賴寶春，戴瑞卿，吳振強(qiáng)，姚錦愛，曾天寶，王家瑞

（1.福建省漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，漳州 363005；2.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013）

琯溪蜜柚是福建省平和縣的名牌水果，栽培歷史悠久，因柚肉汁多皮薄、酸甜適中而深受消費(fèi)者的喜愛[1]。目前，國內(nèi)種植蜜柚的地區(qū)主要有福建、廣東、四川、廣西等南方省份。近年來，由于大規(guī)模、單一化種植及不合理使用農(nóng)藥，蜜柚病害的發(fā)生日益突出，已嚴(yán)重影響到蜜柚的品質(zhì)和產(chǎn)量。由亞洲柑橘葉點(diǎn)霉PhyllostictacitriasianaWulandari引起的琯溪蜜柚黑斑病在主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，主要危害果實(shí)，嚴(yán)重影響果實(shí)的外觀品質(zhì)[2]。蜜柚黑斑病病原與柑橘黑斑病病原屬于不同的種，柑橘黑斑病病原其無性世代為柑橘葉點(diǎn)霉Phyllostictacitricarpa，有性世代為柑橘球座菌Guignardiacitricarpa[3]。但研究表明柑橘葉點(diǎn)霉P.citricarpa也能引起蜜柚發(fā)病，且與蜜柚黑斑病菌P.citriasiana引起的癥狀相似[2]。目前生產(chǎn)上防治該病主要依賴多次使用化學(xué)農(nóng)藥，長期大量使用會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留、致病菌產(chǎn)生抗藥性、生態(tài)環(huán)境污染等問題。生物防治因其高效、生態(tài)安全、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為植物病害防治的發(fā)展趨勢[4]。由于琯溪蜜柚漫山遍野種植，從生態(tài)安全考慮，利用微生物防治蜜柚病害是實(shí)現(xiàn)蜜柚病害綠色可持續(xù)控制的有效方法，對蜜柚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。

目前有關(guān)蜜柚黑斑病生物防治的研究鮮見報(bào)道。鄭域茹等[5]分離到一株短小芽胞桿菌BC12對蜜柚黑斑病菌的皿內(nèi)抑制率為55.84%，但對該菌的防治研究未見報(bào)道。Lucon等[6]利用3株蘇云金桿菌Bt-HD-567、Bt-Dimy和Bt-DiPel產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物處理采后柑橘黑斑病G.citricarpa的防控研究，結(jié)果表明，經(jīng)蘇云金桿菌處理的柑橘果實(shí)黑斑病的病斑大小與對照相比分別減少了 70%、65%和 71%。Lombardo等[7]用14種香精油對采后柑橘黑斑病P.citricarpa進(jìn)行防治試驗(yàn)，結(jié)果表明，14種精油對柑橘黑斑病菌抑制效果較好，其中Conyzabonaerensis精油能完全抑制黑斑病菌菌絲的生長。Kupper 等[8]研究了2株能產(chǎn)生抗真菌化合物的枯草芽胞桿菌ACB-AP3和ACB-83對橙黑斑病P.citricarpa的田間防治試驗(yàn)，結(jié)果表明2株枯草芽胞桿菌對橙黑斑病具有明顯的控制作用。Mauricio等[9]用酵母產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物對柑橘黑斑病菌菌絲的抑制率高達(dá)87.2%。

本研究從植物根際土壤篩選獲得對琯溪蜜柚黑斑病菌拮抗作用顯著的放線菌XG40菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA、recA、rpoB、gyrB基因序列分析鑒定，并進(jìn)行抑菌效果研究及防效評價(jià)，以期為琯溪蜜柚病害生物防治提供一定的理論基礎(chǔ)和菌種資源，也為田間蜜柚病害綠色防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

放線菌菌株：從蜜柚根際土壤、草莓根際土壤中分離、純化和篩選獲得放線菌菌株。

琯溪蜜柚黑斑病菌P.citriasiana由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保研究室分離保存，用于放線菌菌株篩選及防效試驗(yàn)。

14種植物病原菌菌株：琯溪蜜柚炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、琯溪蜜柚黑點(diǎn)病菌Diaporthe citri、辣椒枯萎病菌Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum、香蕉枯萎病菌4號生理小種F.oxysporiumf.sp.cubenserace 4、番茄枯萎病菌F.oxysporiumf.sp.lycopersici、草莓根腐病尖孢鐮刀菌F.oxysporum、草莓根腐病層出鐮孢菌F.proliferatum、草莓根腐病茄病鐮刀菌F.solan、番茄青枯病菌Ralstoniasolanacearum、虎皮蘭葉斑病菌Paenibacilluspolymyxa由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保研究室分離保存，榕樹炭疽病菌C.gloeosporioides、多肉黑斑病菌Alternariaalternata、蘭花莖腐病菌F.oxysporium、番茄葉霉病菌Fulviafulva由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。用于拮抗菌株抑菌譜測試。

供試藥劑：10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，先正達(dá)（中國）投資有限公司，為果農(nóng)防治琯溪蜜柚黑斑病常用藥劑，用于防效研究。

供試培養(yǎng)基[10]：無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、甘油-天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖-天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基、淀粉水解瓊脂培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基，碳、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于拮抗菌株鑒定。高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂粉 18 g（液體培養(yǎng)基不加）、水1000 mL，pH 7.2～7.4，用于放線菌的分離純化和鑒定；PDA培養(yǎng)基，用于靶標(biāo)病原菌的培養(yǎng)；

1.2 拮抗菌株的分離與篩選

1.2.1 拮抗菌株的分離 采用稀釋涂布分離法[11]分離放線菌。將采集的土樣置于室內(nèi)通風(fēng)陰干后，稱取5 g土壤倒入放有滅菌玻璃珠的50 mL無菌水中，置于180 r/min振蕩培養(yǎng)箱振蕩30 min后，取1 mL土壤混懸液，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，分別吸取10-3、10-4、10-5、10-6稀釋液0.1 mL均勻涂布于高氏1號固體培養(yǎng)基上，28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取培養(yǎng)性狀不同的單菌落轉(zhuǎn)入高氏1號固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，純化3次后得到純菌株，將純菌株編號后置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 以琯溪蜜柚黑斑病菌為靶標(biāo)菌，采用平板對峙培養(yǎng)法[12]對上述分離培養(yǎng)的放線菌進(jìn)行初篩。將靶標(biāo)菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的中心，在距靶標(biāo)菌20 mm處的2個(gè)點(diǎn)接種上述分離的放線菌，以只接靶標(biāo)菌的平板為對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照組病原菌的菌落直徑長到培養(yǎng)皿直徑的3/4時(shí)，測量每株分離放線菌的抑菌帶寬度。選擇抑菌帶寬，抑菌活性強(qiáng)且長勢好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 拮抗菌株的鑒定

采用插片法[13]，待拮抗菌株菌絲長上蓋玻片后，取菌絲生長適中的蓋玻片利用JEOL JSM-6380LV型掃描電鏡（日本電子公司）觀察拮抗菌株的氣生菌絲、孢子絲和孢子的形態(tài)特征。拮抗菌株的培養(yǎng)特征和生理生化特征分析：參照中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組編著的《鏈霉菌鑒定手冊》[13]和關(guān)統(tǒng)偉等《放線菌系統(tǒng)分類技術(shù)》[10]。觀察拮抗菌株培養(yǎng)特征的8種培養(yǎng)基見表3。用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取拮抗菌株的DNA，并擴(kuò)增16S rDNA[14]、recA基因[15]、rpoB基因[16]和gyrB基因[17]（四組基因片段的PCR反應(yīng)程序及條件見表1）。PCR產(chǎn)物委托上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序的基因序列登錄NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST比對，并從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得同源性高的相關(guān)菌株的基因序列，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列多重比對，然后用鄰位加入法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，最終確定拮抗菌株的分類地位。

表1 選擇的基因引物和PCR程序Table 1 Sequence of the primers and PCR program used in this study

1.4 拮抗菌株的抑菌效果研究

1.4.1 拮抗菌株的抑菌譜測定 采用搖瓶發(fā)酵法[12]制備拮抗菌株發(fā)酵液。將100 mL高氏一號液體培養(yǎng)基加入250 mL三角瓶中，121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻后接入5 mm的拮抗菌株菌餅5塊，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，在無菌條件下將發(fā)酵液吸到滅菌離心管中，8000 r/min離心30 min，吸取上清液，置于-20 ℃冰箱中備用。采用平板對峙法[12]測定拮抗菌株發(fā)酵液對供試12種植物病原真菌的抑菌效果，以無菌水為對照，重復(fù)3次，28 ℃倒置培養(yǎng)7 d后測量抑菌帶寬度。2種植物病原細(xì)菌則采用牛津杯法[18]測定，將100 μL培養(yǎng)好的供試細(xì)菌與培養(yǎng)基混勻后倒入放置牛津杯的平板，待凝固后取出牛津杯，在孔中加入100 μL的拮抗菌株發(fā)酵液，以無菌水為對照，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)48 h后測定透明抑菌圈的大小。

1.4.2 拮抗菌株對黑斑病菌菌絲的抑制作用 用無菌接種針挑取對照組黑斑病菌正常生長菌絲及處理組受拮抗菌株抑制的黑斑病菌菌絲制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拮抗菌株對黑斑病菌菌絲形態(tài)的影響。

1.4.3 拮抗菌株發(fā)酵液對黑斑病菌孢子的影響 用無菌接種針挑取病原菌孢子囊接入滴有拮抗菌株發(fā)酵液的凹玻片中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，設(shè)置無菌水和空白發(fā)酵液作為對照。分別于12、24、36和48 h觀察病菌孢子的情況。

1.5 拮抗菌株發(fā)酵液對蜜柚黑斑病的防效

1.5.1 室內(nèi)防效測定 取健康新鮮琯溪蜜柚桌球期果實(shí)，用75%酒精表面消毒，無菌水沖洗3次，自然風(fēng)干，采用刺傷接種的方法，用無菌棉簽涂抹拮抗菌株發(fā)酵上清液于果實(shí)傷口及其周圍果面，涂抹后放入塑料盒置于28 ℃恒溫箱中。24 h后在傷口處涂抹黑斑病菌孢子液（105孢子/mL），接種后放入塑料盒（相對濕度約90%）置于28 ℃恒溫箱，測定拮抗菌株的預(yù)防效果；將黑斑病菌孢子液涂抹于果實(shí)傷口及其周圍，24 h后在傷口處及其周圍涂抹拮抗菌株發(fā)酵上清液，測定拮抗菌株的治療效果。設(shè)10%苯醚甲環(huán)唑1500倍液為藥劑對照，設(shè)無菌水為空白對照，每處理10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。定期測量果實(shí)病斑大小并記錄，計(jì)算病斑抑制率,病斑抑制率(%)＝(對照組病斑大小－處理組病斑大小)/對照組病斑大小×100。

1.5.2 田間防效測定 選用8年生健康琯溪蜜柚樹作為試驗(yàn)植物，在果實(shí)桌球期選取大小一致的果實(shí)進(jìn)行防效測定，接種方法同1.5.1，用無菌棉簽涂抹拮抗菌株發(fā)酵上清液于果實(shí)傷口及其周圍，涂抹后保濕，套上蜜柚專用袋防止其他病、蟲干擾。24 h后在傷口處涂抹黑斑病菌孢子液（105孢子/mL），接種后再套上蜜柚專用袋，7 d后取下，測定拮抗菌株的預(yù)防效果；將黑斑病菌孢子液涂抹于果實(shí)傷口及其周圍，24 h后在傷口處及其周圍涂抹拮抗菌株發(fā)酵上清液，測定拮抗菌株的治療效果。設(shè)10%苯醚甲環(huán)唑1500倍液為藥劑對照，設(shè)無菌水為空白對照，每處理10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。定期測量果實(shí)病斑大小并記錄，計(jì)算病斑抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌的分離及篩選

從蜜柚根際土壤、草莓根際土壤中共分離純化得到培養(yǎng)性狀不同的放線菌 45株。采用平板對峙法對45株放線菌純菌株進(jìn)行琯溪蜜柚黑斑病菌抑制效果的初篩，篩選得到12株放線菌對琯溪蜜柚黑斑病菌的抑菌帶寬度大于5.0 mm用于復(fù)篩（表2），復(fù)篩結(jié)果表明菌株編號為XG40的抑菌效果最好，抑菌帶寬度達(dá)16.3 mm，且能很好抑制病原菌的雙向生長（圖1-B），因此將其作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

圖1 菌株XG40對琯溪蜜柚黑斑病菌的拮抗作用Fig.1 Antagonistic effects of strain XG40 on P.citriasiana

表2 12株放線菌對琯溪蜜柚黑斑病菌菌絲生長的抑制作用Table 2 Inhibiting effect of 12 actinomycete strains against P.citricapa

2.2 菌株XG40的分類鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特征 菌株XG40在高氏一號培養(yǎng)基上生長旺盛，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d，菌落小，中間褶皺，邊緣光滑，易挑起，直徑為0.65～0.70 cm，氣生菌絲豐富，呈紫羅蘭色粉狀，邊緣呈淺灰色，氣生菌絲成熟后形成孢子絲，孢子絲呈淺紫羅蘭色（圖2A，B）。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)氣生菌絲和孢子絲均高度分枝；孢子絲短，開環(huán)、鉤形或松螺旋（圖2C），少數(shù)直線型，時(shí)常不規(guī)則，叢生或單生，孢子絲成熟后形成串珠狀的孢子鏈，孢子鏈發(fā)達(dá)，孢子鏈斷裂后形成圓柱形或近圓柱形的孢子，孢子表面光滑，大小為（0.35～0.60）μm×（0.55～0.85）μm（圖2D）。菌株XG40在8種培養(yǎng)基上均生長良好，無可溶性色素產(chǎn)生，其培養(yǎng)特征見表3。

表3 菌株XG40在8種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 3 Culture characteristics of strain XG40 in 8 media

圖2 菌株XG40的菌落特征及掃描電鏡形態(tài)特征Fig.2 Colony characteristics and morphological characteristics under scanning electron microscope of strain XG40 on Kohl's No.1 medium

2.2.2 生理生化特性 生理生化試驗(yàn)結(jié)果（表 4）表明，菌株XG40可以利用蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、甘油、棉子糖、D-果糖、D-甘露醇、α-半乳糖、肌醇、D-木糖作為碳源生長，不能利用D-阿拉伯糖、鼠李糖。可利用L-賴氨酸、L-組氨酸、天冬酰胺、L-酪氨酸、L-谷氨酸、氯化銨、硝酸鉀作為氮源生長，不能利用L-色氨酸、甘氨酸、精氨酸。能使明膠液化、牛奶凝固而不胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原，不能使纖維素和色氨酸分解，也不能產(chǎn)生H2S和黑色素。綜合該菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，與閻遜初編著[19]的小串鏈霉菌描述對比結(jié)果相符，可以初步將該菌株鑒定為鏈霉菌屬Streptomycessp.。

表4 菌株XG40的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain XG40

2.2.3 分子鑒定 菌株XG40的16S rDNA基因片段測序后得到全長為1454 bp的序列，提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MZ723951，并將該菌株的基因序列進(jìn)行BLAST分析比對，發(fā)現(xiàn)與XG40同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選擇與菌株XG40同源性較高的16個(gè)典型菌株的16S rDNA序列用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，菌株XG40的16S rDNA序列與小串鏈霉菌S.catenulaeFJ486481聚在同一個(gè)分支，與其相似性達(dá)到98.76%。為了更加準(zhǔn)確的鑒定，將擴(kuò)增的recA基因、rpoB基因和gyrB基因片段測序后得到全長分別為570、558和517 bp的序列，提交到GenBank獲得的登錄號分別為OM371085、OM371086、OM371087，經(jīng)同源性比對后發(fā)現(xiàn)，菌株XG40的recA基因序列與小串鏈霉菌FJ406264和小枝鏈霉菌S.ramulosusMF581787聚在一支，如圖4所示，相似性分別達(dá)99.21%和98.07%；rpoB基因序列與小串鏈霉菌FJ406320聚在一支，如圖5所示，相似性達(dá)99.21%；gyrB基因序列與小串鏈霉菌FJ406208聚在一支，如圖6所示，相似性達(dá)99.0%。因此，再結(jié)合菌株XG40的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征，最終將菌株XG40鑒定為小串鏈霉菌。

圖3 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株XG40的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain XG40 based on the sequence of 16S rDNA

圖4 基于recA基因序列構(gòu)建菌株XG40的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain XG40 based on the sequence of recA gene

圖5 基于rpoB基因序列構(gòu)建菌株XG40的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain XG40 based on the sequence of rpoB gene

圖6 基于gyrB基因序列構(gòu)建菌株XG40的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain XG40 based on the sequence of gyrB gene

2.3 菌株XG40的抑菌效果

2.3.1 菌株XG40的抑菌譜 抑菌譜測定結(jié)果（表5）表明，菌株XG40的發(fā)酵液對12種供試病原真菌均有抑制作用，其中對番茄葉霉病菌和蜜柚炭疽病菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)15.0 mm以上；其次是蜜柚黑點(diǎn)病菌，抑菌帶寬度為14.1 mm；對香蕉枯萎病菌、多肉黑斑病菌的抑菌帶寬度分別為11.9和10.1 mm；對辣椒枯萎病菌、草莓根腐病層出鐮刀菌的抑制作用相對較弱，抑菌帶寬度分別為 4.9和 5.2 mm；且菌株XG40對不同病原真菌的抑制作用存在顯著差異。采用牛津杯法測定其發(fā)酵液對2種供試細(xì)菌均能產(chǎn)生一定的抑菌圈，對虎皮蘭葉斑病菌的抑菌圈直徑為32.5 mm，對番茄青枯病菌的抑菌圈直徑為20.3 mm。說明菌株XG40具有良好的廣譜抗菌特性。

表5 菌株XG40發(fā)酵液對14種病原菌的抑菌帶寬Table 5 The inhibiting zones of fermentative liquid of XG40 against 14 pathogens

2.3.2 菌株XG40對黑斑病菌菌絲的影響 在光學(xué)顯微鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，對照菌絲粗細(xì)均勻、細(xì)長而光滑（圖7A）。菌株XG40對黑斑病菌菌絲的生長具有明顯的破壞作用，受抑制菌絲大多數(shù)發(fā)生畸變、粗細(xì)不均勻、頂端膨大、節(jié)間縮短、易斷裂，有菌絲碎屑產(chǎn)生（圖7B）。

圖7 菌株XG40對琯溪蜜柚黑斑病菌菌絲生長的抑制作用Fig.7 Inhibition of strain XG40 on hyphae of P.citriasiana

2.3.3 菌株XG40對黑斑病菌孢子的影響 在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照子囊及子囊孢子清晰，孢子光滑、飽滿（圖8A，B）。菌株XG40發(fā)酵液對黑斑病菌孢子具有明顯的破壞作用，24 h后能看出孢子囊內(nèi)的孢子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了微小的變化，孢子內(nèi)含物開始消解（圖8C），72 h后可以清楚地觀察到孢子內(nèi)含物消解并產(chǎn)生液泡（圖8D）。

圖8 菌株XG40發(fā)酵液對琯溪蜜柚黑斑病菌孢子的影響Fig.8 Inhibition of fermentative liquid of XG40 against conidial of P.citriasiana

2.4 菌株XG40發(fā)酵液對蜜柚黑斑病的防效

2.4.1 室內(nèi)防效 室內(nèi)防效測定結(jié)果（表6）表明，菌株XG40發(fā)酵上清液對蜜柚黑斑病具有較好的預(yù)防效果，對蜜柚黑斑病的病斑抑制率為83.52%，與對照藥劑10%苯醚甲環(huán)唑WG1500倍液無顯著差異；菌株XG40發(fā)酵上清液10倍稀釋液的預(yù)防效果相對較低，其對蜜柚黑斑病的病斑抑制率為66.24%，與對照藥劑10%苯醚甲環(huán)唑WG1500倍液存在顯著差異。治療效果表明，菌株XG40發(fā)酵上清液及其10倍稀釋液對蜜柚黑斑病的病斑抑制率分別為78.87%和56.62%，與對照藥劑10%苯醚甲環(huán)唑WG1500倍液差異顯著。

表6 菌株XG40對琯溪蜜柚黑斑病的防治效果Table 6 Control effects of strain XG40 on P.citriasiana

2.4.2 田間防效 從表6可以看出，菌株XG40發(fā)酵上清液對田間蜜柚黑斑病的病斑擴(kuò)大具有較好的抑制作用，其預(yù)防效果與治療效果分別為78.91%和71.15%，10倍稀釋液的預(yù)防效果與治療效果分別為58.95%和50.62%，說明XG40發(fā)酵上清液能夠起到較好的預(yù)防和控制蜜柚黑斑病發(fā)生的作用。

3 討論

由亞洲柑橘葉點(diǎn)霉引起的黑斑病是嚴(yán)重影響果實(shí)商品價(jià)值和出口創(chuàng)匯的重要病害之一，除了侵染琯溪蜜柚外，該菌還可侵染龍柚、坪山柚、葡萄柚、檸檬等蕓香科植物[20]。目前琯溪蜜柚黑斑病的綜合防治技術(shù)缺乏綠色可持續(xù)控制的有效手段。應(yīng)用生防菌防治植物病害在農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)中潛力巨大，是植物病害防治的發(fā)展趨勢[12]。鏈霉菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)不僅能拮抗植物病原菌的生長，還能促進(jìn)植株生長，已廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治[21]。目前利用鏈霉菌生物防治蜜柚黑斑病的研究未見報(bào)道。本研究采用平板對峙法篩選得到一株拮抗P.citriasiana能力較強(qiáng)的XG40菌株，最終鑒定為小串鏈霉菌S.catenulae。該菌株的發(fā)酵液對供試的14種植物病原真菌和細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用，說明小串鏈霉菌XG40具有廣譜的抑菌活性，可否用于新農(nóng)用抗生素的來源，還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，菌株XG40活菌及其發(fā)酵液產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)均能抑制黑斑病菌的生長，菌株XG40活菌對黑斑病菌菌絲具有較強(qiáng)的破壞作用，能使黑斑病菌菌絲發(fā)生畸變、粗細(xì)不均勻、頂端膨大、節(jié)間縮短、易斷裂；其發(fā)酵液能使黑斑病菌的子囊孢子內(nèi)含物發(fā)生消解，產(chǎn)生水泡。由于抗菌物質(zhì)的分離提取過程比較繁瑣，成本也較高，因此，可以考慮之后的應(yīng)用開發(fā)使用菌株XG40的活體制劑，可以節(jié)省大量花費(fèi)在分離菌株XG40所產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的時(shí)間。我國自產(chǎn)的“5406”細(xì)黃鏈霉菌S.microflavus活體制劑能分泌多種抗生素可抑制不同的植物病原真菌和細(xì)菌生長，且能分泌促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長的激素[22]。菌株XG40的發(fā)酵液對蜜柚炭疽病菌和黑點(diǎn)病菌也具有較強(qiáng)的抑制作用，可為蜜柚病害的生物防治奠定菌種資源。但該菌株中起抗菌活性的物質(zhì)尚未明確，下一步將對該菌株發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)分析。

目前針對小串鏈霉菌主要集中在生物、醫(yī)藥和化學(xué)領(lǐng)域方面的研究。有研究報(bào)道，小串鏈霉菌的發(fā)酵液中可分離純化得到新的氨基酸[23]和纖維抑制素[24,25]，還具有轉(zhuǎn)化生育酚[26]及合成銀納米顆粒[27]的潛力。關(guān)于利用小串鏈霉菌防治植物病害的研究報(bào)道較少。蔣常德等[28]報(bào)道小串鏈霉菌與白長鏈霉菌、彎曲芽孢桿菌、阿耶波多氏芽孢桿菌、短密木霉制成復(fù)合微生物菌肥可用于防治小麥全蝕病。Hoda等[29]從被重金屬污染的玉米根及土壤中篩選得到一株小串鏈霉菌，試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌不僅具有較強(qiáng)耐受重金屬（鋅、錳、鐵）的能力，還能促進(jìn)植株生長，增加植物根系叢枝菌根孢子的數(shù)量，且在植物根際定殖能力強(qiáng)。本研究從植物根際土壤分離得到的小串鏈霉菌XG40菌株，其生長速度快，抑菌活性強(qiáng)。室內(nèi)和田間防效測定結(jié)果表明，菌株XG40的發(fā)酵上清液能顯著控制蜜柚黑斑病病斑的擴(kuò)展，說明該菌株具有良好的應(yīng)用開發(fā)潛力。后續(xù)將對菌株XG40的穩(wěn)定性、發(fā)酵條件優(yōu)化、促進(jìn)植株生長作用及植株根際定殖能力等方面進(jìn)一步研究。