雒淑紅，駱玉珍，趙鶯鶯，張維維,3，劉 文，何山文，安 磊，王永杰，韓繼剛

（1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 200120；2. 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232；3. 東北大學(xué) 資源與土木工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110819）

城市綠地是生態(tài)城市建設(shè)的基礎(chǔ)和重要組成部分[1]。植物病害特別是土傳病害已經(jīng)對(duì)綠地生態(tài)系統(tǒng)健康造成了嚴(yán)重威脅[2-3]，由真菌引起的植物病害占全部植物病害的2/3以上[4]，其中土傳植物病原真菌是造成植物病害的主要類群[5]。研究表明：立枯絲核菌Rhizoctonia solani和齊整小核菌Sclerotium rolfsii是上海綠地土壤中最常見的土傳植物病原真菌[6]。立枯絲核菌屬于無(wú)孢科Agonomycetaceae絲核菌屬Rhizoctonia[7]，在自然界中廣泛存在，是引起植物根腐和莖腐癥狀的重要病原菌，被認(rèn)為是最具破壞力的土傳植物病原菌之一[8]。海桐Pittosporum tobira、八角金盤Fatsia japonica、高羊茅Festuca arundinacea和女貞Ligustrum lucidum等360個(gè)屬的園林綠化植物均能被立枯絲核菌感染[9]。齊整小核菌屬于無(wú)孢科小核菌屬Sclerotium[6]，是一種世界性傳播的土傳病原真菌，可以引起植物白絹病，致使植物腐爛死亡[10]。木棉屬Bombax和紫檀屬Pterocarpus植物以及樟樹Cinnamomum camphora和夾竹桃Nerium oleander等園林綠化植物常被齊整小核菌侵染[11]。

土傳病原真菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要是根據(jù)病原菌形態(tài)特征、選擇性平板計(jì)數(shù)等方法進(jìn)行[12-13]，但耗時(shí)費(fèi)力、效率較低，時(shí)效性較差，已不能滿足實(shí)際工作需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越多地被應(yīng)用于土傳病原真菌的檢測(cè)。目前，已經(jīng)有應(yīng)用該技術(shù)對(duì)農(nóng)田土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的報(bào)道[14-16]。但是，尚缺乏應(yīng)用qPCR技術(shù)對(duì)城市綠地土壤進(jìn)行立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測(cè)的研究。與農(nóng)田土壤存在明顯差異，城市綠地土壤異質(zhì)性高，普遍面臨著重金屬和有機(jī)污染物等的威脅[1,17]，因此，針對(duì)城市綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌，探索建立具有較強(qiáng)特異性、較高靈敏性和較好重復(fù)性的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)于及時(shí)了解上海城市綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的分布，保障植物和城市綠地生態(tài)系統(tǒng)健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

立枯絲核菌和齊整小核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)買于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，編號(hào)分別為ACCC37615和ACCC37946。菌株的培養(yǎng)參照《絲狀真菌分子細(xì)胞生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[18]。

1.2 綠地土壤樣品采集

2018年7月，采用多點(diǎn)混合采樣法，在上海市隨機(jī)采集綠地0～20 cm表層土壤樣品。采樣點(diǎn)信息見表1。每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)置5個(gè)子樣點(diǎn)，每個(gè)土壤樣品由5個(gè)子樣點(diǎn)樣品混合而成。土壤樣品充分混合后，去除石塊、草根等雜物，-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)[17]。

1.3 DNA提取

采用AntGene DNA提取試劑盒 (武漢安特捷生物技術(shù)有限公司)提取立枯絲核菌和齊整小核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。采用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA spin kit for soil, MP Biomedicals, 美國(guó))提取綠地土壤樣品DNA。使用NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))測(cè)定DNA的吸光度比值D(260)/D(280)及D(260)/D(230)，確定DNA質(zhì)量及濃度，之后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 qPCR引物的篩選及在線特異性驗(yàn)證

通過(guò)文獻(xiàn)檢索，根據(jù)已有報(bào)道選擇了ST-RS1/ ITS4、ITS1/GMRS-3等引物進(jìn)行擴(kuò)增立枯絲核菌的特異性引物的篩選，選擇SCR-F/SCR-R、SRITSF/SRITSR等引物進(jìn)行擴(kuò)增齊整小核菌的特異性引物的篩選(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中Primer-BLAST功能將4對(duì)引物分別與Non-Redundant Protein Sequence(NR)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，在線篩選和驗(yàn)證引物的特異性。

表 1 綠地土壤樣品信息Table 1 Information of green space soil samples

表 2 用于立枯絲核菌和齊整小核菌qPCR的引物信息Table 2 qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii

1.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以2種病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，分別使用篩選的特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的條帶，使用通用型DNA純化試劑盒[天根生化科技(北京) 有限公司，中國(guó)北京]對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收。按照pGM-T Fast連接試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，中國(guó)北京]說(shuō)明書將回收所得片段連接到pGEM-T Easy載體上(Promega, 美國(guó))，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中(Promega, 美國(guó))，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆子，并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后，按照質(zhì)粒抽提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，中國(guó)北京]說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提，提取所得重組質(zhì)粒送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。使用NanoDrop 2000 微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)[23]。

1.6 qPCR檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化

1.6.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 qPCR反應(yīng)體系包含有10 μL GoTaqq-PCR Master Mix (Promega，美國(guó))，DNA模板用量分別設(shè)置為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)分別設(shè)置為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL，加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至20 μL。陰性對(duì)照使用無(wú)菌重蒸水代替DNA模板。使用Roche Light Cycle 480Ⅱ型qPCR儀(羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司，瑞士)。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性 15 s，退火溫度下退火40 s [退火溫度在文獻(xiàn)中引物Tm值(表2)上下浮動(dòng)3 ℃范圍內(nèi)設(shè)置7個(gè)溫度梯度]，72 ℃延伸40 s，45個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)入熔解曲線程序：65 ℃升溫至95 ℃，隔1 ℃采集熒光信號(hào)。

表 3 qPCR引物在線比對(duì)結(jié)果Table 3 On-line blast results of qPCR primers

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將立枯絲核菌和齊整小核菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為108～101(×106拷貝·L-1)，分別得到8個(gè)稀釋濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板，使用1.6.1中優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 方法特異性評(píng)價(jià)

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和綠地土壤樣品DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，通過(guò)熔解曲線判斷qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否單一。qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳(110 V, 40 min)檢測(cè)，通過(guò)紫外凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察和分析。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和土壤樣品擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和土壤樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。

1.8 方法靈敏性評(píng)價(jià)

分別將2種病原真菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，從108×106拷貝·L-1稀釋至101×106拷貝·L-1，取稀釋好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按照1.6中優(yōu)化后的qPCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定方法的最低檢測(cè)限，驗(yàn)證此方法的靈敏性。

1.9 方法重復(fù)性評(píng)價(jià)

隨機(jī)選擇5個(gè)不同類型綠地土壤樣品DNA作為模板，按照1.6中優(yōu)化后的方法進(jìn)行立枯絲核菌和齊整小核菌qPCR擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。隨后根據(jù)每個(gè)樣品組內(nèi)重復(fù)間拷貝數(shù)的變異系數(shù)，驗(yàn)證方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 上海綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的定量檢測(cè)

采用1.6中優(yōu)化后的qPCR方法對(duì)21份上海綠地土壤樣品進(jìn)行立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算土壤樣品中病原菌ITS基因的拷貝數(shù)，y=c×n×v/s。其中：y為基因拷貝數(shù)(拷貝·g-1)，c為濃度(×106拷貝·L-1)，n為模板稀釋倍數(shù)，v為DNA洗脫體積(μL)，s為土壤干質(zhì)量(g)。

1.11 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR引物的篩選及NCBI在線特異性驗(yàn)證

使用NCBI中Primer-BLAST功能將表2的4對(duì)引物分別與NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示：引物ST-RS1/ITS4和ITS1/GMRS-3均可有效匹配目的序列900余條，錯(cuò)配率分別為7.7%和6.3%，在理論上均可實(shí)現(xiàn)對(duì)立枯絲核菌種水平特異性擴(kuò)增(表3)。與引物ITS1/GMRS-3相比，引物ST-RS1/ITS4擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度小于200 bp，更適用于在qPCR方法中的應(yīng)用，因此，本研究?jī)H保留引物ST-RS1/ITS4用于后續(xù)立枯絲核菌定量檢測(cè)方法的建立。引物SRITSF/SRITSR可有效匹配目的序列429條，錯(cuò)配率為8.1%，理論上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)齊整小核菌種水平特異性擴(kuò)增，而引物SCR-F/SCR-R僅匹配30條目的序列，覆蓋率相對(duì)低于引物SRITSF/SRITSR，且該引物錯(cuò)配率較高，因此，本研究?jī)H保留引物SRITSF/SRITSR用于后續(xù)齊整小核菌定量檢測(cè)方法的建立(表3)。

2.2 qPCR檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 以2種病原菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果表明：引物ST-RS1/ITS4最佳退火溫度為60 ℃，引物SRITSF/SRITSR最佳退火溫度為52 ℃。在上述退火溫度下，2種病原菌qPCR擴(kuò)增效率最高。因此，最終確定立枯絲核菌qPCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45個(gè)循環(huán)。齊整小核菌qPCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45個(gè)循環(huán)。

2種 病 原 菌qPCR反 應(yīng) 體 系 中 最 適 引 物 用 量 均 為0.3 μL (10 μmol·L-1)，DNA模 板 用 量 均 為2 μL (10 mg·L-1)，在該反應(yīng)條件下熒光信號(hào)最強(qiáng)。因此，最終確定2種病原菌qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為：模板2 μL(10 mg·L-1)，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL，GoTaq?q-PCR Master Mix (Promega，美國(guó))10 μL，無(wú)菌重蒸水7.4 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用2.2.1優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。立枯絲核菌標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系表達(dá)式為y=-3.319x+33.98 (y為Ct值，x為模板量)，決定系數(shù)(R2)為0.999 5，擴(kuò)增效率為100.1%。齊整小核菌標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系表達(dá)式為y=-3.552x+33.65 (y為Ct值，x為模板量)，決定系數(shù)(R2)為0.997 9，擴(kuò)增效率為91.2%。結(jié)果表明：2種病原菌qPCR 的Ct值與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)均具有良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率符合qPCR定量檢測(cè)方法的要求，表明本研究建立的2種病原菌定量檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度和有效性，可作為立枯絲核菌和齊整小核菌快速定量檢測(cè)的方法。對(duì)立枯絲核菌的線性檢測(cè)范圍為2.42×101～2.42×108(×106拷貝·L-1)，對(duì)齊整小核菌的線性檢測(cè)范圍為2.20×101～2.20×108(×106拷貝·L-1)。

2.3 方法特異性評(píng)價(jià)

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和綠地土壤樣品DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：熔解曲線均為單一熔解峰，無(wú)雜峰，表明qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一且未產(chǎn)生引物二聚體。qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：引物ST-RS1/ITS4擴(kuò)增得到約200 bp的片段，引物SRITSF/SRITSR擴(kuò)增得到約450 bp的片段，均與目的片段大小一致(圖1)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果見表4。采用引物ST-RS1/ITS4從質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及土壤樣品擴(kuò)增到的產(chǎn)物分別與立枯絲核菌R. solaniBTRFB1(登錄號(hào): MZ158299)和R. solaniAG-F(登錄號(hào)：JQ343829)序列相似度最高，相似度為99.4%。采用引物SRITSF/SRITSR從質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及土壤樣品擴(kuò)增到的產(chǎn)物分別與齊整小核菌S. rolfsiiNTNM(登錄號(hào): MT126473)和S. rolfsiiSR1(登錄號(hào): MG847186)序列相似度最高，分別為99.5%和98.8%。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果說(shuō)明：利用引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR擴(kuò)增到的DNA序列均與目的片段序列一致，具有較強(qiáng)的特異性。

表 4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和土壤樣品測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 4 Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample

圖 1 立枯絲核菌和齊整小核菌 DNA的PCR擴(kuò)增Figure 1 PCR amplification of R. solani and S. rolfsii DNA

2.4 方法靈敏性評(píng)價(jià)

以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用2.2.1優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行qPCR靈敏性驗(yàn)證。結(jié)果顯示：本研究建立的qPCR定量檢測(cè)方法對(duì)立枯絲核菌和齊整小核菌的檢測(cè)限分別可達(dá)24×106和22×106拷貝·L-1(圖2)。

圖 2 qPCR的靈敏性Figure 2 Sensitivity test of qPCR

2.5 方法重復(fù)性評(píng)價(jià)

隨機(jī)選擇5個(gè)綠地土壤樣品DNA作為模板，使用本研究建立的方法對(duì)樣品中立枯絲核菌和齊整小核菌ITS基因拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：綠地土壤樣品立枯絲核菌和齊整小核菌ITS基因拷貝數(shù)2次檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)范圍分別為3.37%～4.61%和0.66%～8.61%(表5)，變異系數(shù)均低于10%，表明本研究建立的立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表 5 qPCR的重復(fù)性Table 5 Repeatability of qPCR

2.6 上海綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的定量檢測(cè)

將本研究建立的立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測(cè)方法應(yīng)用于上海綠地土壤樣品的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明：立枯絲核菌的檢出率為100%， ITS基因拷貝數(shù)最高為2.61×106拷貝·g-1；齊整小核菌的檢出率為19%，檢出樣品的ITS基因拷貝數(shù)最高為2.94×105拷貝·g-1。說(shuō)明立枯絲核菌在上海綠地表層土壤中廣泛存在。

3 討論

引物的特異性是對(duì)土傳病原真菌進(jìn)行qPCR檢測(cè)的關(guān)鍵[24]。真菌ITS序列目前已被廣泛用于真菌的親緣關(guān)系分析，為病原菌的分子檢測(cè)提供了較為理想的分子標(biāo)記[25]。本研究通過(guò)檢索文獻(xiàn)[19,22]及數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選得到了基于真菌ITS區(qū)域設(shè)計(jì)的立枯絲核菌和齊整小核菌種水平特異性引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR。NCBI NR數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)結(jié)果顯示：ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR目的片段錯(cuò)配率分別為7.7%和8.1%，理論上可實(shí)現(xiàn)對(duì)立枯絲核菌和齊整小核菌種水平特異性擴(kuò)增；同時(shí)，qPCR熔解曲線均為單一熔解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與序列均與目的片段一致。上述結(jié)果均表明：本研究建立的立枯絲核菌和齊整小核菌熒光定量檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。此外，qPCR檢測(cè)方法的靈敏性是評(píng)價(jià)其是否可行的另一個(gè)關(guān)鍵因素，一般是指可以準(zhǔn)確測(cè)量的樣品最小拷貝數(shù)[26]。前人的研究表明：對(duì)農(nóng)田土壤立枯絲核菌和大豆莖褐腐病菌Phialophora gregata等土傳病原菌qPCR檢測(cè)的靈敏性可以達(dá)26.7～100.0 (×106拷貝·L-1)[13,27-28]。本研究針對(duì)立枯絲核菌和齊整小核菌檢測(cè)限分別可達(dá)24×106和22×106拷貝·L-1，具有較高的靈敏性。因此，本研究所建立的qPCR檢測(cè)方法可以用于城市綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的定量檢測(cè)。

立枯絲核菌和齊整小核菌是寄主范圍廣、危害性強(qiáng)的土傳病原真菌，可侵染一些重要經(jīng)濟(jì)植物，例如水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea、樟樹和海桐等，造成植物根腐病和白絹病等病害的發(fā)生[7,10]。鑒于這2種病原菌分布的廣泛性，因此有必要了解其在城市綠地土壤中的分布情況，從而有效預(yù)防園林植物立枯病、根腐病和白絹病等病害的發(fā)生。本研究中上海綠地表層土壤立枯絲核菌的檢出率達(dá)100%，表明立枯絲核菌在上海綠地土壤中廣泛存在。齊整小核菌檢出率較低，為19%。齊整小核菌檢出率低，可能有兩方面的原因。一方面，隨著對(duì)城市綠地養(yǎng)護(hù)技術(shù)和措施的不斷提高和加強(qiáng)，齊整小核菌在土壤中的存在范圍可能縮小了；另一方面，也可能是由于采樣點(diǎn)的局限性，還不足以反映上海綠地土壤中齊整小核菌整體的存在情況，后期需要通過(guò)擴(kuò)大綠地土壤樣品采集范圍，更為全面地檢測(cè)齊整小核菌在上海綠地土壤中的分布情況。同時(shí)應(yīng)該看到，應(yīng)用qPCR方法檢測(cè)土壤中病原菌的數(shù)量時(shí)，并不能有效區(qū)分活體和死體病原菌的DNA，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)過(guò)高估計(jì)土壤中病原菌基因的豐度[29]。因此，如何準(zhǔn)確、快速測(cè)定城市綠地土壤中活體立枯絲核菌和齊整小核菌基因的豐度，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)立枯絲核菌和齊整小核菌qPCR引物的篩選和特異性驗(yàn)證、qPCR反應(yīng)條件的建立及靈敏性和重復(fù)性評(píng)價(jià)，建立了針對(duì)立枯絲核菌和齊整小核菌的快速、特異且靈敏性較高的qPCR檢測(cè)方法，可用于城市綠地土壤中這2種病原菌的定量檢測(cè)。