寧昊豐，柴玉瓊，王亞男

（洛陽市婦幼保健院，河南 洛陽471000）

高齡孕婦是指分娩年齡大于或等于35 周歲的孕婦群體。 出生缺陷兒及染色體異常兒的發(fā)生率明顯增高是高齡妊娠的突出問題之一[1]。 為提高出生人口質(zhì)量，2001 年我國(guó)母嬰保健法實(shí)施辦法及2002 年產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法明確規(guī)定對(duì)高齡孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷[2]。 然而目前常用的產(chǎn)前診斷方法如絨毛膜吸取術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)、臍帶血穿刺術(shù)等，均屬于侵入性操作，盡管其準(zhǔn)確率為98%~99%，但術(shù)后流產(chǎn)、羊水滲漏、宮內(nèi)感染等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)0.5%~1.0%[3]，實(shí)際工作中真正愿意主動(dòng)進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷的高齡孕婦只是極少數(shù)。 近年來國(guó)際上也不斷建議修正對(duì)高齡孕婦直接進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷的決定[4-5]。

隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過分析母親外周血中的游離胎兒DNA （cell-free fetal DNA,cffDNA） 為胎兒的染色體疾病篩查與診斷提供了一個(gè)全新的策略[6]。目前孕婦外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè) （Non-invasive prenatal testing,NIPT） 對(duì)染色體非整倍體的檢出率可達(dá)99.2%，假陽性率為0.09%[7]。 憑借著在無創(chuàng)和準(zhǔn)確方面的優(yōu)越性，此技術(shù)在臨床上已得到廣泛應(yīng)用[8-9]。

本研究通過回顧分析2015 年1 月至2018 年6 月在本院采血進(jìn)行無創(chuàng)DNA 檢測(cè)的2125 例高齡孕婦產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果，比較無創(chuàng)DNA 與有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷結(jié)果的符合率， 并通過電話隨訪統(tǒng)計(jì)妊娠結(jié)局，探討無創(chuàng)DNA 技術(shù)在高齡孕婦中的臨床應(yīng)用價(jià)值及局限性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2015 年1 月至2018 年6 月在本院接受無創(chuàng)DNA 檢測(cè)的2 125 例高齡孕婦作為觀察對(duì)象，均為漢族、自然受孕、單胎妊娠，孕周為12~22 周，平均孕周（17±1.2）周，年齡范圍35~47 歲，平均年齡（38.5±2.7）歲。

1.2 研究方法 抽取孕婦外周血10 mL， 送至北京貝瑞和康生物科技有限公司和家輝遺傳?？漆t(yī)院聯(lián)合開展的檢測(cè)中心進(jìn)行檢測(cè)。 通過提取血漿游離DNA，經(jīng)過末端修復(fù)，接頭連接，構(gòu)建文庫(kù)，PCR擴(kuò)增，富集后得到測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)控合格后采用Next SeqCN500 高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)，并通過生物信息學(xué)分析計(jì)算Z 值。 平均每個(gè)樣本獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)量約為3.5 M reads，唯一比對(duì)reads 數(shù)為1.8 M，單端測(cè)序讀長(zhǎng)為36 bp，基因組覆蓋度為0.1×。若-3

2 結(jié)果

2.1 無創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果 2125 例高齡孕婦中，共檢測(cè)出高風(fēng)險(xiǎn)29 例：其中21-三體10 例；18-三體4 例；13-三體2 例；性染色體異常11 例，分別為5例45，XO ，3 例47，XYY，3 例47，XXX；CNV 異常2 例，分別為del(22)(q11.2)和dup(3)(p26.3)。 陽性率為1.36%（29/2125）。 見表1。

表1 無創(chuàng)DNA 高風(fēng)險(xiǎn)病例的侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果

2.2 無創(chuàng)DNA 結(jié)果異常者行侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果 對(duì)29 例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷：行羊水穿刺手術(shù)，并進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)。 通過染色體G 顯帶核型分析與SNP Array 基因芯片檢測(cè)，最終共25 例侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果與無創(chuàng)DNA 提示的高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果一致， 分別為10 例21-三體，4 例18-三體，1 例13-三體，3 例45，XO，3 例47，XYY，3例47，XXX，1 例del(22)(q11.2)。其余4 例未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。

無創(chuàng)DNA 的總體陽性預(yù)測(cè)值為86.21%（25/29）， 其中對(duì)于21-三體、18-三體以及性染色體數(shù)目增加（XXX/XXY）的陽性預(yù)測(cè)值均達(dá)100%（20/20）。 而對(duì)于13-三體、45，XO 以及CNV 的檢測(cè)結(jié)果則出現(xiàn)了假陽性的情況， 陽性預(yù)測(cè)值分別為50%、60%、50%。 見表1、表3。

2.3 無創(chuàng)DNA 結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)者追蹤回訪結(jié)果 對(duì)2 096 例低風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行電話回訪，13 例失訪，共得到有效回訪數(shù)據(jù)2 083 例。 其中有1 例在孕24周的超聲檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)胎兒骨骼結(jié)構(gòu)異常， 經(jīng)羊水穿刺后，通過染色體核型分析與基因芯片檢測(cè)，確診為arr[hg19]4q31.22(146844421-147304884)×3，dup 0.8 Mb。 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，盡管該區(qū)段無明確致病相關(guān)報(bào)道，但是該區(qū)段包含可導(dǎo)致脊柱側(cè)凸、骨骼發(fā)育不良的致病基因SLC10A7[10-11]。 通過與胎兒父母基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該CNV 屬于新發(fā)變異，最終判定為可疑致病，經(jīng)遺傳咨詢，決定進(jìn)行引產(chǎn)手術(shù)。 另有2 例在孕28 周之前不明原因流產(chǎn)。 其余2 080 例孕婦均表示出生后孩子生長(zhǎng)發(fā)育情況良好。 去掉失訪和不明原因流產(chǎn)的數(shù)據(jù)后，總體陰性預(yù)測(cè)值為99.95%（2 080/2 081），見表2、表3。

表2 無創(chuàng)DNA 低風(fēng)險(xiǎn)病例的跟蹤隨訪結(jié)果

表3 無創(chuàng)DNA 的檢測(cè)效率（%）

3 討論

《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告（2012）》指出我國(guó)是世界上人口出生缺陷率高發(fā)的國(guó)家， 每年約有90萬出生缺陷兒誕生， 給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。染色體異常是出生缺陷的主要原因。常見的活產(chǎn)兒染色體異常主要包括21-三體、18-三體、13-三體、性染色體非整倍體及CNV 等。 近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，晚婚晚育人口增多，國(guó)家“二胎政策”的全面開放，高齡孕婦比例逐年上升。 隨著女性年齡增加，卵巢的各項(xiàng)功能開始退化，卵子受到的外界理化刺激不斷積累， 生育染色體異常兒的概率也會(huì)增加。 傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方式以侵入性為主，但該技術(shù)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性，給高齡孕婦本人和家屬帶來極大的心理壓力。 隨著測(cè)序技術(shù)不斷進(jìn)步，無創(chuàng)DNA 在染色體非整倍體異常與全基因組拷貝數(shù)變異的檢測(cè)已成為可能， 而并且以無創(chuàng)性和相對(duì)較高的準(zhǔn)確性在臨床獲得了較廣泛的應(yīng)用[12-14]。

我們研究了近年來在本院進(jìn)行無創(chuàng)DNA 篩查的2125 例高齡孕婦檢測(cè)數(shù)據(jù)，以分析無創(chuàng)DNA的篩查效率。 其中無創(chuàng)DNA 對(duì)于21-三體、18-三體以及性染色體數(shù)目增加（XXX/XXY）的檢測(cè)最為準(zhǔn)確，陽性預(yù)測(cè)值均達(dá)到了100%。 對(duì)于13-三體、45，XO 及CNV 的檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值較低。 本研究中， 無創(chuàng)DNA 對(duì)13-三體的篩查效能低于21-三體和18-三體的結(jié)果，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相一致[7,13]。 無創(chuàng)DNA 發(fā)生假陽性可能有母體染色體核型異常、孕婦患實(shí)體腫瘤、限制性胎盤嵌合等原因[15-16]。 另外該檢測(cè)與GC 含量偏向性相關(guān)， 有研究表明13號(hào)染色體的GC 含量較低，導(dǎo)致測(cè)序時(shí)產(chǎn)生偏差[17]。此外，隨著孕婦年齡的增長(zhǎng)，其淋巴細(xì)胞的X 染色體非整倍體的頻率也會(huì)增加， 尤其是X 染色體的丟失增加，這也可能是造成假陽性的原因之一[18]。

在對(duì)無創(chuàng)DNA 檢測(cè)結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦回訪中， 我們發(fā)現(xiàn)了一例通過后期B 超檢測(cè)發(fā)現(xiàn)異常從而進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷確診為CNV 異常的病例。 引起NIPT 假陰性的原因主要有母體外周血中的cffDNA 含量過低， 和胎兒本身染色體異常，但胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞正常等[16,19]。 另外由于測(cè)序深度和生信分析技術(shù)水平的限制，導(dǎo)致無創(chuàng)DNA 對(duì)小片段的染色體異常檢測(cè)的靈敏度偏低。 因此無創(chuàng)DNA 低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，并不能完全排除異常妊娠，特別是對(duì)于出生缺陷高發(fā)的高齡孕婦， 更要做好系統(tǒng)全面的產(chǎn)前檢查。

綜上所述，無創(chuàng)DNA 檢測(cè)技術(shù)憑借著在安全性、靈敏度、特異度等方面所具有的優(yōu)勢(shì)使廣大孕婦獲益。對(duì)于高齡孕婦，可優(yōu)先選擇進(jìn)行無創(chuàng)DNA檢測(cè)進(jìn)行篩查。 此檢測(cè)結(jié)果在一定假陽性，因此陽性結(jié)果必須通過侵入性產(chǎn)前診斷確診。 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，孕婦也一定要按照正規(guī)產(chǎn)檢流程，嚴(yán)格進(jìn)行B 超檢查， 發(fā)現(xiàn)異常者仍需做侵入性產(chǎn)前診斷確診，避免染色體異常胎兒的出生。