陳逢玲，于 航，常麗娜，孫 卓，林紅梅，楊利民

（吉林農業(yè)大學中藥材學院/省部共建生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理國家重點實驗室，長春 130118）

防風Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.，為傘形科多年生草本藥用植物，以干燥根入藥[1]，是我國常用大宗中藥材之一。產于東北地區(qū)的防風，又稱“關防風”，主要分布于黑龍江安達、泰康，吉林洮安，遼寧昭盟、鐵嶺等地區(qū)[2]。供給于市場的關防風主要以人工栽培為主[3]。近年來由于關防風人工栽培技術體系不夠完善，導致關防風病害的發(fā)生日趨嚴重，其中，由立枯絲核菌RhizoctoniasolaniKühn引起的關防風立枯病，可危害葉、莖、枝條甚至整株[4]。目前，多采用化學途徑對關防風立枯病進行防治，通過施用甲基托布津、多菌靈等化學農藥，可在一定程度上控制立枯病的發(fā)生與發(fā)展，但頻繁施用化學藥劑，易造成農藥殘留和環(huán)境污染等問題[5]，極大限制了關防風種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。因此，尋求一種對關防風立枯病安全有效的防治手段，成為了關防風種植業(yè)亟待解決的問題。

生物防控作為一種綠色安全有效的病害防控手段，已在生態(tài)農業(yè)領域中得到廣泛應用，同時也是藥用植物病害防控領域的主要研究熱點[7,8]。開展植物病害生物防控工作的前提，是從自然生境中獲得高效的拮抗菌株[9]。其中，高菲等[10]從健康草莓的根際土壤中獲得的多粘類芽胞桿菌PeanibacillusploymyxaGF-98可使膠孢炭疽病菌生長畸形；孫卓[11]從人參根際土壤中篩選出的一株甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌Bacillus methylotrophicusSZ-3可顯著抑制立枯絲核菌的生長；游成真等[12]從黃瓜根際土壤中篩選出的3株解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens可高效防治黃瓜立枯病。這些研究結果均表明了從植物根際土壤中分離篩選出的拮抗細菌具有良好的生防潛力，已成為植物病害生物防控的優(yōu)良菌源之一[13]。

目前，關于關防風拮抗菌的研究鮮有報道，且都只是針對于關防風內生菌的研究[14,15]，而對關防風根際土壤細菌的研究還未見報道，故本研究從關防風根際土壤中分離篩選拮抗細菌，并對其進行抑菌能力和定殖能力測定，將篩選出的拮抗菌株，用于關防風立枯病的防治研究，并對能力較強的拮抗細菌進行鑒定。旨在為關防風立枯病的生物防控研究提供優(yōu)質菌源，為我國藥用植物病害防控相關研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原真菌 關防風立枯病病原真菌：立枯絲核菌R.solani，用于拮抗細菌的篩選。9種病原真菌：關防風灰霉病病原真菌灰葡萄孢菌BotrytiscinereaPers.ex Fr.，關防風根腐病病原真菌木賊鐮刀菌Fusariumequiseti（Corda）Sacc.，關防風疫病病原真菌惡疫霉菌Phytophthoracactorum（lebert et Cohn) J.Schroet.，五味子根腐病病原真菌尖孢鐮刀菌FusariumoxysporumSchlecht.，五味子黑斑病病原真菌鵝掌楸鏈格孢菌AlternarialiriodendraT.Y.ZhangetJ.Z.Zhang，五味子莖基腐病病原真菌腐皮鐮孢菌Fusarium solani（mart.）App.etWollenw，細辛葉枯病病原真菌槭菌刺孢菌Mycocentrosporaacerina（Hartig）Deighton.，刺五加黑斑病病原真菌細極鏈格孢菌Alternariatenuissima（Fr）Wiltshire，細辛菌核病病原真菌核盤菌SclerotiniaasariWu et C.R.Wang.，用于拮抗細菌抗菌譜測定。以上病原真菌均由吉林農業(yè)大學植物病理實驗室提供。

1.1.2 供試土壤樣品 于吉林省長春市吉林農業(yè)大學藥園（E 125°24′59″、N 43°48′24″、海拔251 m），吉林省白城市黑水鎮(zhèn)（E 122°52′10.43″、N 45°11′39.01″、海拔 152 m），吉林省洮南市永茂林場（E 122°12′38.32″、N 45°31′58.59″、海拔224 m）的健康關防風種植地，采集關防風根際土壤，4 ℃保存、備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 （1）牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基[16]，馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基[17]。（2）硝酸鹽肉湯培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、V-P培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基和明膠水解培養(yǎng)基等鑒定培養(yǎng)基[18]。

1.1.4 主要試劑和儀器 利福平（Rifampicin）（北京索萊寶科技有限公司），50%甲基托布津可濕性粉劑800倍液（四川潤爾科技有限公司），哈茨木霉菌劑（濰坊奧奇生物科技有限公司，10億CFU/g），枯草芽胞桿菌菌劑（山東魯抗生物農藥有限責任公司，1000億CFU/g），細菌生理生化鑒定管（青島海博生物科技有限公司），細菌基因組試劑盒（TaKaRa公司），DNA Marker和細菌引物（生工生物工程（上海）股份有限公司），人工氣候箱（哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司），PCR儀（Rockwell Allen-Bradley公司），水平電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 土壤細菌的分離

采用稀釋平板法分離土壤細菌[19]。鮮土樣品風干后，過20目篩。稱取10 g土樣放入裝有玻璃珠與90 mL無菌水的三角瓶中，30 ℃、180 r/min充分振蕩20 min，混勻后靜置5 min，制得土壤懸液。按10-3、10-4、10-5梯度制成稀釋液，分別吸取200 μL各稀釋液在NA平板均勻涂布，每處理3次重復，平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱內32 ℃暗培養(yǎng)24～48 h。根據菌落形態(tài)、顏色、邊緣，可溶性色素等特征挑取不同的細菌菌落，進行NA平板劃線純化，編號，4 ℃保存，備用。

1.3 拮抗細菌篩選

1.3.1 濾紙片法初篩[20]將供試細菌接種于NA液體培養(yǎng)基中，32 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，制得細菌發(fā)酵液，調整含菌量為108CFU/mL，置于室溫下備用。將立枯絲核菌制成菌餅（直徑8 mm）接種至PDA平板正中央，同時將4片滅菌濾紙圓片（直徑8 mm）對稱置于距平板中心約25 mm處的4個角點上，每片點接20 μL細菌培養(yǎng)液，對照組點接20 μL NA培養(yǎng)液，每處理3次重復，置于30 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，待對照組菌落長滿平板，篩選出有明顯拮抗作用的細菌菌株進行復篩。

1.3.2 牛津杯法復篩[21]無菌濾液的制備：將上述細菌發(fā)酵液，在4 ℃條件下，7000 r/min離心20 min，收集上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾掉菌株菌體后，制得無菌濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將立枯絲核菌制成菌餅（直徑8 mm）接種至PDA平板正中央，無菌條件下將4個無菌牛津杯（規(guī)格：內徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm）放于距平板中心約25 mm的4個對稱角點，每杯接入200 μL無菌濾液，對照組接入20 μL NA培養(yǎng)液，每處理3次重復，置于30 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，待對照組菌落長滿平板，觀察處理組有無抑菌帶產生，測量、記錄處理組真菌菌落生長直徑（十字交叉法），計算供試細菌濾液的抑菌率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.3.3 拮抗細菌抗菌譜測定 將1.1.1中的9種代表植物病原真菌按1.3.1濾紙片法進行拮抗細菌抗菌譜的測定，每處理3次重復，置于30 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，待對照組菌落長滿平板，計算抑制率。

1.4 抗利福平（Rif）標記菌株的篩選

采用抗生素標記法[22]，取拮抗細菌發(fā)酵液10 mL接種在含10 μg/mL Rif的50 mL NA培養(yǎng)液中。32 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 d，如培養(yǎng)液變渾濁，則從含10 μg/mL Rif的培養(yǎng)液中再次吸取10 mL菌液接入20 μg/mL Rif的培養(yǎng)液中，之后逐漸增加利福平濃度，使拮抗細菌逐步在濃度為40、80、100、150、200、300 μg/mL Rif的NA培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，然后將含300 μg/mL Rif的菌液涂布于含300 μg/mL Rif的NA固體培養(yǎng)基中，篩選出與原始菌株形態(tài)變化不大的標記菌株進行下一步試驗。

1.4.1 標記菌株遺傳穩(wěn)定性檢測 將標記菌株在NA培養(yǎng)基（不含Rif）中繼代培養(yǎng)10代后，涂布于含300 μg/mL Rif的NA培養(yǎng)基平板，觀察是否能正常生長。

1.4.2 標記菌株拮抗穩(wěn)定性檢測 采用濾紙片法，以原始菌株為對照，觀察抑菌率是否存在差異。

1.5 抗利福平標記菌株在土壤中的定殖

采用拌土接種法[23]，把育苗基質裝入育苗盆中，每盆300 g土，并向基質中注入30 mL標記菌株發(fā)酵液（初始菌量108CFU/g）均勻拌土，3次重復處理，室溫下放置，每隔7 d定期取樣，采用土壤稀釋法，將土壤稀釋液涂布在含300 μg/mL Rif的NA培養(yǎng)基平板上，計算含菌量。

1.6 拮抗細菌對盆栽防風的防效研究

立枯絲核菌菌絲懸浮液的制備：參照劉佳等[24]和鮮澤軒[25]方法加以改進，將3～4塊直徑8 mm的立枯絲核菌菌餅，置于裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，過濾，吸干水分后稱量菌絲的重量，加入滅菌水配置成濃度為10 g/L的菌絲懸浮液。

拮抗細菌發(fā)酵液：將定殖效果良好的拮抗細菌SC-32和SC-127分別接種于NA液體培養(yǎng)基中，32 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，用滅菌水調整含菌量為108CFU/mL，置于室溫下備用。

設置病原菌對照組（接種菌絲懸浮液），菌劑對照組（哈茨木霉菌劑/枯草芽胞桿菌菌劑（菌劑濃度稀釋為108CFU/mL）與菌絲懸浮液混合接種）、農藥對照組（甲基托布津800倍液與菌絲懸浮液混合接種）、試驗組（拮抗細菌發(fā)酵液和菌絲懸浮液混合接種），選取長勢一致且健康的一年生關防風植株，采用針刺涂抹法[26]接種菌液各15 mL，每組8盆，每盆2株。35 d后進行病害調查，計算病情指數(shù)和防治效果。

關防風立枯病病情分級參照張華夢等[27]，分為6級：0級：無?。?級：病斑面積占葉片面積的比例≤12.5%；2級：12.5%＜病斑面積占葉片面積的比例≤25.0%；3級：25.0%＜病斑面積占葉片面積的比例≤50.0%；4級：50.0%＜病斑面積占葉片面積的比例≤75.0%；5級：75.0%＜病斑面積占葉片面積的比例＜100.0%；6級：病斑面積占葉片面積的 100.0%。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.7 拮抗細菌的鑒定

1.7.1 形態(tài)學鑒定 將拮抗細菌劃線接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃暗培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，主要包括菌落顏色、透明度、邊緣特征等，并進行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)及芽胞染色觀察有無芽胞。

1.7.2 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[28]和《伯杰細菌鑒定手冊》[29]，采用細菌生理生化鑒定管對糖醇利用、硝酸鹽還原、甲基紅、V-P試驗、淀粉水解、明膠液化反應、H2S的產生等生理生化指標進行試驗。

1.7.3 分子鑒定 采用細菌基因組試劑盒提取拮抗細菌基因組DNA。采用細菌16S rDNA通用引物16S1F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和16S1R（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）擴增16S rDNA基因序列[30]。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據測序結果在NCBI進行同源性比較分析，用MEGA 5.0軟件采用Neighbor-joining算法構建16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，自展次數(shù)設定為1000，確定拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育學地位。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌的分離和拮抗細菌篩選

采用稀釋平板法，從關防風根際土壤中共分離出156株細菌，編號為SC-1至SC-156。初篩獲得38株對關防風立枯病病原菌具有明顯拮抗效果的細菌菌株，占分離菌株總數(shù)的24.36%；復篩結果表明，拮抗細菌的無菌濾液對立枯絲核菌具有拮抗抑制作用的為12株（表1），抑菌率可達到71.38%，抑菌帶寬最大為10.63 mm，將抑菌率高于65%的4株拮抗細菌進行下一步研究。

表1 拮抗細菌無菌濾液對立枯絲核菌的抑制效果Table 1 The inhibiion effect of sterile filtrate of antagonistic bacteria on R.solani

2.2 拮抗細菌抗菌譜測定

抗菌譜結果表明（表2），4株拮抗細菌對9種供試病原菌表現(xiàn)出不同的抑菌能力，對灰葡萄孢菌、惡疫霉菌、鵝掌楸鏈格孢菌、腐皮鐮刀菌、槭菌刺孢菌表現(xiàn)出較強的抑菌效果，抑菌率均大于80%，其中對惡疫霉菌拮抗效果最好，抑菌率均大于85%，而對于五味子尖孢鐮刀菌和細辛核盤菌的抑菌效果較差，抑菌率在72.68%～79.40%。其中，菌株SC-32和SC-127對9種供試病原菌均表現(xiàn)出較強的廣譜抑菌效果，抑菌率均大于75%，因此選擇SC-32和SC-127進行下一步定殖試驗。

2.3 抗利福平標記菌株的篩選

菌株SC-32和SC-127均能在含300 μg/mL Rif的NA固體培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長且與原始菌株形態(tài)、顏色相同。并且在不含Rif的NA固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10代后，均能在含300 μg/mL Rif的NA固體培養(yǎng)基上正常生長，其培養(yǎng)液對關防風立枯絲核菌仍具有抑制作用，且與原始菌株的抑制效果基本相同（圖1），具有遺傳穩(wěn)定性和拮抗穩(wěn)定性。

圖1 菌株SC-32和標記菌株與原始菌株抑菌效果對比Fig.1 Comparison of antibacterial effect between SC-32 and SC-127 labeled strains and original strains

2.4 抗利福平標記菌株在土壤中的定殖

菌株SC-32和SC-127在土壤中定殖動態(tài)（圖2）呈現(xiàn)“先減后增再趨于平穩(wěn)”的趨勢。菌株SC-32接種0～14 d后，土壤中標記菌株數(shù)量明顯下降，但14 d后土壤的含菌量逐漸增加，于第21 d達到峰值，為5.31×107CFU/g，為14 d時的3.23倍，往后開始逐漸減少，并于28 d后土壤含菌量趨于穩(wěn)定；菌株SC-127接種0～7 d后，土壤中標記菌株數(shù)量明顯下降，但7 d后土壤的含菌量逐漸增加，于第14 d達到峰值，為6.58×107CFU/g，為7 d時的2.05倍，往后開始逐漸減少，并于28 d后土壤含菌量趨于穩(wěn)定；35 d時，菌株SC-32和菌株SC-127在土壤中的含菌量仍能達到2.93×107和7.83×106CFU/g。

圖2 菌株SC-32和SC-127在土壤中的定殖動態(tài)Fig.2 The colonization dynamic of SC-32 and SC-127 in soil

2.5 拮抗細菌對盆栽防風的防效研究

菌株SC-32和SC-127對關防風立枯病的盆栽防效如表3所示，結果表明，接種35 d后，單接立枯絲核菌的關防風植株病情指數(shù)為 46.91，其他處理組的病情指數(shù)均較單接立枯絲核菌顯著降低。其中，立枯絲核菌與拮抗細菌SC-32混合接種35 d后，其防效較接種哈茨木霉菌劑、枯草芽胞桿菌菌劑和甲基托布津分別提高了26.09%、30.43%和13.05%；立枯絲核菌與拮抗細菌SC-127混合接種35 d后，其防效較接種哈茨木霉菌劑、枯草芽胞桿菌菌劑和甲基托布津分別提高了32.00%、36.00%和20.00%；但各處理組之間防效差異不顯著。綜上可得，拮抗細菌SC-32和SC-127對關防風立枯病均具有較好的防治效果，其中SC-127較SC-32的防治效果好。

表3 拮抗細菌對關防風立枯病的防治效果Table 3 Control effect of antagonistic bacteria against the pathogen of S.divaricata seedling damping-off

2.6 拮抗細菌的鑒定

2.6.1 形態(tài)學鑒定 菌株SC-32在NA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落乳白色，有黏性，質軟，中心隆起，表面較濕潤，不透明，邊緣不整齊，菌體桿狀，革蘭氏染色為陽性，有芽胞；菌株 SC-127菌落乳白色，有黏性，質軟，中心隆起，表面濕潤，不透明，邊緣整齊，鏡檢菌體為桿狀，革蘭氏陽性，有芽胞。

2.6.2 生理生化鑒定 生理生化特性測試結果表明（表4）：菌株SC-32和SC-127均能夠水解淀粉和明膠，硝酸鹽還原反應生成紅色化合物，接觸酶、乙酰甲基甲醇試驗（V-P）、酪蛋白和氧化酶均為陽性，能夠利用檸檬酸鹽和多種糖原，甲基紅反應、丙酸鹽、吲哚、苯丙氨酸脫氨酶、氧化酶與硫化氫試驗均為陰性，，能在10%含NaCl的NA培養(yǎng)基生長。結合形態(tài)學和生理生化鑒定分析，菌株SC-32和SC-127具有典型芽胞桿菌特征。

表4 菌株SC-32和SC-127的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of SC-32 and SC-127

2.6.3 分子鑒定 擴增菌株SC-32和SC-127的16S rDNA基因序列，得到一個1451和1428 bp的PCR產物，提交GenBank注冊（登錄號為：OK605022和OK605052）并進行NCBI BLAST比對，顯示菌株SC-32和SC-127均與貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis相似性最高，可達到99.86%以上；構建16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖3），菌株SC-32和SC-127與貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis聚為一支。結合形態(tài)學分析，生理生化指標，16S rDNA基因序列分析，將菌株SC-32和SC-127鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖3 基于16S rDNA序列構建的菌株SC-32和SC-127系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 phylogenetic tree of SC-32 and SC-127 strain based on 16S rDNA sequence

3 討論

植物病害生物防控是利用有益生物來抑制或消滅有害生物的一種方法和手段[31]，是不使用化學殺菌劑也可對植物病害進行高效防治且對人類及環(huán)境無害的病害防治策略[32]。開展植物病害生物防控的首要任務是篩選出對標靶菌具有良好拮抗效果，且不傷害非標靶菌的特異性并具有多種防病機制的生防菌[33]。目前，在關防風病害生物防控研究中，對多種標靶菌具有拮抗效果的生防菌尚少。陳志垚等[34]獲得一株對馬鈴薯瘡痂病菌具有明顯拮抗效果的貝萊斯芽胞桿菌BKS104，對8種植物病原真菌均具有抑制效果。本研究以立枯絲核菌為標靶菌，篩選出兩株具有良好拮抗效果的菌株SC-32和SC-127，其無菌濾液也具有拮抗活性，說明了菌株SC-32和SC-127分泌的胞外抑菌物質對立枯絲核菌也存在作用機制。抑菌譜結果證實，菌株SC-32和SC-127對細辛葉枯病菌，刺五加黑斑病菌、細辛菌核病菌等9種作物病原真菌均具有抑菌能力，說明其不但對葉部病害病原菌具有拮抗作用，對其他莖、根部病害病原菌同樣具有拮抗效果，表現(xiàn)出廣譜抑菌活性。表明菌株SC-32和SC-127具有良好生防潛力。同時，從關防風根際土壤分離篩選出的拮抗細菌，保證了關防風拮抗菌源的安全性和可靠性。

盆栽試驗證實，菌株SC-32和SC-127均能顯著降低關防風立枯病的病情指數(shù)，其防效高于菌劑和農藥處理組。充分表明SC-32和SC-127對關防風立枯病病具有良好防治效果，與市面上推廣的生物菌劑相比更能針對性的防治關防風立枯病，且與化學農藥相比，對人和環(huán)境無害。

菌株SC-32和SC-127經形態(tài)、生理生化、16S rDNA基因序列分析，鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis。貝萊斯芽胞桿菌是一類可產生芽胞的非致病菌，對人與動物沒有致病性，能夠產生多種次級代謝產物，且具有廣譜抑菌活性，可抑制多種植物病原菌的生長[35,36]，并對植株具有促生作用，被廣泛應用于動植物病害的生物防治[37]。本研究首次發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌對關防風立枯病具有良好的防效，為關防風立枯病的防治提供了優(yōu)良菌源。

研究顯示，拮抗細菌對植物病害的生防機制存在多樣性和協(xié)同性，其作用機理包括抑菌、定殖和誘導抗性等諸多方面[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，SC-32和SC-127雖同為貝萊斯芽胞桿菌，但兩株拮抗細菌的抑菌能力和生防效果卻存在差異，其相關防病作用的機制可作為下一步試驗工作的重點。