(jìn)行ABO 血型正反定型、吸收放散試驗(yàn)。

1.4 分子生物學(xué)方法

1.4.1 DNA 抽提和PCR 擴(kuò)增 采用北京天根公司的血液DNA 抽提試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提取該獻(xiàn)血者基因組DNA。 ABO 基因1-7 外顯子的擴(kuò)增采用上海生工合成的引物進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，包括25 μL 的2x La Taq Mix(內(nèi)含dNTP 和MgCl2)，2 μL 的正向引物，2 μL 的反向引物，4 μL的基因組DNA，ddH2O 17 μL，95℃預(yù)熱3min，95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，擴(kuò)增共計(jì)30 個(gè)循環(huán)后于72℃延伸7 min。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化和基因測(cè)序 采用蝦堿性磷酸酶及核酸外切酶I 純化PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。 于每5 μL PCR 產(chǎn)物中分別加入SAP 和Exo- I 各0.75 μL，37℃酶切反應(yīng)30 min，80℃酶失活15 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切純化后作為模板，采用3730 基因測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4.3 序列比對(duì)和分析 序列比對(duì)采用Chromas 軟件進(jìn)行，ABO 等位基因的命名方法參照ISBT 血型抗原等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)結(jié)果 正定型與單克隆抗-A 反應(yīng)呈w+，與人源抗-A 不反應(yīng)，與單克隆抗-B 呈4+凝集；與抗-H 反應(yīng)強(qiáng)度為：B 細(xì)胞＜自身細(xì)胞＜O 細(xì)胞；反定型與A1 細(xì)胞反應(yīng)2+，與B 細(xì)胞、O 細(xì)胞均不反應(yīng)，4℃正反定型試驗(yàn)有輕微增強(qiáng)；吸收放散試驗(yàn)證實(shí)該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞上有弱A 抗原存在。 見(jiàn)表1。

表1 血型血清學(xué)結(jié)果

2.2 ABO 基因檢測(cè)結(jié)果 對(duì)該例血型血清學(xué)鑒定不一致的標(biāo)本進(jìn)行1-7 外顯子直接測(cè)序， 測(cè)序結(jié)果與A1.01 參考序列比對(duì)， 顯示1-5 外顯子無(wú)突變， 第6-7 外顯子存在c.261delG，c.297A＞G，c.526C＞G，c.640A ＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G ＞C，c.930G ＞A 雜 合 突 變， 基 因 型 為ABO*B(A).04/O.01.01。 見(jiàn)圖1。

圖1 雜合突變位于B(A)04 亞型關(guān)鍵核苷酸c.640A＞G

2.3 B(A)04 亞型關(guān)鍵核苷酸差異 與A1.01 相比，存在c.297A＞G，c.526C＞G，c.640A＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G＞C，c.930G＞A 突變；與B.01 相比，多出了c.640A＞G 突變，提示B(A).04 的遺傳背景與B.01 基因有關(guān)。 見(jiàn)表2。

表2 ABO*BA.04 與參考序列差異比對(duì)

3 討論

ABO 血型的正確鑒定是保障臨床輸血安全性、有效性的重要前提，錯(cuò)誤的血型鑒定結(jié)果直接引發(fā)血液的誤輸注。 而輸注血型不合的血液可能引起輸血反應(yīng)[4]。因此一旦發(fā)現(xiàn)ABO 血型正反定型不相符，建議進(jìn)一步完善檢測(cè)方法[5]。 蘭炯采等[6]報(bào)道，對(duì)ABO 正反定型不一致的疑難血型檢定，第一步首先排除人為因素或操作失誤， 第二步對(duì)應(yīng)臨床資料予以歸納分類， 第三步設(shè)計(jì)針對(duì)性試驗(yàn)驗(yàn)證。 針對(duì)該例ABO 正反定型不一致結(jié)果進(jìn)行分析和設(shè)計(jì)進(jìn)一步試驗(yàn)：（1）應(yīng)用特殊分型試劑和吸收放散試驗(yàn)；（2）分子生物學(xué)方法。 具體到本例疑難血型的鑒定結(jié)果顯示，正定型與單克隆抗-A（w+），與人源抗-A（-），與單克隆抗-B（4+）；與抗-H 反應(yīng)強(qiáng)度依次為：B 細(xì)胞＜自身細(xì)胞＜O 細(xì)胞； 反定型與A1 細(xì)胞（3+），與B 細(xì)胞、O 細(xì)胞均（-）；吸收放散試驗(yàn)證實(shí)該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞上有弱A 抗原存在。 根據(jù)血型血清學(xué)反應(yīng)格局推測(cè)可能為B(A)亞型。 通過(guò)進(jìn)一步對(duì)獻(xiàn)血者ABO 基因的1-7 外顯子測(cè)序顯示：1-5 外顯子無(wú)突變， 第6-7 外顯子存在c.261delG，c.297A＞G，c.526C＞G，c.640A＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G＞C，c.930G＞A 雜合突變，確定其基因型為ABO*B(A).04/O.01.01。

ABO 亞型中，B(A)亞型發(fā)生率相對(duì)比較低。 B(A)亞型從遺傳學(xué)上被認(rèn)為B 型，其紅細(xì)胞上除表達(dá)較強(qiáng)B 抗原外， 同時(shí)存在較弱的A 抗原表達(dá)[7]。近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)， 部分B 性紅細(xì)胞能夠與某些高反應(yīng)能力單克隆MHO4 抗-A 產(chǎn)生弱凝集，并證實(shí)弱A 抗原確實(shí)存在于這部分B 性紅細(xì)胞上[8]，關(guān)于B(A)亞型的報(bào)告逐漸增多。 B(A)亞型的血型血清學(xué)特點(diǎn)主要體現(xiàn)在三個(gè)方面，一是具有接近正常的B抗原特異性，與抗-B、抗H 發(fā)生較強(qiáng)凝集，二是表達(dá)較弱的A 抗原，紅細(xì)胞與部分單克隆抗-A、抗-A1、人源抗-A 發(fā)生弱凝集，三是此類個(gè)體血清中存在針對(duì)弱抗原產(chǎn)生可凝集A1 細(xì)胞、 部分A2 細(xì)胞的較強(qiáng)抗-A[9-10]。因此，B(A)亞型的血型血清學(xué)表現(xiàn)為血清中存在抗-A 抗體、紅細(xì)胞抗原呈“A 弱B強(qiáng)”的“AB 型”[11]。 此外，B(A)亞型與AwB 血型的血清學(xué)反應(yīng)格局不同，AwB 血型正定型與單克隆抗-A 發(fā)生較強(qiáng)凝集、與抗-H 發(fā)生弱凝集，反定型時(shí)，血清中可能存在的不規(guī)則抗-A1 與A1 紅細(xì)胞發(fā)生弱凝集， 這種現(xiàn)象由A 與B 糖基轉(zhuǎn)移酶重疊的部分特異性引起[7]，二者在血清學(xué)反應(yīng)格局上的區(qū)別有助于分析判斷。

文獻(xiàn)報(bào)道B(A)亞型有B(A)01～06 六種，國(guó)內(nèi)報(bào)道以B(A)02（c.700C＞G）、B(A)04（c.640A＞G）、B(A)05（c.641T＞C）為主[12]。 B(A)04 是在B.01 的基礎(chǔ)上出現(xiàn)了c.640A＞G 突變后出現(xiàn)了p.Met214Val，由一個(gè)極性親水性氨基酸Met 變成了一個(gè)疏水性氨基酸Val，該突變可能對(duì)GTB 轉(zhuǎn)移酶底物結(jié)合口袋的構(gòu)象產(chǎn)生了影響， 使原本的GTB 轉(zhuǎn)移酶具備了部分GTA 的功能，從而形成具有了雙功能酶活性，造成B 強(qiáng)A 弱的血清學(xué)格局， 但是其表型還具有異質(zhì)性，在進(jìn)行血型鑒定時(shí)仍然需要我們謹(jǐn)慎對(duì)待。如果父母雙方一條基因是BA.04， 另一條基因是A1.01，其子女表型仍然是AB 型，欲確切知道其基因型就需要進(jìn)行測(cè)序， 以確保精準(zhǔn)輸血并避免溶血反應(yīng)發(fā)生。 該研究因受地域限制及其他因素影響暫未能進(jìn)行家系調(diào)查，其B(A).04 基因遺傳自其父/母尚未確認(rèn)，將在以后繼續(xù)關(guān)注。

鑒于該例女性B(A)04 亞型的獻(xiàn)血者未婚未育特殊性，無(wú)論其作為獻(xiàn)血者還是受血者，均需要血站和輸血科血型工作者引起高度重視。 鄭望春等[8]報(bào)道罕見(jiàn)B(A)作為供血者，去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞輸注給B 型受血者，交叉配血相合，輸血后Hb 升高達(dá)到預(yù)期值，輸血過(guò)程無(wú)輸血反應(yīng)發(fā)生，輸血后隨訪受血者狀況良好。 其原因可能為獻(xiàn)血者紅細(xì)胞上A 抗原非常弱，抗原抗體比例不適合，或受血者體內(nèi)抗-A（人源抗-A）不具備特異性結(jié)合獻(xiàn)血者A 抗原決定簇的結(jié)合位點(diǎn)。若作為受血者或者將來(lái)需要孕產(chǎn)備血時(shí)， 本著輸入紅細(xì)胞抗原 “從無(wú)從少”原則，可考慮輸O 型或B 型洗滌紅細(xì)胞。此外，提倡B(A)血型家系調(diào)查，動(dòng)員更多的B(A)血型者參與自體輸血、互助獻(xiàn)血，建立能夠?qū)崿F(xiàn)紅細(xì)胞長(zhǎng)期冷凍保存的罕見(jiàn)稀有血液庫(kù)（含信息庫(kù)）[13]等，以提高B(A)血型輸血的及時(shí)性、安全性、有效性。