余振懷，肖婕妤，鄧秋林，文秋姝，巫 蔚，鄭 滔，張亞琴，劉 江，陳興福

（四川農業(yè)大學農學院/農業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，成都 611130）

澤瀉為常用大宗藥材，是利水滲濕之要藥。澤瀉始載于《神農本草經(jīng)》，《本草綱目》中記載：“神農書列澤瀉于上品……其繆可知”之句?！吨袊幍洹罚?020年版，一部）記載藥材澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientate(Sam.) Juzep.或澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖。澤瀉味甘、淡，性寒，有利水滲濕，泄熱，化濁降脂的功效[1]。藥理學研究表明其醇提物、水提物具有利尿、抗結石及腎臟保護、降血脂及保肝、降血糖、抗氧化損傷、抗炎、抗補體等多種藥理活性[2]。

澤瀉白斑病的防治措施影響澤瀉產量與安全性。隨著福建改革開放的不斷深入與臺海經(jīng)濟圈建設，建澤瀉生產的比較效益降低，造成了種植面積大幅度下降，川澤瀉種植面積不斷擴大，年產量 9500噸，占全國總產量的85%以上。白斑病主要危害澤瀉葉片、莖，造成葉片變黃變枯，在整個生育期均可發(fā)生，每年造成的產量損失為25%～35%[3]，有效防治可保證澤瀉高產高效。澤瀉生產上白斑病防治缺乏科學指導，濫用農藥現(xiàn)象突出，農殘超標的情況時有發(fā)生，鄭雙雙等[4]對11個地區(qū)澤瀉中7種農藥的殘留量進行檢測，不合格率為40%。中藥材的農殘超標是中藥材安全性關注的重點，而澤瀉白斑病防治目前僅有一些藥劑使用研究，生物農藥春雷霉素和多抗霉素對澤瀉白斑病有較好的防治效果[5]，但關于澤瀉白斑病田間藥劑防效及其殘留變化規(guī)律研究較少。

以化學藥劑為主的防治技術已不符合當下生態(tài)農業(yè)的發(fā)展趨勢。使用化學藥劑易導致藥材質量降低和環(huán)境質量下降，違背了“中藥材無公化栽培”的發(fā)展方向[6]。我國逐漸推出政策控制化學農藥的使用，提出持續(xù)推進農藥減量增效，積極開展生物農藥替代行動[7]。因此，本研究選用生產上常用的化學農藥與生物農藥開展防治澤瀉白斑病的藥效比較試驗，探究農藥殘留的變化規(guī)律，評價對澤瀉藥材安全性的影響，為澤瀉白斑病的防治提供理論參考和應用技術，促進澤瀉產業(yè)的綠色發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：試驗植株經(jīng)四川農業(yè)大學陳興福教授鑒定為澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.。試驗藥劑：15%三唑酮可濕性粉劑（江蘇省鹽城利民農化有限公司）、80%波爾多液可濕性粉劑（通州正大農藥化工有限公司），2%春雷霉素水劑（日本北興），10%多抗霉素可濕性粉劑（日本科研制藥株式會社）。

試驗地點：在樂山市夾江縣青州鄉(xiāng)海濱農場基地實施，該基地采用水稻-澤瀉輪作，試驗地土壤類型為紫泥土，肥力中等。

儀器與試劑：Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀；島津LC-20A高效液相色譜儀；TAS-990原子吸收分光光度計；色譜柱：Symmetry C18250 mm×4.6 mm×5 μm；Synergy-超純水機；ALLgraX-30R-臺式冷凍離心機；5424R-離心機；超聲波清洗機（SB25-12DTD）；三唑酮標準品（中科質檢有限公司）；春雷霉素標準品（邁迪嘉科技有限公司）；銅標準溶液（國標檢驗認證有限公司）；甲醇（色譜純 Fisher）；乙腈（色譜純 Fisher）；QuEChERS-凈化管2 mL（150 mg MgSO4+50 mg PSA）；無水乙酸鈉（分析純）；無水硫酸鎂（分析純）；庚烷基硫酸鈉（分析純）。

1.2 田間藥效試驗

采用單因素隨機區(qū)組設計。15%三唑酮可濕性粉劑、80%波爾多液可濕性粉劑、2%春雷霉素水劑和10%多抗霉素可濕性粉劑施用濃度分別為1000、1000、400、400倍液，用水量30 L/667 m2，對照噴施等量清水，共5個處理，設置3次重復。試驗小區(qū)面積14.4 m2（2 m×7.2 m），試驗小區(qū)總面積216 m2。8月底選用長勢一致的澤瀉幼苗移栽，株行距為25 cm×30 cm。在病害發(fā)生初期（澤瀉地上部分快速成長期）進行第1次噴藥，隔7 d噴1次，共2次，使用手動噴霧器均勻噴施到各小區(qū)澤瀉植株上。調查藥前和藥后7 d的病葉數(shù)，每小區(qū)選5個點，每點選5株，計算病情指數(shù)和校正防效。病情指數(shù)＝∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調查總葉數(shù)×最高級代表值）×100；校正防效（%）＝[1－（處理區(qū)防治后病情指數(shù)/處理區(qū)前防治病情指數(shù)）×（對照區(qū)防治前病情指數(shù)/對照區(qū)防治后病情指數(shù)）]×100。

第2次噴藥后15 d后開始取樣，每15 d取樣1次直至采收，共取5次。采用五點取樣法，每小區(qū)取5株，將澤瀉塊莖用作農藥殘留檢測。澤瀉采收時每小區(qū)按五點取樣法另取30株，將塊莖烘干測其產量。

1.3 澤瀉塊莖藥劑殘留分析

1.3.1 標準曲線的繪制 準確稱量適量三唑酮、春雷霉素和銅標液，三唑酮和春雷霉素用乙腈稀釋配置成質量濃度為1.0 mg/L的標準溶液，用空白基質溶液稀釋成0.01～1μg/mL的標準工作液；銅標液用2%硝酸溶液0.05～1 μg/mL的標準工作液。以濃度μg/mL為橫坐標x，以峰面積為縱坐標y，并繪制出標準工作曲線。

1.3.2 樣品前處理 三唑酮和春雷霉素樣品前處理：采用 QuECHERS前處理方法，取澤瀉粉末，過三號篩，取約5.0 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入5 mL超純水，精密加乙腈溶液10 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4:1）2.5 g，立即搖散，置振蕩器上2000 r/min振蕩培養(yǎng)10 min，8000 r/min離心5 min。取上清液2 mL，置已預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水硫酸鎂150 mg，N-丙基乙二胺（PSA）50 mg）中，立即用使凈化完全，5000 r/min離心5 min，精密量取上清液1 mL用0.22 μm微孔濾膜過濾于進樣瓶中，作為HPLC供試品溶液。

銅樣品前處理：精密稱取澤瀉藥材粉末0.5 g置于四氟乙烯罐中，加硝酸-高氯酸（4:1）混合溶液5 mL，混勻，瓶口加一小漏斗，放置于通風櫥內，浸泡過夜。置電熱板上，加熱至微沸，若變棕黑色，再加硝酸-高氯酸（4:1）混合溶液適量，持續(xù)加熱至溶液澄明后升高溫度，繼續(xù)加熱至冒濃煙，直至白煙散盡，消解液呈無色透明或略帶黃色，放冷，轉入50 mL量瓶中，用2%硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備試劑空白溶液。

1.3.3 測定條件 春雷霉素使用島津LC-20A參考張清鵬[8]方法檢測：Symmetry C18250 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫25 ℃；流動相：V（甲醇）:V（10 mmol/L的庚烷磺酸鈉緩沖液，pH=3）=1:9；流速1 mL/min；檢測波長215 nm；進樣量20 μL，運行時間15 min。

三唑酮使用Agilent 1260 Ⅱ參考楊石有[9]方法檢測：Symmetry C18250 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫40℃；流動相甲醇：水（85:15）；流速1 mL/min；檢測波長230 nm；進樣量20 μL，運行時間6 min。

銅殘留按照《中國藥典》（2020年版，四部）火焰法檢測[10]：檢測波長324.7 nm，采用空氣-乙炔火焰，使用空白試驗進行背景校正后檢測。

1.3.4 添加回收率試驗 選用澤瀉空白樣品，稱取5 g于50 mL離心管中。向其中添加0.05、0.10和0.5 mg/kg 3個水平，其中添加銅標液為0.5、1和5 mg/kg這3個水平，每個添加水平設6次平行。在上述測定條件下進行檢測，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2010和DPS7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理，多重比較采用LSD法。

2 結果與分析

2.1 白斑病防治藥效比較

4種藥劑防治澤瀉白斑病的結果表明，按推薦劑量和次數(shù)噴施后選用藥劑對澤瀉白斑病均有一定的防治效果，各處理小區(qū)產量存在差異（表1）。

表1 不同殺菌劑對澤瀉白斑病的防治效果Table 1 Control effect of different fungicides on Alisma orientalis white spot

1次藥后7 d病情指數(shù)相對與對照有所下降，說明病害得到了初步控制。15%三唑酮表現(xiàn)出理想的控制效果，與其余農藥防效差異顯著。80%波爾多液和 2%春雷霉素防效較好，二者防效差異不顯著，與 10%多抗霉素防效差異顯著。

第2次藥后7 d空白病情指數(shù)更高，處理小區(qū)病情指數(shù)下降，說明病害進一步得到了控制?？瞻撞∏橹笖?shù)為16.53，各處理病情指數(shù)為空白的9.92%～20.15%，說明試驗所有藥劑在連續(xù)使用2次后能夠有效防治澤瀉白斑病。2%春雷霉素防效最好為64.59%，與其他農藥差異顯著，10%多抗霉素防效、15%三唑酮和80%波爾多液防效在45.27%～48.47%，差異不顯著。

對澤瀉產量的調查結果表明：各藥劑處理能夠防治澤瀉白斑病保證產量。處理小區(qū)與空白小區(qū)產量差異顯著，每公頃增產7.6%～22.3%，其中三唑酮處理小區(qū)產量最高，春雷霉素、三唑酮和波爾多液產量差異不顯著。

2.2 澤瀉藥材安全風險評價

2.2.1 分析方法驗證 從檢測結果可以看出，在一定線性范圍內，3種藥劑的質量濃度與峰面積呈良好的線性關系（圖1，表2）。目前《中國藥典》（2020年版，四部）并未規(guī)定澤瀉中春雷霉素和三唑酮的最大殘留限量，參考食品安全國家標準-食品中農藥最大殘留限量（GB 2763-2019）谷物中春雷霉素和三唑酮最大殘留限量，春雷霉素檢測限為0.05 mg/kg，低于規(guī)定中最大殘留限量0.1 mg/kg；三唑酮檢測限為0.02 mg/kg，低于規(guī)定中最大殘留限量0.2～0.5 mg/kg。銅檢測限為0.5 mg/kg，低于《中國藥典》（2020年版，四部）規(guī)定中銅最大殘留限量20 mg/kg。

圖1 三唑酮和春雷霉素標準色譜圖（左為春雷霉素，右為三唑酮）Fig.1 Standard chromatograms of trizodone and riminomycin (Left for Triadimefon, Right for Kasugamycin)

表2 3種農藥的線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equation, correlation coefficient and detection limit of 3 fungicides

添加回收結果表明，在0.05～0.5 mg/kg添加水平下，三唑酮和春雷霉素的回收率在77%～91%，RSD在2.2%～6.7%（n=6）之間；在0.5～5 mg/kg添加水平下，銅的回收率在92%～102%，RSD在3.2%～4.7%（n=6）之間（表3），方法具有良好的準確性和重復性，滿足農藥殘留檢測分析的要求[11]。

表3 3種農藥在澤瀉中的添加回收率與相對標準偏差 (n=6)Table 3 Recoveries and RSD of three fungicides in Alisma orientalis (n=6)

2.2.2 澤瀉藥材安全風險比較 殘留分析結果表明，不同殺菌劑施用后在澤瀉塊莖中的動態(tài)殘留變化不同（多抗霉素產量相對最低，未作農藥殘留分析）。從各藥劑在澤瀉塊莖中殘留量趨勢圖可以看出，三唑酮和春雷霉素總體呈下降趨勢，波爾多液呈先上升后下降趨勢。2%春雷霉素2次施藥后15 d沉積量為0.42 mg/kg，高于其最大殘留限量0.1 mg/kg，藥后30 d后已降解90.47%，低于最大殘留限量，到45 d時已檢測不出。15%三唑酮藥后15 d沉積量為0.91 mg/kg，高于其最大殘留限量0.2 mg/kg，藥后45 d低于最大殘留限量，采收時已降解95.04%。80%波爾多液在施藥后15 d到60 d都呈上升趨勢，到60 d時達到最高殘留量3.90 mg/kg，到采收時殘留量約為藥后15 d的3倍，均低于最大殘留限量20 mg/kg，銅為重金屬元素，不可降解，塊莖中含量升高，可能是從莖葉轉移到了塊莖中（圖2）。

圖2 澤瀉塊莖中農藥殘留Fig.2 Pesticide residues in rhizome of Alisma orientalis

3 討論

試驗藥劑對澤瀉白斑病的防治效果存在差異?；瘜W農藥15%三唑酮速效性好，能迅速控制病情，但生物農藥2%春雷霉素施藥2次后防效更好。澤瀉采收時測產結果表明，2%春雷霉素小區(qū)與15%三唑酮小區(qū)產量差異不顯著，說明生物農藥2%春雷霉素AS能夠保證澤瀉高產高效。80%波爾多液作為廣譜性殺菌劑，在世界范圍內廣泛應用，楊文成通過藥效試驗發(fā)現(xiàn)病初噴施波爾多液也有較好的防治效果[12]。葛有茂等[5]在福建開展?jié)蔀a白斑病防治藥劑的篩選結果中，10%多抗霉素2次藥后5 d防效為87.96%，與本試驗結果有一定差異，可能是施藥時間和氣候差異的原因。

施用生物農藥后澤瀉藥材安全風險最低。春雷霉素在澤瀉塊莖中降解最快，藥后30 d已低于0.1 mg/kg，藥后45 d已檢測不出。三唑酮在藥后30 d仍高于部分谷物的最大殘留限量0.2 mg/kg，波爾多液殘留量在澤瀉塊莖中呈上升再下降的趨勢，兩種化學農藥在澤瀉塊莖中的殘留期都較長，在采收時都有少量農藥殘留。澤瀉作為防病、治病的中藥材，也常用于保健食品行業(yè)，對藥材質量的要求更加嚴格，施用春雷霉素后的澤瀉藥材不僅順應藥材鮮加工的發(fā)展趨勢，也更符合中藥注射劑原料的質量要求。施用生物農藥對環(huán)境安全風險也最低，春雷霉素極易溶于水，能在水中迅速降解，難以在土壤積累，對環(huán)境安全友好[13]。三唑酮殘留時間較長，存在安全風險，使用不當極易導致殘留超標問題，波爾多液中銅作為重金屬，長期使用會造成土壤中重金屬的積累，使環(huán)境質量下降。

綜上，生物農藥 2%春雷霉素防效好，殘留期短，相較化學農藥安全性更高，對環(huán)境友好，符合綠色農業(yè)發(fā)展的生態(tài)理念，是澤瀉白斑病防治的理想藥劑，在澤瀉生產中可作為白斑病防治的首選藥劑。