楊凱，楊明，蘇學(xué)會(huì)，溫輝，單娜

(秦皇島市第二醫(yī)院 呼吸科，河北 秦皇島 066600)

原發(fā)性肺癌(簡(jiǎn)稱肺癌)是全世界發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-2]，占癌癥相關(guān)死亡人數(shù)近五分之一[3]。按照病理形態(tài)的不同，肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌(non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC最為常見，約占肺癌總發(fā)病率的80%，此類患者總體預(yù)后較差[4]。NSCLC的腫瘤標(biāo)志物主要有癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、糖類抗原125、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag)等蛋白[5-6]，但目前在臨床上僅對(duì)不到百分之一的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了相關(guān)研究，絕大部分腫瘤標(biāo)志物目前還未進(jìn)行系統(tǒng)的臨床驗(yàn)證。所以，進(jìn)一步篩選出靈敏度高、特異性高的新型標(biāo)志物，可以幫助醫(yī)生在第一時(shí)間掌握病人的病情，為盡早治療奠定良好基礎(chǔ)[7-10]。隨著大數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，腫瘤相關(guān)的組學(xué)數(shù)據(jù)不斷累積、更新，為科研人員研究腫瘤發(fā)病機(jī)制、醫(yī)生臨床診治提供了數(shù)據(jù)支持[11-12]。本研究首選通過基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)和腫瘤基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出NSCLC中的差異表達(dá)基因，對(duì)100例NSCLC臨床樣本行進(jìn)一步驗(yàn)證分析，以期找到肺癌的新型預(yù)后標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 差異基因、核心基因的篩選與分析

1.1.1數(shù)據(jù)收集及差異基因的篩選 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇GSE19804芯片數(shù)據(jù)，分為NSCLC組織和癌旁組織，每組各60個(gè)樣本，該數(shù)據(jù)由Lu等[13]提供。利用R語言中“l(fā)imma”以及“impute”包對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，進(jìn)行貝葉斯顯著性檢驗(yàn)，以LogFC(Fold Change)絕對(duì)值>1且P<0.01作為顯著性差異表達(dá)，對(duì)差異基因進(jìn)行聚類分析、制作熱圖。

1.1.2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選 利用STRING網(wǎng)站(http//string-db.org/)，以medium confidence>0.4為條件構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape軟件中CentiScape和MCODE插件，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，分析基因網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接度，得到連接度較高的關(guān)鍵基因。

1.1.3核心基因與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系分析 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，通過Firehose網(wǎng)站和cBioPortal腫瘤基因組網(wǎng)站下載數(shù)據(jù)，保留其中含有完整臨床數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)的994例NSCLC患者腫瘤組織樣本和301例NSCLC患者癌旁組織樣本所對(duì)應(yīng)的臨床病理數(shù)據(jù)以及預(yù)后數(shù)據(jù)，分析核心基因與臨床NSCLC患者生存期的關(guān)系，核心基因在男性NSCLC患者和女性NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平差異，核心基因在NSCLC患者腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)水平差異，以及核心基因與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[增殖標(biāo)志蛋白Ki-67基因(proliferation marker protein Ki-67 gene,MKI67)、轉(zhuǎn)移標(biāo)志蛋白波形蛋白基因(vimentin gene,VIM)]表達(dá)水平的關(guān)系。

1.2 檢測(cè)核心基因相關(guān)蛋白的表達(dá)

1.2.1材料、主要試劑與儀器 NSCLC患者腫瘤組織和相應(yīng)癌旁組織由課題組前期收集；CAV1蛋白抗體、二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，正置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2.2分組 收集100例NSCLC患者，分為NSCLC組織組和癌旁組織組，男53例、女47例，年齡31～75歲、平均(58.94±12.06)歲，肺腺癌64例、肺鱗癌36例。本研究獲得病人及家屬知情同意，且符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參照NSCLC的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)首次確診;(3)經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)證實(shí)為NSCLC;(4)預(yù)計(jì)生存時(shí)間超過3個(gè)月;(5)入院前未接受過相關(guān)抗腫瘤治療;(6)無其他重要臟器功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并腦轉(zhuǎn)移;(2)病灶無法測(cè)量者;(3)妊娠期或哺乳期女性;(4)先前有或繼發(fā)性惡性腫瘤;(5)曾接受過放化療或免疫治療；(6)有精神病史;(7)合并血液系統(tǒng)疾病。

1.2.3檢測(cè)Caveolin1表達(dá) 取兩組組織標(biāo)本，經(jīng)石蠟包埋、切片(厚度<5 μm，長(zhǎng)度<10 μm)、固定、漂洗、脫水、透明、透蠟、包埋、整修、切片(厚度4 μm)，利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小窩蛋白1(Caveolin1)的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選

利用R語言中“l(fā)imma”安裝包對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，以|LogFC|>1且P<0.01為篩選閾值，在NSCLC組織和癌旁組織中共篩選出256個(gè)差異基因，其中上調(diào)的基因有206個(gè)，下調(diào)的基因有50個(gè)，見圖1。

注：A為差異基因火山圖；B為差異基因聚類熱圖，紅色點(diǎn)代表高表達(dá)的基因、藍(lán)色點(diǎn)代表低表達(dá)的基因。圖1 NSCLC組織和癌旁組織的差異基因分析Fig.1 Differential gene analysis of normal tissues and lung cancer tissues

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

PPI圖中共有102個(gè)節(jié)點(diǎn)，連接線198個(gè)，見圖2。通過Cytoscape軟件中的CentiScape和MCODE插件進(jìn)行分析，得到其中連通度最高的14個(gè)基因，分別是白細(xì)胞介素6基因(interleukin-6 gene,IL6)、α1-Ⅰ型膠原基因(alpha-1 type Ⅰ collagen gene,COL1A1)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白γ11基因(guanine nucleotide-binding protein gamma-11 gene,GNG11)、富亮氨酸重復(fù)激酶2基因(leucine-rich repeat kinase 2 gene,LRRK2)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α基因(topoisomerase Ⅱ alpha gene,TOP2A)、鈣黏蛋白5基因(cadherin-5 gene,CDH5)、CXC受體2基因(CXC receptor 2 gene,CXCR2)、小窩蛋白1基因(caveolin1 gene,CAV1)、血小板堿性蛋白基因(platelet basic protein gene,PPBP)、金屬蛋白酶組織抑制因子1基因(metalloproteinase inhibitor 1 gene,TIMP1)、血小板反應(yīng)蛋白受體基因(thrombospondin receptor gene,CD36)、血小板反應(yīng)蛋白2基因(thrombospondin 2 gene,THBS2)、CXC配體2基因(CXC ligand 2 gene,CXCL2)、基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metallopeptidase 1 gene,MMP1)，見表1。選擇其中核心基因CAV1進(jìn)行后續(xù)研究。

注：圖中面積越大連接度越高。圖2 差異基因的PPI分析Fig.2 PPI analysis of differential genes

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)中前14的核心基因Tab.1 List of 14 genes with the highest degree of connectivity

2.3 CAV1基因表達(dá)與NSCLC患者生存期分析

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析顯示，NSCLC腫瘤組織中高表達(dá)CAV1的腫瘤患者生存期短于低表達(dá)CAV1的腫瘤患者(P<0.05)，見圖3。NSCLC腫瘤組織中，不同性別間CAV1基因表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4A；與癌旁組織比較，NSCLC 腫瘤組織中CAV1表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4B。CAV1與MKI67、VIM的表達(dá)均呈正相關(guān)(R=0.15，P<0.05；R=0.29，P<0.05)，說明CAV1與NSCLC的增殖、轉(zhuǎn)移可能存在密切相關(guān)，見圖5。

圖3 CAV1表達(dá)水平與NSCLC患者預(yù)后生存分析(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù))Fig.3 Expression level of CAV1 and prognostic survival analysis of NSCLC patients(TCGA database)

注：A為不同性別間比較，B為不同組織間比較；(1)與癌旁組織組織比較，P<0.01。圖4 不同組織及不同性別間CAV1的表達(dá)(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù))Fig.4 Expression of CAV1 in different human tissues and gender(TCGA database)

注：A為 CAV1與MKI67相關(guān)性分析；B為CAV1與VIM的相關(guān)性分析。圖5 CAV1與MKI67、VIM的相關(guān)分析(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù))Fig.5 Correlation between CAV1 and MKI67,VIM(TCGA database)

2.4 Caveolin1蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，NSCLC組中Caveolin1蛋白表達(dá)高于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 NSCLC組與癌旁組織組中 Caveolin1蛋白的表達(dá)(SP法，×200)Fig.6 Expression of Caveolin1 protein in paracancerous tissues group and NSCLS group(SP，×200)

3 討論

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的腫瘤，因缺少用于早期診斷的指標(biāo)且病情進(jìn)展迅速，八成以上患者就診時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期，使得許多患者錯(cuò)失最佳的治療時(shí)間，目前手術(shù)治療和放化療手段都難以從根本上解決腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題[14-15]。雖然技術(shù)不斷進(jìn)步，近年來又推出了如物理消融、介入和生物療法等一系列新的治療手段[16]，但 NSCLC總5年生存率仍然只有約10%，其中八成患者在確診腫瘤時(shí)已經(jīng)錯(cuò)失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，只有不到2%的肺癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)處于早期[17-18]。早期肺癌手術(shù)切除腫瘤后的5年生存率達(dá)超過70%。因此，從基因水平對(duì)NSCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制進(jìn)行分析，篩選新型的腫瘤檢測(cè)標(biāo)志物對(duì)NSCLC的早期診治具有重要意義。

本研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中60例肺癌組織和相應(yīng)的60例癌旁組織的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過對(duì)差異基因聚類、篩選、繪制互作網(wǎng)絡(luò)等方法篩選出14個(gè)核心基因。在14個(gè)基因中，CXCR2、CD36、CXCL2、MMP1等基因均為目前報(bào)道較多且與肺癌有較為明確關(guān)系的基因，而GNG11、LRRK2、PPBP、THBS2、CAV1五個(gè)基因與肺癌的關(guān)系目前報(bào)道較少,本研究重點(diǎn)對(duì)CAV1進(jìn)行了研究[19-22]。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)CAV1在肺癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，并對(duì)患者的生存期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，發(fā)現(xiàn)CAV1高表達(dá)的患者生存期低于低表達(dá)CAV1的患者。由于本研究分析的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)均來自女性肺癌患者，為排除CAV1在不同性別人群中的表達(dá)差異，本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)對(duì)CAV1在男性和女性肺癌患者的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示CAV1的表達(dá)與性別無顯著關(guān)系。本研究還比較了CAV1在 NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CAV1在 NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織；進(jìn)一步分析顯示，CAV1基因與參與肺癌增殖和轉(zhuǎn)移的MKI67和VIM基因表達(dá)呈正相關(guān)。這一系列結(jié)果與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)果相一致。本研究檢測(cè)了100例NSCLC臨床樣本數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，與相應(yīng)癌旁組織相比，Caveolin1在NSCLC組織中高表達(dá)。

CAV1基因所表達(dá)的蛋白Caveolin1為細(xì)胞膜窖體(Caveolae)的主要構(gòu)成蛋白，細(xì)胞膜窖體是細(xì)胞膜發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[23-24]。CAV1基因在細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著多種重要作用，包括信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程[25]。CAV1在腫瘤萌芽期的表達(dá)明顯增加，這顯示CAV1可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[26-27]。但目前對(duì)CAV1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用研究相對(duì)較少，特別是其在肺癌增殖轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，CAV1與NSCLC患者的生存期，肺癌增殖、轉(zhuǎn)移等方面可能有著密切的關(guān)系。

本研究主要利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的分析和本地臨床樣本進(jìn)行分析，但暫時(shí)缺少在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平的機(jī)制研究和在臨床樣本上的機(jī)制驗(yàn)證工作，未來將對(duì)CAV1基因和Caveolin1在NSCLC中作用機(jī)制展開進(jìn)一步研究，以期為臨床上肺癌的早期診斷和治療提供新的思路。