姚 雪，劉 臣，段云鵬，魏紀珍*，梁革梅

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，鄭州 450002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

轉(zhuǎn)一種蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）蛋白或多種Bt蛋白的作物不但有效地控制了害蟲的暴發(fā)，也帶來了極大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益[1-4]。因此，到2019年，Bt作物已經(jīng)在全球29個國家被批準種植，其年種植面積也超過了1.904億hm2[5]。然而，大面積的種植Bt作物，也使得昆蟲在巨大的選擇壓力下，抗性水平顯著增加，甚至威脅到轉(zhuǎn)Bt作物的種植和Bt的長期使用[6]。

目前，延緩抗性的一個重要策略是多基因策略，即在作物中表達多個不同作用靶標的抗蟲Bt基因[7]。目前應(yīng)用最廣的是在作物中同時表達Cry1A和Cry2A用于防治棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)等重要農(nóng)業(yè)害蟲。Cry1Ca也是Cry1家族的Bt蛋白，前期的研究表明Cry1C特異性受體與Cry1A類沒有或存在較低的競爭結(jié)合[8-10]。并且Cry1Ca能用于防治對Cry1A類蛋白產(chǎn)生抗性的害蟲[11-13]。除此之外，Cry1Ca蛋白對鱗翅目害蟲的殺蟲活性與其他Bt蛋白存在明顯差異，該蛋白應(yīng)用到轉(zhuǎn)多Bt基因作物中能在很大程度上擴大殺蟲譜[14]。事實上，Cry1Ca已被嘗試轉(zhuǎn)入到作物中用于防治害蟲和延緩抗性[15-18]。

轉(zhuǎn)Cry1A蛋白的棉花有效地遏制了棉鈴蟲的猖獗，但是其他鱗翅目害蟲，如甜菜夜蛾Spodopteraexigua和斜紋夜蛾Spodopteralitura等仍然不能被有效控制。其中，斜紋夜蛾是一種為害嚴重的，世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，它寄主植物廣泛，生殖力強，而且具有很強的遷飛習(xí)性，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的危害[19]。目前對斜紋夜蛾的防治主要是化學(xué)防治，長期化學(xué)農(nóng)藥的使用，已使斜紋夜蛾對傳統(tǒng)的化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了很高的抗性，包括有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥；甚至對一些新型殺蟲劑如多殺菌素、吲哚沙卡、氯蟲腈和阿維菌素等也產(chǎn)生了抗性[20-25]。我們的前期研究表明，Cry1Ca 對斜紋夜蛾具有很好的防治效果[14]，然而目前Cry1Ca 在斜紋夜蛾中的毒理作用和作用機制還缺乏相應(yīng)的研究。

昆蟲幼蟲取食 Bt蛋白后會對中腸組織造成嚴重的損傷，如亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis和粘蟲Mythimnaseparata取食Cry1F蛋白后，中腸細胞微絨毛腫脹、脫落；細胞核變形，質(zhì)膜和核膜界限不清晰；染色質(zhì)發(fā)生固縮、貼近核膜；線粒體拉伸變形、數(shù)量減少，嚴重的發(fā)生空泡化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹與斷裂、數(shù)量減少[26]。本研究通過斜紋夜蛾幼蟲取食Cry1Ca蛋白、解剖其中腸制備組織切片、通過透射電鏡觀察斜紋夜蛾取食Cry1Ca不同時間后中腸細胞組織的生理病變過程，為進一步研究Cry1Ca殺蟲蛋白的作用機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和Cry1Ca蛋白

斜紋夜蛾采集于湖北省武漢市，之后在實驗室人工氣候箱內(nèi)用人工飼料飼喂，溫度為（26±1）℃、相對濕度為（60±10）%、光周期為16L:8D。

Cry1Ca毒蛋白由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所抗蟲生物技術(shù)組饋贈，純化濃縮后的蛋白圖譜見文獻[14]。

1.2 中腸組織取樣

將4齡斜紋夜蛾幼蟲接于24孔養(yǎng)蟲盒內(nèi)，饑餓處理24 h，對照轉(zhuǎn)移到正常的飼料上飼養(yǎng)，試驗組轉(zhuǎn)移到含0.44 μg/g（該劑量為初孵幼蟲LC95的濃度）的Cry1Ca蛋白飼料上飼養(yǎng)，取食2 h、6 h、12 h、24 h和36 h后分別解剖幼蟲中腸，對照和Cry1Ca處理各24頭，重復(fù)3次。

1.3 中腸組織超薄切片制作和電鏡觀察

采用雙固定法制備玻片。解剖后的中腸先用3%戊二醛前固定，后用1%鋨酸對中腸樣品進行后固定。經(jīng)過0.1 mol/L的磷酸緩沖液脫水、置換、滲透、包埋、聚合、超薄切片、切片染色后，具體玻片的制備參考文章[27,28]。利用日產(chǎn)Hitachi-500透射電子顯微鏡，80 kV加速電壓下拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾中腸杯狀細胞微絨毛變化

斜紋夜蛾中腸正常的杯狀細胞微絨毛排列密致整齊，數(shù)量眾多（圖1A）；取食Cry1Ca 2 h后，杯狀細胞微絨毛出現(xiàn)嚴重脫落（圖1B），6 h后，杯狀細胞微絨毛明顯發(fā)生腫脹和扭曲（圖1C）；12～36 h，微絨毛變形、斷裂和脫落情況逐步加?。▓D1D，1E，1F），36 h時杯狀細胞的微絨毛幾乎脫落完畢（圖1F）。

圖1 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中杯狀細胞變化Fig.1 Histopahtological changes of S.litura midgut goblet cells after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxins

2.2 斜紋夜蛾中腸柱狀細胞微絨毛變化

斜紋夜蛾中腸正常的柱狀細胞的微絨毛細長、排列整齊，數(shù)量眾多（圖2A）；取食Cry1Ca 2 h后，柱狀細胞的微絨毛數(shù)量開始變少，斷裂情況嚴重（圖2B）；6 h后，微絨毛已經(jīng)基本被全部破壞（圖2C），柱狀細胞微絨毛也明顯表現(xiàn)出腫脹和扭曲（圖2D，2F）；隨時間延長，脫落情況進一步加劇，到24和36 h時完全脫落（圖2E，2F）。

圖2 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中柱狀細胞變化Fig.2 Histopahtological changes of S.litura midgut columnar cells after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

2.3 斜紋夜蛾中腸細胞細胞核變化

斜紋夜蛾中腸細胞正常的細胞核是圓形的、飽滿、圓潤、核膜完整、邊界清晰可見，染色質(zhì)分布均勻（圖3A）；取食Cry1Ca 2 h后，細胞核略有變形，呈現(xiàn)橢圓形（圖3B）；6 h 后，細胞核變形加劇，圓潤的細胞核呈現(xiàn)皺縮，染色質(zhì)聚集一側(cè)（圖3C）；12 h和24 h后，細胞核繼續(xù)變形或畸形（圖3D，3E），染色質(zhì)進一步聚集；36 h時，核膜破壞，邊界模糊，細胞質(zhì)流出（圖3F）。

圖3 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中細胞核變化Fig.3 Histopahtological changes of S.litura midgut cell nucleus after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

2.4 斜紋夜蛾中腸細胞線粒體變化

斜紋夜蛾中腸細胞正常的線粒體為橢圓形或紡錘形，內(nèi)脊清晰（圖4A）；取食Cry1Ca 2 h后，線粒體內(nèi)脊開始模糊（圖4B）；6 h后，線粒體內(nèi)脊更加模糊、變形、發(fā)生空泡化（圖4C）；12 h、24 h和36 h后，細胞線粒體繼續(xù)拉長變形，空泡化加劇，數(shù)量減少（圖4D，4E，4F）。

圖4 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中細胞線粒體變化Fig.4 Histopahtological changes of S.litura midgut mitochondria after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

2.5 斜紋夜蛾中腸細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化

斜紋夜蛾中腸細胞正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，呈線狀整齊排布于細胞質(zhì)中（圖5A）；取食Cry1Ca 2 h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列逐漸雜亂無章、腫脹變形，隨時間的推移病狀加劇；密集的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在6 h后開始變得稀疏，24 h和36 h后基本完全消解（圖5B～5F）。

圖5 取食含Cry1Ca蛋白的人工飼料不同時間后斜紋夜蛾中腸組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變化Fig.5 Histopahtological changes of S.litura midgut endoplasmic reticulum after feeding on artificial diets incorporated with Cry1Ca toxin

3 討論

通過不同時間點取樣觀察斜紋夜蛾取食Cry1Ca后的中腸組織病變情況，我們發(fā)現(xiàn)中腸組織的病變情況與取食其他Bt蛋白后的癥狀類似[14,27-30]，都會出現(xiàn)中腸細胞微絨毛的腫脹、扭曲、斷裂和脫落（圖1，2），細胞核會出現(xiàn)拉長或畸形、核膜模糊、染色質(zhì)不均勻和聚集（圖3），線粒體變形、發(fā)生空泡化、內(nèi)脊模糊不清并隨時間推移癥狀加重（圖4）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得雜亂無章、腫脹變形和數(shù)量減少（圖5）。在中腸組織中，昆蟲中腸柱狀細胞的質(zhì)膜的充分折疊大大增加了細胞吸收和分泌的面積，進而達到對營養(yǎng)物質(zhì)充分消化吸收的目的；杯狀細胞具有調(diào)節(jié)血淋巴和腸腔中K+和H+平衡的作用。分析Bt的作用模型表明昆蟲取食Cry1類蛋白后，在中腸堿性環(huán)境中Bt原蛋白被蛋白酶活化成為65 kDa左右有殺蟲活性的活化片段，這些活化的Bt片段與中腸受體結(jié)合，經(jīng)過構(gòu)象變化，插入于中腸上皮細胞膜內(nèi)，進而形成細胞孔洞，導(dǎo)致細胞膨脹，滲透壓失衡，最終造成昆蟲死亡[31]，這些中腸病變可能是與受體的結(jié)合或者穿孔作用引起的。本研究結(jié)果說明，Cry1Ca與其他Bt蛋白引起的中腸病變過程相似，推測其與其他Bt蛋白在中腸內(nèi)的生理作用機制類似。

然而，不同Bt蛋白作用靶標害蟲后，造成中腸病理變化的時間具有差異，Cry1Ac（0.5 μg/g）作用2 h后，棉鈴蟲中腸已發(fā)生明顯的病理變化，且隨著時間推后，影響越劇烈；Vip3Aa（50 μg/g）對棉鈴蟲的作用則較慢，在取食12 h后才可以觀察到有明顯的組織病理變化[28]，盡管Vip3Aa的濃度高于Cry1Ac濃度的100倍，但是Cry1Ac的作用速度要更快，這一結(jié)果與Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力高于Vip3Aa對棉鈴蟲毒力是一致的[14,32]。類似的，使用較低濃度的Cry1Ac（0.97 μg/g）對棉鈴蟲的作用速度快于較高濃度的 Cry2Ab（8 μg/g）對棉鈴蟲的作用速度[28]，這與Cry1Ac對棉鈴蟲的毒力高于Cry2Ab對棉鈴蟲的毒力也是一致的[33]。這些結(jié)果表明病變速率的快慢一方面跟劑量有關(guān)，但是更多地反映出毒力的高低。4齡亞洲玉米螟和粘蟲取食Cry1F蛋白（初孵幼蟲LC90的劑量）48 h后中腸組織發(fā)生明顯的病變[26]。本研究中，斜紋夜蛾4齡幼蟲取食Cry1Ca（初孵幼蟲LC95的濃度）后2 h中腸各組織就開始出現(xiàn)病理變化，這與Cry1Ca對斜紋夜蛾較高的殺蟲活性一致[14]。斜紋夜蛾目前是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要害蟲，對棉花、玉米、大豆、多種蔬菜等造成嚴重為害[19]。前期報道的Cry1Ca特異性受體與Cry1A不存在競爭結(jié)合[8-10]，Cry1Ca能用于防治對Cry1A類蛋白產(chǎn)生抗性的害蟲[11-13]。這里我們發(fā)現(xiàn)Cry1Ca作用于斜紋夜蛾的中腸組織在2 h就能有明顯的病變暗示著其較高的毒力效果，綜上研究表明Cry1Ca是多基因策略轉(zhuǎn)基因作物的重要潛力殺蟲蛋白。

然而，在其他農(nóng)業(yè)害蟲中的研究報道結(jié)果表明，對Cry1C產(chǎn)生抗性的小菜蛾品系對Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F和Cry1J也產(chǎn)生了抗性[34]，對Cry1Ab產(chǎn)生了抗性的甜菜夜蛾品系同時對Cry1Ca 也產(chǎn)生了抗性[35]。同時，甜菜夜蛾的鈣黏蛋白被鑒定為Cry1Ca和Cry1Ac的共同受體[36-38]。這些研究給我們也提出了預(yù)警，對于Cry1Ca在斜紋夜蛾中的受體和作用機理需要進行深入的研究，以便于制定合理有效的抗性治理措施。

致謝：試驗得到中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能研究所郝宏京老師和王瑩老師的幫助，特此表示感謝!