楊萍，岳天義，張萍，馬嫄，許青蓮，劉洪，黃紅，邢亞閣*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 611743；2.宜賓西華大學(xué)研究院食品非熱技術(shù)重點實驗室,四川宜賓 644000；3.環(huán)太生物科技股份有限責(zé)任公司,四川成都 610200）

黑苦蕎是苦蕎中的一種，具有較高的藥用和營養(yǎng)價值。黑苦蕎已被廣泛應(yīng)用于生物藥業(yè)、食品添加劑和化妝品等領(lǐng)域，具有良好的開發(fā)前景[1?2]。隨著黑苦蕎的利用和開發(fā)，黑苦蕎殼作為其加工副產(chǎn)物具有寬泛的實用價值[3]。據(jù)文獻(xiàn)報道，苦蕎殼中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，其含量是苦蕎籽中黃酮類物質(zhì)的三倍多[4]，苦蕎殼中除黃酮類化合物外還有其他活性物質(zhì)，如多糖等也具有良好的生物活性[5]。此外，苦蕎殼還具有抗氧化、降血糖、抗癌、抗衰老、抗高血壓、降膽固醇等功效，這些效應(yīng)可能跟苦蕎殼中存在的某些生物活性成分密切相關(guān)，這些生物活性成分包括黃酮類物質(zhì)、酚酸、鞣荊、維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸和蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維[6?10]。但黑苦蕎殼含有潛在的過敏原，如蛋白質(zhì)抑制劑等，對人體健康有負(fù)面影響，經(jīng)過加工處理功能成分可以得到更好的釋放以及被人體更好吸收。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對黑苦蕎殼的研究主要集中于對黃酮的提取方式和營養(yǎng)功能[11?13]等方面的研究，在加工方式及利用方面的研究還比較欠缺，尤其是各加工方式對黑苦蕎殼中功能性組分及營養(yǎng)品質(zhì)的影響方面的研究更少。烘焙作為一種熱加工方式可以起到食物熟化作用，可有效減少谷物中的抗?fàn)I養(yǎng)成分[14]。此外，烘焙已經(jīng)被用作一種傳統(tǒng)的加工方法，其干熱熟化作用可以提高黑苦蕎殼生物活性，促進(jìn)抗氧化成分的分解，與未加工產(chǎn)品相比具有更好的風(fēng)味、更長的保質(zhì)期和脆度[15]。喬麗華等[16]研究發(fā)現(xiàn)烘焙對小粒黑豆的酚類物質(zhì)及抗氧化活性有顯著影響，200℃條件下烘焙后的總酚含量最高，150℃下最低。陸理民[17]對苦蕎進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)80℃，15 min烘烤后抗氧化活性達(dá)到最好，酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)與抗氧化能力呈相關(guān)性。

目前，對黑苦蕎殼烘烤工藝的研究鮮有報道。利用熱風(fēng)干燥對黑苦蕎殼進(jìn)行熱加工，一方面普通烘烤條件可以達(dá)到熱加工要求，實現(xiàn)物料受熱充分，另一方面，普通烘烤成本低，物料加工承載量大，可實現(xiàn)工廠大批量加工生產(chǎn)。因此，本研究以黑苦蕎殼為原料，采用響應(yīng)面法的Box-Behnken模式，以黑苦蕎殼中總黃酮及總酚含量為指標(biāo)，探究其最佳烘烤工藝，系統(tǒng)研究烘烤前后酚類物質(zhì)和營養(yǎng)功能含量的差異，為黑苦蕎殼相關(guān)保健食品的開發(fā)和研究提供最佳工藝方法，同時也為其他相關(guān)種屬植物的產(chǎn)品加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑苦蕎殼（川蕎2號），由環(huán)太生物科技股份有限公司提供；沒食子酸，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

實驗所用主要儀器與設(shè)備見表1。

表1 主要儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 黑苦蕎殼酚類物質(zhì)提取

提取方法參照Sun等[18]方法，稍加修改。準(zhǔn)確稱取未烘烤及烘烤后的黑苦蕎殼粉1.000 g按料液比1∶20(mg/mL)與甲醇溶液充分混勻，超聲波提取30 min，4000 r/min離心10 min取上清液，每個樣品平行提取3次。合并上述3次提取液，于65℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用甲醇溶解并定容至20 mL，提取液于?18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總黃酮含量測定方法

采用NaNO2-Al(NO3)3法[19]，稍作改動。取200μL適當(dāng)稀釋液的黑苦蕎殼樣品提取液與等體積5% NaNO2混合避光反應(yīng)5 min，然后向上述反應(yīng)液加入200μL 10% Al(NO3)3溶液,反應(yīng)5 min，然后向上述反應(yīng)液加入2 mL 4%NaOH溶液，然后繼續(xù)加入2.4 mL蒸餾水混勻，繼續(xù)反應(yīng)15 min，于510 nm下測吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲，所得標(biāo)曲方程為Y1=0.1076X?0.0021，R2=0.9997；在0.01～0.16 mg/ mL 范圍有良好線性關(guān)系。

1.3.3 總酚含量測定方法

采用Folin-Ciocalteu法[20]，稍加修改。取1 mL樣品稀釋液與200μL福林酚試劑混合均勻，反應(yīng)6 min，然后加入7.5 mL 7% Na2CO3溶液，室溫下避光反應(yīng)90 min，最后于765 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，回歸方程：Y2=0.1736X+0.0584，R2=0.9982。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素預(yù)實驗基礎(chǔ)上，由Box-Behnken軟件中的實驗系統(tǒng)設(shè)計原理，選擇烘烤時間、烘烤溫度、鋪盤厚度進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，以各因素下主要活性成分總黃酮及總酚含量為指標(biāo)確定最佳烘烤條件。響應(yīng)面試驗因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.3.5 黑苦蕎殼營養(yǎng)品質(zhì)測定

黑苦蕎殼水分，GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法[21]；灰分，GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的測定》灼燒法[22]；粗脂肪，GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》索氏抽提法[23]；粗蛋白，GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》自動凱氏定氮儀法[24]。

1.3.6 HPLC 法測定黑苦蕎殼中酚類物質(zhì)組成及含量

參考孫坤坤等[2]和Gao[25]的研究，稱取沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、對香豆酸、槲皮素和山奈酚各10.0 mg制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，用色譜級甲醇稀釋溶解成1 mg/mL的母液，再逐級稀釋得到濃度為5、10、20、50、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾備用。測得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、對香豆酸、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=44237x?56820、y=12618x?17110、y=12691x+36791、y=12288x?30747、y=15186x?35039、y=20809x?20301和y=25301x?54407。

黑苦蕎殼提取液經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測定。

色譜柱條件：色譜柱為C18(4.6×250 mm)；流動相條件為A相0.15%甲酸溶液，B相100%乙腈；流速為0.7 mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫35°C；檢測器的檢測波長280 nm。梯度洗脫程序：0～5 min，B相10%;5～50 min，B相40%；50～60 min，B相10%。

1.3.7 掃描電鏡觀察

采用JSM-7500F場發(fā)射掃描電鏡(SEM)觀察黑苦蕎殼粉的形態(tài)。參考王藝靜[26]的方法，稍微修改，取適量樣品均勻分布于導(dǎo)電膠上，首先進(jìn)行噴金、處理，再放入電鏡載物臺上于15.00 kV操作電壓下觀察樣品的形態(tài)，選擇清晰典型顆粒拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0和OriginPro 8.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理與作圖，并進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平P＜0.05，試驗重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑苦蕎殼烘烤條件響應(yīng)面試驗優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素預(yù)試驗結(jié)果上，用Design-Expert 8.0軟件，以A（烘烤時間）、B（烘烤溫度）、C（鋪盤厚度）為因素，以黑苦蕎殼總黃酮含量和總酚含量為響應(yīng)變值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，整個試驗共進(jìn)行17次，試驗結(jié)果及方差分析如表3—表5所示，響應(yīng)曲面如圖1所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 總黃酮響應(yīng)面試驗方差分析

表5 總酚響應(yīng)面試驗方差分析

對該模型進(jìn)行差異顯著性檢驗及方差分析，其結(jié)果見表4所示。烘烤時間（min）、烘烤溫度（℃）影響顯著（P＜0.05）。在A、B、C項中，所有變量的二次效應(yīng)和交互效應(yīng)都在A、B、C之間。將總黃酮含量與烘烤因素的工藝變量相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)模式生成方程（1），以證明3個因素與響應(yīng)Y之間的關(guān)系?；貧w方程表明，烘烤時間和烘烤溫度對黑苦蕎殼總酚含量的影響較大，鋪盤厚度影響不顯著。烘烤時間和烘烤溫度、烘烤時間和鋪盤厚度、烘烤溫度和鋪盤厚度交互作用顯著。各因素間的交互作用對黑苦蕎殼中提取的總酚含量影響顯著，而鋪盤厚度對總酚含量的影響最小。由表4可知，模型的F值為59.70，P＜0.01，表明模型達(dá)到極顯著水平。失擬項的F值為0.18，P=0.9067>0.05，說明差異不顯著，回歸模型準(zhǔn)確可靠。此外，該模型的決定系數(shù)R2=0.9871，而校準(zhǔn)決定系數(shù)R2Adj=0.9706，表明該模型可以解釋97.06%的響應(yīng)值變化，達(dá)到了較高的擬合度。因此，該模型可用于確定黑苦蕎殼烘烤最佳工藝條件。

對分析所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到3個因子與黑苦蕎殼中總黃酮含量之間的模擬回歸方程為

由表5響應(yīng)面方差分析結(jié)果可知，烘烤時間（min）、烘烤溫度（℃）極顯著（P＜0.01）。在A、B、C項中，所有變量的二次效應(yīng)和交互效應(yīng)都在A、B、C之間。將總酚含量與烘烤因素的工藝變量相關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)模式生成方程（2），以證明三個因素與響應(yīng)Y之間的關(guān)系?；貧w方程表明：烘烤時間和烘烤溫度對黑苦蕎殼總酚含量的影響較大；烘烤時間和烘烤溫度、烘烤時間和鋪盤厚度、烘烤溫度和鋪盤厚度交互作用顯著；各因素間的交互作用對黑苦蕎殼中提取的總酚含量影響顯著，而鋪盤厚度對總酚含量的影響最小。由表5可知，模型的F值為61.16，P＜0.01，表明模型達(dá)到極顯著水平。失擬項的F值為5.96，P=0.0587>0.05，說明差異不顯著，回歸模型準(zhǔn)確可靠。此外，該模型的決定系數(shù)為R2=0.9874，而校準(zhǔn)決定系數(shù)為R2Adj=0.9713，表明該模型可以解釋97.13%的響應(yīng)值變化，達(dá)到了較高的擬合度。因此，該模型可用于確定黑苦蕎殼烘烤最佳工藝條件。

通過Design-Expert 8.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以總酚含量為評價指標(biāo)的二階多項方程為

2.2 黑苦蕎殼烘烤條件響應(yīng)面分析及優(yōu)化

烘烤條件對黑苦蕎殼總酚及總黃酮含量的影響及不同因素間的變化交互作用，其中A、B項以及二次項A2、B2的影響極顯著（P＜0.01），C2影響顯著（P＜0.05）。F值揭示了本實驗中烘烤因素的貢獻(xiàn)：烘烤溫度>烘烤時間>鋪盤厚度。圖1（a）和圖1（d）顯示了烘烤時間和溫度對總黃酮和總酚含量的影響。當(dāng)烘烤時間較短時，總黃酮和總酚含量不隨烘烤條件發(fā)生顯著變化。當(dāng)烘烤時間為6.8 min時，隨著烘烤溫度的變化，總黃酮和總酚含量顯著增加。圖1（b）和圖1（e）顯示了烘烤時間鋪盤厚度之間的相互作用對總黃酮和總酚含量的影響。兩者之間的相互作用對總黃酮和總酚含量有顯著影響（P＜0.0001，P=0.0469）。當(dāng)烘烤時間為111.72 min時，鋪盤厚度為1.41 cm時總黃酮和總酚含量達(dá)到最大值。圖1（c）和圖1（f）顯示了烘烤溫度和鋪盤厚度相互作用對總黃酮和總酚含量的影響，兩者相互作用對總黃酮和總酚含量有顯著影響（P=0.0007，P=0.0086）。

圖1 各因素對總酚含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3 黑苦蕎殼最佳烘烤工藝條件及驗證試驗

根據(jù)模型預(yù)測，最終以總黃酮為評價指標(biāo)得到各因素顯著程度依次為烘烤溫度（P＜0.0001）>烘烤時間（P=0.0378）>鋪盤厚度（P=0.1294）。利用響應(yīng)面法進(jìn)一步分析確定了苦蕎殼烘烤條件最佳工藝參數(shù)：烘烤時間11.72 min、烘烤溫度74.8℃和鋪盤厚度1.41 cm，考慮到實際情況調(diào)整為烘烤時間12 min、烘烤溫度75℃和鋪盤厚度1.4 cm。采用優(yōu)化后的烘烤工藝進(jìn)行驗證實驗，此條件下測得實際總黃酮含量為9.1 mg RE/g，總酚含量為38.9 mg GAE/g。由此可知，采用響應(yīng)面法對苦蕎殼烘烤條件工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化得出的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

2.4 烘烤對黑苦蕎殼基本營養(yǎng)成分影響分析

將黑苦蕎殼于最佳工藝下進(jìn)行烘烤，對烘烤后的黑苦蕎殼和對照組進(jìn)行對比，測定對比兩組的水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白含量，結(jié)果如表6所示。此研究發(fā)現(xiàn)，在75℃下烘焙12 min會影響黑苦蕎殼灰分、粗脂肪含量，降低水分、粗蛋白含量，這與馬藝超[27]研究的不同熱加工對苦蕎麥制品進(jìn)行處理，其粗蛋白含量降這一結(jié)果相似。這可能是因為在熱處理過程中，形成了美拉德化合物。由于賴氨酸的游離氨基之間的化學(xué)反應(yīng)還原糖的羰基，這些羰基主要來源于蛋白質(zhì)和淀粉的分解[28]。

表6 烘烤對黑苦蕎殼營養(yǎng)成分的影響 %

2.5 黑苦蕎殼酚類物質(zhì)的成分分析

孫坤坤等[2]研究了不同低海拔地區(qū)的黑苦蕎中的酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)黑苦蕎中的主要酚酸為蘆丁、槲皮素、表兒茶素、山奈酚等物質(zhì)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品HPLC 圖如圖2所示，根據(jù)圖譜確定黑苦蕎殼中單酚物質(zhì)的含量。

圖2 7種酚類化合物在黑苦蕎殼中的HPLC分析結(jié)果圖

實驗結(jié)果表明，黑苦蕎殼經(jīng)最佳工藝條件烘烤后酚類物質(zhì)含量發(fā)生變化，變化情況如表7所示。烘烤后沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、對香豆酸、山奈酚含量分別為含量為14.10 mg GAE/100g，0.758 mg GAE/100g、1.626 mg GAE/100g、0.772 mg GAE/100g、0.52 mg GAE/100g，這5種物質(zhì)含量與未烘烤組相比都有所增加。蘆丁和槲皮素含量分別為1.140 mg GAE/100g、11.96 mg GAE/100g，與未烘烤組相比相對減少了4.8%和28.0%。這可能是因為經(jīng)烘烤黑苦蕎殼中的酚類物質(zhì)發(fā)生分解，其中槲皮素等物質(zhì)轉(zhuǎn)換成了其他活性成分。

表7 黑苦蕎殼7種酚類物質(zhì)含量 mgGAE/100g

2.6 黑苦蕎殼顆粒微觀形態(tài)觀察

為了研究黑苦蕎殼膳食纖維樣品的形態(tài)差異，運用掃描電鏡對烘烤及未烘烤黑苦蕎殼進(jìn)行了形態(tài)分析。如圖3所示為水分含量分別為10.02%和13.05%未烘烤及烘烤的樣品，在200倍和400倍下觀察其結(jié)構(gòu)大致相似，但放大800倍及3000倍時可以清晰地看出，未烘烤黑苦蕎殼粉體形狀呈橢圓形或球狀結(jié)構(gòu)，顆粒較規(guī)則且分布均勻，在放大到800倍下測量粒徑大小均值為（9.40±0.75)μm。烘烤后樣品表面較粗糙，纖維顆粒的晶體顆粒大小不均勻，結(jié)構(gòu)多樣變得無定形(見圖3中 A2、B2、C2、D2)，這可能是因為經(jīng)烘烤后樣品水分散失，而水分是保持樣品細(xì)胞完整性的重要屬性。這與Chiang等[29-30]的研究結(jié)論一致。

圖3 黑苦蕎殼粉結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖

3 結(jié)束語

本研究采用單因素和響應(yīng)面法對黑苦蕎殼烘烤工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳工藝條件為烘烤時間12 min、烘烤溫度75℃和鋪盤厚度1.4 cm。此試驗條件下，測得實際總黃酮含量為9.1 mg RE/g，總酚含量為38.9 mg GAE/g。在影響黑苦蕎殼烘烤工藝的各個因素中，烘烤溫度和烘烤時間影響效果最為顯著。隨著烘烤溫度和時間的增加，其黃酮及總酚含量隨烘烤溫度的升高而降低，烘烤后營養(yǎng)成分也有所變化。通過HPLC測定最佳烘烤工藝條

件下黑苦蕎殼沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、對香豆酸、槲皮素、山奈酚含量分別為14.10 mg GAE/100g，0.758 mg GAE/100g、1.626 mg GAE/100g、1.140 mg GAE/100g、0.772 mg GAE/100g、11.96 mg GAE/100g、0.52 mg GAE/100g，其中沒食子酸與未烘烤組相比含量增加最多，相對提高了30.4%。

本研究為黑苦蕎殼產(chǎn)品加工處理提供了一定的理論支撐，該烘烤工藝可進(jìn)一步用于黑苦蕎殼保健食品、餅干、復(fù)合飲料、奶茶等相關(guān)產(chǎn)品研究與開發(fā)，后期可進(jìn)一步對烘烤后的黑苦蕎殼活性成分及其特性進(jìn)行研究。