秦婉琳，馬永遠(yuǎn)，李雙燕，伍 燕

（興義民族師范學(xué)院，貴州興義 562400）

黑柄乳菇（Lactarius gerardii）又名茅草菌，隸屬傘菌目（Agaricales）紅菇科（Russulaceae）乳菇屬(Lactarius)，菌蓋和菌柄呈黑褐色，菌褶白色延伸至菌柄，菌肉白色、質(zhì)脆，受傷后會(huì)溢出白色乳漿，因此又叫黑蓋奶漿菌；夏季多生長(zhǎng)在針闊混交林地上，是一種美味的野生菌[1]。圖1（參見封三）為野生黑柄乳菇子實(shí)體，采集地點(diǎn)為興義市萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園松林下。乳菇屬在貴州比較常見，例如松乳菇（紫花菌）、多汁乳菇、紅汁乳菇、靚麗乳菇等[2-3]。近年研究表明，通過人工合成松乳菇菌體并接種到天然馬尾松林下，能得到松乳菇子實(shí)體[4-9]。松乳菇營(yíng)養(yǎng)豐富，含多種氨基酸和微量元素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[10-15]，松乳菇的栽培成功對(duì)開發(fā)利用黔西南地區(qū)的黑柄乳菇具有參考價(jià)值。

圖1 黑柄乳菇子實(shí)體

菌塘（Shiro）是由子實(shí)體的根部菌絲、宿主根系及周圍的腐殖質(zhì)土壤扭結(jié)形成的顆粒狀結(jié)構(gòu)，是真菌菌絲體萌發(fā)和形成子實(shí)體的重要條件[16-17]。深入研究菌塘，對(duì)于開發(fā)人工馴化技術(shù)，了解菇類栽培土壤細(xì)菌群的組成及豐度非常重要。本文以黔西南州的野生黑柄乳菇菌塘土壤為研究對(duì)象，高通量測(cè)序菌塘菌群后采用統(tǒng)計(jì)聚類的方法確定不同樣本優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)的分型，旨在探究黑柄乳菇生境土壤微生物群落特征，找出優(yōu)勢(shì)菌群、分析共性并得出規(guī)律性認(rèn)識(shí)，為下一步研發(fā)黑柄乳菇的人工栽培技術(shù)奠定一些基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

選取黑柄乳菇出產(chǎn)豐富的五個(gè)采集點(diǎn)：興義市萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園（WT）、安龍縣新橋鎮(zhèn)（XQ）、安龍縣海子鎮(zhèn)（HZ）、安龍縣平樂鎮(zhèn)（PL）、安龍縣龍廣鎮(zhèn)（LG）。每個(gè)地點(diǎn)選取黑柄乳菇成簇生長(zhǎng)的菌塘，在距菌根2 cm半徑周圍處取土樣，混合后放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2 藥品及試劑

Qubit3.0 DNA 檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Life公司；E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒，美國(guó)OMEGA 公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物技術(shù)公司；MagicPure Size Selection DNA Beads，北京全式金生物技術(shù)公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Pico-21 臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)賽默飛公司；Bio-Rad PCR 擴(kuò)增儀、凝膠成像儀，美國(guó)伯樂公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計(jì)，美國(guó)英杰生物技術(shù)公司；DYCZ-21電泳槽、DYY-6C型電泳儀電源，北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取200 mg土樣，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL PBS 緩沖液混勻，10 000 rpm 室溫離心3 min，棄上清，樣品干燥待用。

1.3.2 總DNA提取和檢測(cè)

按照OMEGA 試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit 使用說明操作提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

宏基因組測(cè)序類群為細(xì)菌；擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榧?xì)菌V3～V4變區(qū)，引物1為341F:CCTACGGGNGGCWGCAG，引物2 為805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC，測(cè)序平臺(tái)為Miseq，由生工生物工程(上海)公司完成。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序序列（reads）通過拼接、過濾、去除嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列，進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Unit）聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU 聚類分析結(jié)果，對(duì)OTU 進(jìn)行多樣性指數(shù)分析、多樣性的群落組成分析，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育信息進(jìn)行Beta 多樣性分析、分組檢驗(yàn)分析、差異顯著性檢驗(yàn)、環(huán)境因子分析等深入的統(tǒng)計(jì)學(xué)和可視化擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌塘Alpha多樣性指數(shù)分析

表1 為各個(gè)菌塘土壤高通量測(cè)序數(shù)據(jù)Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果，可以反映所測(cè)微生物群落的豐度和多樣性。由表可知，五個(gè)菌塘土樣測(cè)序共得到140 903條有效序列，過濾后得到4 385 個(gè)有效OTU，樣品的Coverage 指數(shù)≥0.99，覆蓋率高，能真實(shí)反映樣品的測(cè)序情況。

表1 菌塘土壤中細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析

樣品的ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)反映群落分布豐度（Communit richness），數(shù)值越大說明樣本的菌群分布豐度越好；Shannoneven 指數(shù)越高或Simpson 指數(shù)越低，說明采樣點(diǎn)的菌群多樣性較豐富。從表1 可以看出，龍廣（LG）菌落較豐富、多樣性較好。

圖2為五個(gè)菌塘菌群樣品的稀釋曲線，Shannon指數(shù)先呈直線上升，后趨向平穩(wěn)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)能較好地覆蓋菌塘中菌群的信息序列，曲線在平滑穩(wěn)定后產(chǎn)出的OTU 數(shù)趨于穩(wěn)定，其中來自海子（HZ）的樣品Shannon 指數(shù)稍低，說明該采集地的細(xì)菌多樣性低于其余四個(gè)菌塘。

圖2 五個(gè)菌塘中菌群的稀釋曲線

2.2 各樣品中細(xì)菌類群的相關(guān)性分析

圖3（參見封三）為五個(gè)菌塘菌群基于OTU 序列所作的聚類樹，可以看出HZ 和PL 聚成一類，并和LG、XQ 位于同一簇上，WT位于較遠(yuǎn)分支，直觀反映了各個(gè)菌塘菌群的相似性和差異關(guān)系。

圖3 樣品OUT數(shù)的聚 類樹

圖4（參見封三）的韋恩圖為各個(gè)菌塘菌群間OTU 關(guān)聯(lián)分析，反映了各自生境中土壤菌群的復(fù)雜性和共性。五個(gè)菌塘共有的OTU 數(shù)是471 個(gè)，各個(gè)菌塘菌群互有重疊，反映的是菌塘間的共性；不重疊部分除了萬屯（WT）較多，有104個(gè)OTU外，其余菌塘均較少。除了萬屯（WT）位于生態(tài)公園內(nèi)，人類活動(dòng)影響較小之外，其余四個(gè)采集地都在安龍縣農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)。數(shù)據(jù)分析結(jié)果直觀反映出各菌塘土壤基質(zhì)微生物種類相似性和差異性。

圖4 各個(gè)菌塘菌群多樣性的關(guān)聯(lián)分析

2.3 菌塘中細(xì)菌組成分析

五個(gè)菌塘細(xì)菌菌群歸屬于9 個(gè)門，即變形菌門（Proteobacteria，68.88%～43.97%）、酸桿菌門（Acidobacteria，30.24%～10.33%）、放線菌門（Actinobacteria，15.70%～4.78%）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、candidate_division_WPS-1、綠彎菌門（Chloroflexi）和candidate_division_WPS-2，從圖5（參見封三）中可知，以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主。

圖5 不同菌塘門水平分類豐度統(tǒng)計(jì)

由圖6（參見封三）可見，各菌塘在屬級(jí)水平上比較豐度，有27個(gè)屬，平樂（PL）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，7.52%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，5.89%）、Gp1（7.02%）；萬 屯（WT）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，6.35%）、根瘤菌屬（Rhizobium，5.6%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.55%）；新橋（XQ）菌塘主要的屬有伯克氏菌屬（Burkholderia，9.53%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，5.67%）、Gp1（4.39%）；海子（HZ）菌塘主要的屬有Gp1（10.24%）、Gp2（9.5%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，8.86%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，6.54%）；龍廣（LG）菌塘主要的屬有緩生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，6.51%）、Gp2（4.72%）、Gp1（4.16%）。

圖6 不同菌塘屬水平分類豐度統(tǒng)計(jì)

結(jié)合各個(gè)菌塘門、屬水平統(tǒng)計(jì)及表2 所列前幾種優(yōu)勢(shì)屬可知，各個(gè)菌塘中的優(yōu)勢(shì)菌門和屬均是變形菌門及其下屬，這些菌群能起到固氮及吸收轉(zhuǎn)化磷、鉀等無機(jī)鹽的作用，并與黑柄乳菇菌絲、土壤腐殖質(zhì)等扭結(jié)形成菌根菌共生體，外部表現(xiàn)為根瘤形態(tài)。同時(shí)注意到各個(gè)菌塘的酸桿菌門及酸桿菌屬Gp1、Gp2 和Gp3 含量較高，通常認(rèn)為這些菌增多可對(duì)被污染土壤進(jìn)行修復(fù)。

表2 五個(gè)樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬及其相對(duì)豐度

3 結(jié)論

采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)黔西南州的野生黑柄乳菇五個(gè)菌塘進(jìn)行分析，對(duì)菌群的組成和豐度形成了一個(gè)規(guī)律性的認(rèn)識(shí)。各個(gè)菌塘中以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門為主，菌群的組成類型變化不大但豐度上有區(qū)別，例如萬屯（WT）菌塘變形菌門豐度達(dá)到68.88%，龍廣（LG）菌塘變形菌門豐度為43.97%；海子（HZ）菌塘酸桿菌門豐度為30.24%，萬屯（WT）菌塘酸桿菌門豐度為10.33%。采樣點(diǎn)萬屯鎮(zhèn)云屯生態(tài)公園環(huán)境保護(hù)相對(duì)較好，土壤有機(jī)質(zhì)豐富，黑柄乳菇生活的菌塘中以固氮和轉(zhuǎn)化磷、鉀元素為主的變形菌門居多[18-19]；海子鎮(zhèn)是安龍縣糧食主產(chǎn)區(qū)，自然環(huán)境受人類生產(chǎn)活動(dòng)影響較大，與萬屯相比酸桿菌門豐度較高（通常認(rèn)為在人類生產(chǎn)活動(dòng)較多的環(huán)境，例如過度施肥、噴施農(nóng)藥等會(huì)引起土壤中酸桿菌屬含量升高）。酸桿菌門的Gp1、Gp2、Gp3能降低土壤中的重金屬和農(nóng)藥污染[20]，有助于恢復(fù)土壤生態(tài)。

乳菇作為貴州食用菌“黔菌”品牌重點(diǎn)打造的項(xiàng)目之一，其中的松乳菇已有少量人工栽培，但遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要。興義野生黑柄乳菇在當(dāng)?shù)爻霎a(chǎn)豐富，味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛，市場(chǎng)價(jià)格也在逐年攀升。對(duì)黑柄乳菇的菌塘菌群組成和豐度開展研究，進(jìn)行深入了解，對(duì)下一步做“精”、做“特”食用菌產(chǎn)業(yè)具有理論指導(dǎo)意義。通過本次分析，發(fā)現(xiàn)生境中的酸桿菌門菌群較豐富，說明人類在野生菌產(chǎn)出區(qū)域活動(dòng)過于頻繁，對(duì)土壤的理化性質(zhì)已造成影響，提醒我們注意保護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境，保護(hù)野生黑柄乳菇及其他野生食用菌的可持續(xù)生長(zhǎng)和出產(chǎn)品質(zhì)。