蒲丹丹，李 艷，趙麗紅，張亞林，魏 鋒，馮鴻杰，朱荷琴，顧愛(ài)星，彭 軍,*，馮自力*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000）

棉花是重要的纖維作物之一，作為我國(guó)重要的戰(zhàn)略物資，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和國(guó)防地位。由大麗輪枝菌Verticilliumdahliae引起的棉花黃萎?。–otton Verticillium wilt）是世界范圍內(nèi)重要的土傳病害。該病于1914年在美國(guó)弗吉利亞州首次被發(fā)現(xiàn)[1,2]，隨后，在1935年由美國(guó)傳入我國(guó)，并逐年蔓延擴(kuò)散，尤其是1993年，該病在我國(guó)各棉區(qū)大面積爆發(fā)，達(dá)到267萬(wàn)hm2[3,4]，嚴(yán)重影響我國(guó)棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，成為我國(guó)棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要影響因素[5-7]。目前，輪作倒茬、抗病品種選育以及化學(xué)防治等是防治棉花黃萎病的主要措施。但由于黃萎病微菌核在土壤中存活時(shí)間久，寄主范圍廣，黃萎病致病力變異快，抗病品種不易獲得[8-12]；化學(xué)防治雖然對(duì)棉花黃萎病的防治效果強(qiáng)、穩(wěn)定性高，但對(duì)人畜的安全造成了很大的隱患，對(duì)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展造成了很大的影響[13]。近年來(lái)，生物防治以綠色環(huán)保，不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)勢(shì)被人們關(guān)注并且應(yīng)用于實(shí)踐中[14]。防治棉花黃萎病的生防微生物有很多種，主要包括拮抗細(xì)菌、真菌、放線菌等[13]。

目前，植物病害有效的生物防治措施是將生防菌制成生防菌劑，施入土壤中進(jìn)行植物病害的防治[15]。通常，生防菌劑的制備主要有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種方法，但液體發(fā)酵生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品分生孢子的產(chǎn)量低、產(chǎn)品保質(zhì)時(shí)間短、不方便運(yùn)輸[16]。與液體發(fā)酵相比，固體發(fā)酵具有設(shè)備簡(jiǎn)單、物料成本低、產(chǎn)物加工簡(jiǎn)單且環(huán)保、易儲(chǔ)存、方便運(yùn)輸、分生孢子量高等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，有關(guān)生防菌的固體發(fā)酵優(yōu)化報(bào)道較多，汪軍等[17]利用玉米粉、甘蔗渣、麩皮和殼聚糖為主要成分進(jìn)行固體發(fā)酵淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus，產(chǎn)孢量最大可達(dá)8.22×1010CFU/g。Brand等[18]利用甘蔗渣分別與脫脂大豆餅和咖啡殼組合培養(yǎng)淡紫擬青霉產(chǎn)孢量最大達(dá)1.53×1010CFU/g。谷軍等[19]通過(guò)研究固體發(fā)酵過(guò)程，得出玉米粉作用顯著，能顯著提高淡紫擬青霉的分生孢子數(shù)，可達(dá)到1.31×1010CFU/g。盧智琴等[15]通過(guò)對(duì)發(fā)酵底物、發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到AT9最佳發(fā)酵基質(zhì)為麥麩、玉米粉、玉米秸稈粉按2:1:3質(zhì)量比；最佳碳源、氮源與無(wú)機(jī)鹽比例為4%葡萄糖、6%硝酸鉀、2%碳酸鈣；固料:水為1:1.2；20%的接種量，32 ℃黑暗條件培養(yǎng)8 d為最佳發(fā)酵條件。

簡(jiǎn)青霉PenicilliumsimplicissimumCEF-818是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花病害防控團(tuán)隊(duì)從健康的棉花植株中分離獲得，屬于青霉屬的叉狀亞屬，可在 PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌落表面呈淡灰綠色，分生孢子呈圓形或橢圓形。該菌株可置于30%的甘油中，-80 ℃溫度下長(zhǎng)期保存。簡(jiǎn)青霉CEF-818非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)大麗輪枝菌的抑制率為100%[20]；王玲飛[21]通過(guò)溫室和病圃試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CEF-818對(duì)棉花黃萎病的有顯著的防治效果。Yuan等[22]發(fā)現(xiàn)CEF-818可誘導(dǎo)棉花中防御相關(guān)基因PAL、PPO和POD的上調(diào)表達(dá)。和生產(chǎn)上應(yīng)用較多的枯草芽孢桿菌相比，防治效果提高25.1%左右[20]。因此，簡(jiǎn)青霉CEF-818在棉花黃萎病的生物防治上具有巨大的潛力。

目前，對(duì)簡(jiǎn)青霉 CEF-818固體發(fā)酵優(yōu)化的研究還未見有報(bào)道。因此，本研究旨在對(duì)簡(jiǎn)青霉 CEF-818固體發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件進(jìn)行篩選，以期得到該生防菌最佳的固體發(fā)酵工藝，為簡(jiǎn)青霉CEF-818生防菌劑的規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：內(nèi)生真菌簡(jiǎn)青霉Penicilliumsimplicissimum（CGMCC No.8320）CEF-818，由本實(shí)驗(yàn)室保藏（分離自健康的棉花植株）。

試劑：葡萄糖、蔗糖、氯化銨、氯化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR），淀粉、麥芽糖、乳糖、牛肉膏等均為生化試劑（BR）。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂1.5 g/L，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose，PDB）：同PDA培養(yǎng)基，但不加瓊脂，pH自然。

1.2 菌株的活化和固體發(fā)酵種子液的制備

利用PDA培養(yǎng)基對(duì)CEF-818進(jìn)行活化，挑取活化好的CEF-818菌餅，置入PDB液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)7 d，得到種子液，備用。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)物篩選

分別選取玉米芯、玉米糝、米糠、小米糠、小麥粒、油菜莖稈、玉米莖稈、大豆粉、黃豆粉、麥麩10種物料，稱取30 g，按料水比1:1加入無(wú)菌水，混合均勻后裝入200 mL培養(yǎng)瓶中，121 ℃下滅菌30 min，待冷卻后，按照10%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.4 不同液體接種量對(duì)產(chǎn)孢量的影響

選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，將無(wú)菌水按料水比1:1添加至培養(yǎng)物中并混合均勻，按照1.3中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌，然后按3%、5%、10%、15%、20%、25%和30%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.5 不同物料厚度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，將無(wú)菌水按料水比1:1添加至培養(yǎng)物中并混合均勻，將物料設(shè)置1、2、3、4和5 cm不同的厚度，裝入200 mL的培養(yǎng)瓶中，然后參照1.3中的方法進(jìn)行滅菌后，按5%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響

選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，將無(wú)菌水按料水比1:1添加至培養(yǎng)物中并混合均勻，按照1.3中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌，按5%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、4、5、6、7、8和9 d天后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.7 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，將無(wú)菌水按料水比1:1添加至培養(yǎng)物中并混合均勻，按照1.3中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌，按5%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后分別放置在25 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)暗培養(yǎng)7 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.8 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)孢量的影響

選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，將無(wú)菌水的pH依次調(diào)至為3、5、7、9和11，將無(wú)菌水按料水比1:1添加至培養(yǎng)物中并混合均勻，按1.3中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌后，按5%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)7 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.9 固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成單因素試驗(yàn)

1.9.1 料水比對(duì)產(chǎn)孢量的影響 選擇麥麩為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，設(shè)置料水比為1:0.4、1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2和1:1.4，將物料裝入200 mL的培養(yǎng)瓶中，使物料厚度為2 cm，121 ℃下滅菌30 min，待冷卻后，按照5%（V/M）的接種量接入種子液，并攪拌至與物料混勻后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.9.2 不同種類速效碳源及添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響 選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，按料水比 1:0.6加入無(wú)菌水，分別以蔗糖、葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖和D-甘露醇為碳源，按占培養(yǎng)物濕料重4%（M/M）的添加量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)物中并混合均勻，設(shè)無(wú)添加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照，按照 1.9.1中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、接種，培養(yǎng)5 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

速效碳源添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響：選擇麥麩為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，按料水比 1:0.6加入無(wú)菌水，分別添加濃度為0、1%、2%、3%、4%、5%和6%（M/M）的葡萄糖至基礎(chǔ)培養(yǎng)物中并混合均勻，按照1.9.1中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、接種，培養(yǎng)5 d天后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.9.3 不同種類氮源及添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響 選擇麥麩為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，按料水比 1:0.6加入無(wú)菌水，分別以尿素、硝酸鉀、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏和硝酸銨為氮源，按占培養(yǎng)基濕重0.5%（M/M）的添加量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)物中并混合均勻，設(shè)無(wú)添加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照，按照 1.9.1中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、接種，培養(yǎng)5 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

氮源添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響：選擇麥麩為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，按照料水比1:0.6加入無(wú)菌水，分別添加濃度為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、1.2%和1.4%（M/M）的尿素至基礎(chǔ)培養(yǎng)物中并混合均勻后，按照1.9.1中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、接種，培養(yǎng)5 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.9.4 不同種類無(wú)機(jī)鹽及添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響 選擇麥麩作為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，按料水比1:0.6加入無(wú)菌水，分別以MnSO4、NaCl、ZnSO4、KCl、CuSO4、Ca(H2PO4)2和KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽，按占培養(yǎng)物濕重1%（M/M）的添加量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)物中并混合均勻，設(shè)無(wú)添加無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照，按照 1.9.1中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、接種，培養(yǎng)5 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響：選擇麥麩為基礎(chǔ)培養(yǎng)物，按 1:0.6料水比加入無(wú)菌水，分別添加濃度為0、0.05%、0.35%、0.65%、0.95%、1.25%和1.55%（M/M）的KCl至基礎(chǔ)培養(yǎng)物中并混合均勻后，按照1.9.1中的方法，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、接種，培養(yǎng)5 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.10 固體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)對(duì)碳源添加量、氮源添加量、無(wú)機(jī)鹽添加量、料水比單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，7 d后采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)，以產(chǎn)孢量為指標(biāo)，共有9組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。正交表見表1。

表1 培養(yǎng)基組成正交因子水平表Table 1 Levels orthogonal experiment factors table

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel、SPSS 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)物篩選

固體發(fā)酵培養(yǎng)物初篩結(jié)果表明，培養(yǎng)物為麥麩時(shí)，分生孢子產(chǎn)量為17.8×108CFU/g，顯著高于其他原料；其次為小米糠和黃豆粉，分生孢子產(chǎn)量分別為10.6×108和6.83×108CFU/g。因此，選擇麥麩為簡(jiǎn)青霉CEF-818為固體發(fā)酵培養(yǎng)物（圖1）。

圖1 不同發(fā)酵培養(yǎng)物基對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effects of different basic medium on spores production of P.simplicissimum CEF-818

2.2 不同液體接種量對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在一定范圍內(nèi)，簡(jiǎn)青霉CEF-818的分生孢子量隨著種子液接種量的增加而增加，當(dāng)接種量達(dá)到5%（V/M）時(shí)，其分生孢子產(chǎn)量顯著高于其他接種量，為1.87×109CFU/g。然而，隨著接種量的繼續(xù)增加，其分生孢子產(chǎn)量逐漸減少。因此，簡(jiǎn)青霉CEF-818發(fā)酵最適液體接種量為5%（V/M）（圖2）。

圖2 不同液體接種量對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Fig.2 The effects of different liquid inoculation quantity on spores production of P.simplicissimum CEF-818

2.3 不同物料厚度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

物料厚度對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818分生孢子產(chǎn)量有很大的影響，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)物料厚度為2 cm時(shí)，簡(jiǎn)青霉CEF-818的分生孢子產(chǎn)量達(dá)到最高值，為2.68×109CFU/g，且與其他處理組差異顯著（P＜0.05）。但隨著物料厚度的繼續(xù)增加，其分生孢子產(chǎn)量逐漸減少。因此，簡(jiǎn)青霉CEF-818發(fā)酵最適宜的物料厚度為2 cm（圖3）。

圖3 不同物料厚度對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Fig.3 The effects of different materal thickness on spores production of P.simplicissimum CEF-818

2.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在簡(jiǎn)青霉CEF-818發(fā)酵前期，主要以生長(zhǎng)白色菌絲為主，從第4 d開始，分生孢子數(shù)顯著增加；發(fā)酵培養(yǎng)7 d，分生孢子數(shù)達(dá)到最大值，7～9 d分生孢子數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。因此，選擇7 d為簡(jiǎn)青霉CEF-818的發(fā)酵周期（圖4）。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Fig.4 The effects of different culture time on spores production of P.simplicissimum CEF-818

2.5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

溫度對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響較大，在一定溫度范圍內(nèi)，分生孢子的量隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時(shí)，簡(jiǎn)青霉CEF-818分生孢子產(chǎn)量最高，為35.41×108CFU/g，與其他溫度差異顯著（P＜0.05）。但隨著溫度的繼續(xù)升高，其分生孢子產(chǎn)量逐漸減少（圖5）。因此，28 ℃為簡(jiǎn)青霉CEF-818的最適發(fā)酵溫度。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Fig.5 The effects of different culture temperature on spores production of P.simplicissimum CEF-818

2.6 不同起始pH水平對(duì)產(chǎn)孢量的影響

pH是影響菌體正常生長(zhǎng)、繁殖和代謝的重要因子之一。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在初始pH為3和13時(shí)，簡(jiǎn)青霉CEF-818的產(chǎn)孢量最低，當(dāng)初始pH為7時(shí)，其產(chǎn)孢量為6.25×109CFU/g，顯著高于其他處理（P＜0.05）（圖6）。

圖6 不同pH水平對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Fig.6 The effects of different pH levels on spores production of P.simplicissimum CEF-818

2.7 固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

2.7.1 料水比對(duì)產(chǎn)孢量的影響 培養(yǎng)基中水分的含量對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818的產(chǎn)孢量有很大的影響。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料水比為1:0.6時(shí)，產(chǎn)孢量達(dá)到最高，為28.67×108CFU/g，與其他處理組差異顯著（P＜0.05）。然后，CEF-818的產(chǎn)孢量隨著料水比比值降低而減少。因此，料水比為 1:0.6時(shí)物料的通氣性達(dá)到最佳，最有利于分生孢子的產(chǎn)生（圖7）。

2.7.2 不同種類的速效碳源及添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)物麥麩中添加不同種類的碳源能夠提高簡(jiǎn)青霉CEF-818的產(chǎn)孢量。當(dāng)添加速效碳源為葡萄糖糖時(shí)，分生孢子數(shù)為2.17×109CFU/g，顯著高于其他碳源和對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜的葡萄糖添加量能夠有效的促進(jìn)簡(jiǎn)青霉CEF-818的產(chǎn)孢，當(dāng)葡萄糖的添加量為2%（M/M）時(shí)，分生孢子數(shù)為1.66×109CFU/g，顯著高于其他添加量（P＜0.05）。因此最適宜簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖，其添加量為2%（表2）。

2.7.3 不同種類的氮源及添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)物麥麩中添加不同種類的氮源能夠提高簡(jiǎn)青霉CEF-818的產(chǎn)孢量。當(dāng)添加氮源為尿素時(shí)，分生孢子產(chǎn)量為9.0×108CFU/g，顯著高于其他氮源和對(duì)照組（P＜0.05）。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，適量的添加尿素，能夠有效的提高簡(jiǎn)青霉CEF-818菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量，當(dāng)尿素的添加量為0.6%（M/M）時(shí)，分生孢子數(shù)為3.02×109CFU/g，顯著高于其他添加量（P＜0.05）。因此最適宜簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢的氮源為尿素，其添加量為0.6%（M/M）（表3）。

表3 不同速效氮源及添加量對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Table 3 Effect of different quick-acting nitrogen sources and additions on the production of spores in P.simplicissimum CEF-818

2.7.4 不同種類的無(wú)機(jī)鹽及添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)物麥麩中添加不同種類的無(wú)機(jī)鹽對(duì)簡(jiǎn)青霉 CEF-818菌絲的生長(zhǎng)和分生孢子的產(chǎn)生有不同的影響。當(dāng)添加無(wú)機(jī)鹽為氯化鉀時(shí)，分生孢子數(shù)為 28.1×108CFU/g，顯著高于其他無(wú)機(jī)鹽和對(duì)照組（P＜0.05）。當(dāng)KCI的添加量為0.65%（M/M）時(shí)，分生孢子數(shù)為2.66×109CFU/g，顯著高于其他添加量（P＜0.05）。因此最適宜簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢的無(wú)機(jī)鹽為KCl，其添加量為0.65%（M/M）（表4）。

表4 不同速效無(wú)機(jī)鹽及添加量對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響Table 4 Effect of different quick-acting inorganic salts and additions on the production of spores of simple P.simplicissimum CEF-818

2.7.5 發(fā)酵培養(yǎng)基組成正交試驗(yàn) 由正交試驗(yàn)可得，CEF-818固體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為處理 1（A3B2C3D1），即葡萄糖添加量為2.5%（M/M），尿素的添加量為0.6%（M/M），氯化鉀的添加量為0.6%（M/M），料水比為1:0.5，所產(chǎn)分生孢子數(shù)最高，為8.28×109CFU/g。根據(jù)極差分析得到影響CEF-818產(chǎn)孢量的主次因子為：KCl添加量＞料水比＞尿素添加量＞葡萄糖添加量，其中KCl添加量、料水比、尿素添加量對(duì)產(chǎn)孢量的影響較大（表5）。因此，在生產(chǎn)過(guò)程中，要嚴(yán)格把控這三者的量。

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental results of fermentation medium

3 討論

固體發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化是微生物發(fā)酵成產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的重要影響因素之一，微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累受多種因素的影響，如培養(yǎng)基組成、生長(zhǎng)因子等[23]。目前，微生物發(fā)酵培養(yǎng)物的選擇大多為農(nóng)副產(chǎn)品，在這些原材料供應(yīng)穩(wěn)定且價(jià)格低廉，同時(shí)能為微生物的發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究在篩選發(fā)酵培養(yǎng)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，麥麩較適宜簡(jiǎn)青霉 CEF-818的生長(zhǎng)及產(chǎn)孢。易征璇等[24]在對(duì)康氏木霉Koningiitrichoderma進(jìn)行固體發(fā)酵工藝優(yōu)化中，也發(fā)現(xiàn)其最佳的培養(yǎng)物為麥麩；劉世祥等[25]對(duì)生防菌深色木霉Trichoderma atrovirideAT-9的固體發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后該生防菌株發(fā)酵培養(yǎng)物組成為麥麩30%、谷殼20%；由此可見，麥麩可為部分微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。目前，在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、麥麩、米糠等是常用的碳源，添加速效碳源葡萄糖有利于簡(jiǎn)青霉CEF-818菌絲的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)孢量。楊英歌等[26]在進(jìn)行豆粕固體發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶條件的優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)添加 1.5%的葡萄糖有利于菌體生長(zhǎng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，適量的尿素顯著促進(jìn)了CEF-818菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量提高，而過(guò)多的尿素添加量對(duì)產(chǎn)孢量起到抑制作用。周蓮等[16]也發(fā)現(xiàn)添加適量的尿素能夠顯著促進(jìn)淡紫擬青霉M-1菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。速效無(wú)機(jī)鹽也是菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響因素之一，本研究發(fā)現(xiàn)，0.6%（M/M）的KCl，能夠顯著促進(jìn)CEF-818菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。陳鑫[27]在發(fā)酵優(yōu)化枯草芽胞桿菌BacillussubtilisHAINUP4，篩選到最佳無(wú)機(jī)鹽為KCl，添加量為0.1%。物料中的含水量對(duì)菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量有很大的影響，料水比過(guò)低，物料中含水量過(guò)大，容易造成在發(fā)酵過(guò)程中物料結(jié)塊，通氣性不足，從而影響簡(jiǎn)青霉CEF-818的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。而料水比過(guò)高，物料中含水量小，則抑制了簡(jiǎn)青霉CEF-818的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量。

菌株發(fā)酵不僅受培養(yǎng)基質(zhì)的影響，發(fā)酵條件也是影響發(fā)酵很重要的因素[28]，溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖最重要的因素之一。因?yàn)闇囟冗^(guò)高，會(huì)破壞微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性，嚴(yán)重抑制微生物的正常的生長(zhǎng)，且微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在過(guò)高的溫度下容易發(fā)生凝固或者變性，最終，會(huì)造成微生物細(xì)胞的死亡；而過(guò)低的溫度，會(huì)嚴(yán)重抑制微生物的生長(zhǎng)[29]。因此，在微生物的發(fā)酵生產(chǎn)中，需要保證適宜的發(fā)酵溫度，本研究結(jié)果表明，簡(jiǎn)青霉CEF-818的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃；發(fā)酵時(shí)間對(duì)微生物的生長(zhǎng)也有很大的影響，固體發(fā)酵周期普遍為3～10 d，周蓮等[19]的研究結(jié)果表明，淡紫擬青霉最佳發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵周期為7 d；易征璇等[24]的研究結(jié)果表明，康氏木霉的最佳酵溫度為28 ℃、發(fā)酵周期為7 d，與本研究結(jié)果一致。在本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)液體接種量達(dá)到最適接種量后，繼續(xù)增大接種量后簡(jiǎn)青霉CEF-818的產(chǎn)孢量顯著減少，原因可能為當(dāng)液體菌種量接種過(guò)多時(shí)，液體菌種積累了次代謝產(chǎn)物，過(guò)多的代謝產(chǎn)物可能會(huì)影響產(chǎn)孢，這與王亞嬌等的研究結(jié)果一致[28]。

本研究對(duì)該生防菌的工業(yè)化實(shí)際生產(chǎn)具有一定的參考意義，但在進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化過(guò)程中，并未對(duì)不同因子間相互作用對(duì)簡(jiǎn)青霉CEF-818產(chǎn)孢量的影響作進(jìn)一步的深入研究，且研究還處于實(shí)驗(yàn)室階段，未作進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)分析，這些問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究探討。