郝 昕，鄧 振，陳 潔，刁 健，李 洋，王欣然，馬 玲

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040）

松材線蟲Bursaphelechusxylophilus引起的松樹萎蔫?。ㄓ址Q松材線蟲病）是世界森林生態(tài)系統(tǒng)中具有極大危險性和破壞性的森林病害。該病害對亞洲和歐洲的松林造成毀滅性破壞，對森林生態(tài)安全造成嚴重威脅。自 1982年在我國首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲至今，雖全力防治，但全國由于松材線蟲引起的破壞仍造成了數(shù)十億株松樹的損失，造成的經(jīng)濟損失和生態(tài)價值損失更是高達千億元[1,2]。截至2021年，松樹萎蔫病已在全國19個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）、742個縣級行政區(qū)發(fā)生，占縣級行政區(qū)總數(shù)的26.1%。累計發(fā)生面積180.92萬hm2，同比上升62.40%，造成病死松樹1407.92萬株，并且表現(xiàn)出由點狀分布向片狀發(fā)展及向西和向北快速擴散的態(tài)勢[3,4]。松材線蟲對我國松林破壞巨大，嚴重影響我國的森林生態(tài)系統(tǒng)安全，阻礙了我國生態(tài)文明建設(shè)進程。

熱激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是一類廣泛存在于細菌、真菌和動植物中的蛋白質(zhì)分子家族。當(dāng)生物體暴露于高溫時，就會通過熱激發(fā)合成此種蛋白，以保護有機體自身。按照蛋白的質(zhì)量大小，熱激蛋白共分為五個亞族，分別為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 以及小分子熱激蛋白（small Heat Shock Proteins，sHSPs）[5]。許多熱激蛋白具有分子伴侶活性，可以協(xié)助細胞內(nèi)分子組裝和蛋白質(zhì)折疊發(fā)揮功能[6]。在秀麗線蟲Caenorhabditiselegans中的研究表明熱激蛋白不僅可以調(diào)節(jié)生物體對環(huán)境的適應(yīng)能力，延長生物體的壽命，還會激活生物體提高對重金屬及藥物的抗性[7,8]。因此HSP基因是近年來對生物耐熱機制等研究最多的蛋白之一[9]。對松材線蟲Bx-HSPs基因家族成員的研究有助于了解松材線蟲的擴散機制，進而為宏觀把控和防治松材線蟲的擴散和蔓延提供理論指導(dǎo)。

本研究基于NCBI數(shù)據(jù)庫中的秀麗線蟲HSPs基因和相關(guān)文獻，利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對松材線蟲基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到松材線蟲中HSPs基因23個。利用生物信息學(xué)分析軟件對獲得的Bx-HSPs基因進行生物信息學(xué)特性分析，預(yù)測分析Bx-HSPs基因的具體功能。通過對Bx-HSPs基因特性及功能的具體分析，為研究松材線蟲HSPs家族基因功能奠定基礎(chǔ)，也為尋找潛在靶標(biāo)基因，利用生物技術(shù)防治松材線蟲病提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 Bx-HSPs基因家族成員進化關(guān)系及理化特性測定

為了解松材線蟲Bx-HSPs家族成員信息，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了秀麗線蟲全部 HSPs基因。隨后，以秀麗線蟲 HSPs氨基酸序列作為檢索序列在 Wormbase（https://wormbase.org）[10]上與松材線蟲基因組[11]數(shù)據(jù)進行 BLAST比對，得到松材線蟲 HSPs同源序列18個。加上文獻已報道的5個松材線蟲Bx-hsp基因Bx-hsp12（BXY_1656400.1）、Bx-hsp20（BXY_1035800.1）、Bx-hsp70（BXY_0013600.1）、Bx-hsp75（BXY_1666100.1）和Bx-hsp90（BXY_0009200.1），共23個HSPs基因[12,13]。

通過理化性質(zhì)分析，可以為目標(biāo)蛋白功能機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在生物學(xué)中進化樹用來表明物種之間的進化關(guān)系。通過進化樹的構(gòu)建，可以為預(yù)測目標(biāo)蛋白的功能提供線索。應(yīng)用蛋白分析（Expert Protein Analysis System，ExPASy）網(wǎng)站[14]中 ProtParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）[15]對Bx-HSPs蛋白的理化性質(zhì)，如氨基酸數(shù)、相對分子量、理論等電點、脂肪系數(shù)、分子結(jié)構(gòu)式、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等進行分析。通過Clustal X將得到的松材線蟲Bx-HSPs基因進行序列比對分析[16]，并通過CDD工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對Bx-HSPs保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測[17]，隨后通過Mega 7軟件中的鄰位連接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，自展重復(fù)抽樣檢驗1000次[18]。

1.2 蛋白質(zhì)序列基序分析

通過MEME（https://meme-suite.org/meme/）方法對蛋白質(zhì)序列的基序進行分析[19]，隨后通過Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）[20]和 InterPro數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）[21]獲得基序注釋信息。

1.3 疏水性和跨膜螺旋區(qū)域分析

蛋白質(zhì)親疏水性對蛋白的穩(wěn)定性和功能具有重要的意義，而分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域可以對目的蛋白屬于何種功能蛋白做出研判，對預(yù)測蛋白的功能和作用有著重大意義。運用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進行蛋白疏水性分析[22]，運用TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和PSORTb（http://www.psort.org/psortb/）預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜螺旋區(qū)（Transmem-Brane helical segments, TMHs）[23]。使用Protter網(wǎng)站（http://wlab.ethz.ch/protter/start/）對蛋白質(zhì)的拓撲異構(gòu)模型進行預(yù)測[24]。

1.4 磷酸化位點分析

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。它與信號傳導(dǎo)、細胞周期、生長發(fā)育等諸多生物學(xué)問題有著密不可分的關(guān)系，研究蛋白質(zhì)磷酸化對闡明蛋白質(zhì)功能具有重要的生物學(xué)意義。應(yīng)用NetPhos 3.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[25]預(yù)測蛋白質(zhì)磷酸化位點。分析絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點數(shù)量。

1.5 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三級結(jié)構(gòu)建模

通過對預(yù)測結(jié)構(gòu)的分析，可以解釋酶的催化機理或預(yù)測蛋白質(zhì)的突變位點，從而推斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，有利于了解蛋白質(zhì)的執(zhí)行功能，確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對于生物學(xué)研究是非常重要的。本研究通過SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測Bx-HSPs蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[26]，運用 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對Bx-HSPs蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行同源建模[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bx-HSPs基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

從松材線蟲基因組中鑒定得到23個松材線蟲Bx-HSPs基因家族成員（表1）。這23個松材線蟲Bx-HSPs基因相對應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸組成數(shù)量與相對分子質(zhì)量具有顯著性差異（表 2）。氨基酸組成數(shù)量為 111～770，平均氨基酸數(shù)量為373.91。相對分子質(zhì)量為12631.16～88459.08，平均為42107.39。這些蛋白質(zhì)的理論等電點為 4.67～8.89，脂肪系數(shù)為 47.01～97.92。由此可見，這些蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性發(fā)生了明顯變化。蛋白質(zhì)親水性系數(shù)為-1.246～-0.101，蛋白質(zhì)的親水系數(shù)均為負值，表明上述23種熱激蛋白均為疏水蛋白。這些蛋白質(zhì)均由C、H、N、O和S五種原子組成。原子總數(shù)為1766～12464個不等。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)區(qū)間為26.22～62.90，共有12個蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，其中有9個為小熱激蛋白，表明小熱激蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定可能性更高，而其他11種蛋白質(zhì)的系數(shù)小于40，其中有6個預(yù)測結(jié)果為HSP70，表明HSP70 的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

表1 Bx-HSPs家族成員與秀麗線蟲HSPs家族成員對照表Table 1 Comparison table of Bx-HSPs and Ce-HSPs

表2 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Results of physicochemical properties of Bx-HSPs

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹及蛋白質(zhì)基序

通過構(gòu)建 NJ系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖 1）初步揭示了松材線蟲 HSPs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進化關(guān)系，以bootstrap多重采樣檢測作為結(jié)果的可靠性基礎(chǔ)。由表3可知，與預(yù)期相同，Bx-HSPs 家族蛋白質(zhì)，特別是那些具有相似進化關(guān)系的蛋白質(zhì)，均含有相同或相似的蛋白質(zhì)基序。通過MEME對序列的詳細分析，得到了15個保守的蛋白質(zhì)序列基序（圖2）。隨后，通過Pfam和InterProScan對蛋白質(zhì)基序進行分析，結(jié)果表明，基序8和基序9為HSP20結(jié)構(gòu)域，其他基序為HSP70結(jié)構(gòu)域。

圖1 Bx-HSPs家族成員系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Bx-HSPs.

圖2 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)基序示意圖Fig.2 The motifs analysis of Bx-HSPs

表3 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)基序分析Table 3 The motifs analysis of Bx-HSPs.

根據(jù) Pfam 和 InterProScan分析各蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)可知，BXY_0210400.1、BXY_1656600.1、BXY_HSP12、BXY_0289500.1、BXY_1365700.1、BXY_1274600.1、BXY_0957900.1、BXY_0586000.1、BXY_0165400.1、BXY_0750300.1、BXY_1552700.1和BXY_ HSP20為small HSP亞家族成員，而BXY_1563600.1、BXY_0768000.1、BXY_0640100.1、BXY_0312700.1、BXY_1651000.1、BXY_1076000.1、BXY_0218300.1、BXY_0318200.1、BXY_HSP70為HSP70亞家族成員。隨后對沒有通過MEME分析得到蛋白質(zhì)基序的BXY_HSP75和BXY_HSP90進行Conserved Domains Search分析研究發(fā)現(xiàn)，這兩個蛋白屬于HSP90亞家族成員。

2.3 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性和跨膜螺旋區(qū)分析

蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果以BXY_1563600.1為例對Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果進行說明。BXY_1563600.1蛋白中的第531位精氨酸（R）具有-3.944的低疏水性評分，由此可知它具有很高的親水性。相反，第395位的天冬氨酸（D）具有2.022的較高疏水性得分，表明其更具有疏水性。表4中列出了該家族氨基酸序列的疏水性分析結(jié)果，由該結(jié)果可知，該家族中的蛋白質(zhì)包含多個親水性和疏水性區(qū)域，但是他們的分布和聚集現(xiàn)象并不顯著。而通過TMHMM和PSORTb對蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員除BXY_1076000.1和 BXY_HSP90存在跨膜結(jié)構(gòu)外，其余家族成員均屬于胞內(nèi)蛋白。

表4 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性分析Table 4 Protein hydrophobicity analysis of Bx-HSPs

2.4 拓撲異構(gòu)模型預(yù)測

蛋白質(zhì)糖基化修飾除了影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運輸和定位，還在分子識別、細胞通信、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中發(fā)揮著重要的作用，因此糖基化位點分析具有十分重要的意義。Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)拓撲結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明（表5），該家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上含有0～7個N-糖基化位點。其中BXY-HSP70具有最多的N-糖基化位點個數(shù)，共計有7個。研究表明，N-糖基化位點的存在對于蛋白質(zhì)的折疊和運輸非常重要。因此，該預(yù)測結(jié)果可以從另一個角度證實Bx-HSPs家族成員的分子伴侶特性。

表5 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)拓撲結(jié)構(gòu)分析Table 5 Protein topological structure analysis of Bx-HSPs

2.5 二級結(jié)構(gòu)分析及三級結(jié)構(gòu)建模

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包含局部殘基之間由氫鍵所調(diào)節(jié)的相互作用。最普遍的二級結(jié)構(gòu)就是α-螺旋及β-折疊，此外還有β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。Bx-HSPs家族成員二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明（表6），Bx-HSPs家族成員α-螺旋占比為15.00%～58.61%，其中sHSPs的成員α-螺旋占比均小于40%；Bx-HSPs家族成員β-折疊占比為10.93%～27.93%；Bx-HSPs家族成員β-轉(zhuǎn)角占比為2.46%～12.90%；Bx-HSPs家族成員無規(guī)卷曲占比為27.21%～55.00%，其中sHSPs的成員無規(guī)卷曲占比均大于40%。三級結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明（圖3），Bx-HSP70亞家族、Bx-HSP90亞家族及Bx-sHSP亞家族三級結(jié)構(gòu)有明顯的形態(tài)學(xué)區(qū)別，因此執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。

表6 Bx-HSPs家族成員中構(gòu)成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量分析Table 6 The number of amino acids that constitute the secondary structure in BX-HSPs.

圖3 Bx-HSPs家族成員三級結(jié)構(gòu)分析Fig.3 The results of tertiary structure by Swiss-MODEL.

3 討論

松材線蟲是世界多國公認的外來入侵生物，由其引起的松樹萎蔫病導(dǎo)致松屬和杉屬等針葉樹種植物大量萎蔫死亡，危害極其嚴重[28]。隨著社會的進步和發(fā)展，人類活動對自然界的影響日益加劇，而如松材線蟲等外來生物的入侵風(fēng)險也日益受到廣泛關(guān)注[29]。外來生物發(fā)揮自身潛能是在新環(huán)境下形成入侵和擴散的關(guān)鍵[12]。本研究從生物信息學(xué)水平上分析熱激蛋白家族成員結(jié)構(gòu)與功能，為今后進一步在分子水平上開展松材線蟲對溫度適應(yīng)性的研究打下了基礎(chǔ)。

本研究對松材線蟲Bx-HSPs家族成員進行了多種形式的生物信息學(xué)分析。首先運用ProtParam工具對Bx-HSPs家族成員的理化性質(zhì)進行分析，為目標(biāo)蛋白功能機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。隨后運用鄰接法（NJ method）構(gòu)建了Bx-HSPs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，從而比較Bx-HSPs家族中各成員的序列相似性。由于親疏水性在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中起著至關(guān)重要的作用，因此本研究通過對蛋白質(zhì)疏水性分析，分析了 Bx-HSPs家族成員的結(jié)構(gòu)特點。N－糖基化位點的數(shù)量對蛋白質(zhì)的折疊和運輸起著重要作用，因此本研究對Bx-HSPs家族成員拓撲結(jié)構(gòu)進行了分析，結(jié)果證明了Bx-HSPs家族成員的分子伴侶特性。

截至目前，盡管有研究指出松材線蟲HSPs家族成員中有部分基因的變化使線蟲表現(xiàn)出對溫度改變的適應(yīng)性，但還沒有關(guān)于松材線蟲HSPs家族成員系統(tǒng)化報道。本研究的結(jié)果分析了松材線蟲HSPs家族成員調(diào)控線蟲響應(yīng)溫度適應(yīng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而該家族基因調(diào)控松材線蟲響應(yīng)溫度適應(yīng)性的調(diào)控機制還有待后續(xù)研究進行進一步探索與發(fā)現(xiàn)。本研究的目的在于為探索松材線蟲擴散的分子機制提供基礎(chǔ)，從而為松材線蟲的預(yù)測預(yù)報提供理論支持。