何洋，安天志，李成，周石，謝坪，段慶紅**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 影像學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.四川省人民醫(yī)院 介入科，四川 成都 610000)

動脈粥樣硬化斑塊屬于血管炎性疾病的一種,主要原因是脂質(zhì)聚集、免疫細胞浸潤、或者纖維帽形成導(dǎo)致動脈管壁增厚。[1],亦認為樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)也存在于血管壁炎性病灶中、并促進動脈粥樣硬化斑塊形成[2-3]。外泌體(Exosome)是一種極微小的囊泡結(jié)構(gòu)，它的直徑只有30～150 nm,并且能由機體內(nèi)大多數(shù)細胞分泌，已知的膜蛋白、脂類、RNA以及DNA等在細胞生理活動過程中均可分泌外泌體[4-5]。研究表明成熟的DCs分泌的外泌體能促進血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng),單核細胞來源的外泌體作為DCs的前體，可誘導(dǎo)細胞因子和黏附分子的分泌及表達[6]。綜上所述,DCs可分泌外泌體和其它細胞溝通,例如通過外泌體調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞、從而影響動脈粥樣硬化疾病的進展。核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)是蛋白質(zhì)中的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,通過刺激因子的激活誘導(dǎo)各種基因的表達、并分泌多種細胞因子來參與調(diào)節(jié)機體的炎癥反應(yīng)[7]。研究表明動脈粥樣硬化和纖維斑塊中NF-κB的活性升高,但無動脈粥樣硬化的病變血管內(nèi)NF-κB幾乎不表達[8-9]。因此,本研究從小鼠中分離骨髓DCs并培養(yǎng)獲得外泌體,用分離得到的外泌體處理細胞,使用ELISA、PCR及Western blot方法檢測相關(guān)蛋白的表達情況及外泌體的攝取,探討DCs來源的外泌體對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 均選于健康雄性8周齡的C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量范圍在22～24 g,由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供,于無菌、恒溫及明暗交替的清潔級環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,術(shù)前禁食12 h,實驗獲得醫(yī)院動物倫理委員會批準(1900921)。

1.1.2實驗試劑 實驗試劑 75%乙醇及三氯甲烷(重慶源邦醫(yī)藥有限公司，中國)，牛血清白蛋白及胎牛血清(FBS)、RPMI1640、RIPA裂解液、雙抗、HBSS/PBS緩沖液(Gibco公司，美國)，無菌EDTA抗凝采血管、96孔培養(yǎng)板(BD公司，美國)、Tris-base、Glycine、30%Acr-Bis(29 ∶1)、APS、TEMED、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、Phalloidin、DAPI(Sigma公司，美國)，蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天，中國)，Anti-β-actin、Anti-p-p100、p105(CST公司，美國)，Anti-CD63、Anti-TSG101(Santa Curz公司，美國)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素-6(interleukin，IL-6)的ELISA試劑盒(R &D Systems，美國)，慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G(Addgene公司，美國)，CD63-GFP慢病毒載體(廣州銳博，中國)。

1.2 研究方法

1.2.1骨髓樹突狀細胞(bone marrow dendritic cells，BMDCs)分離與培養(yǎng) C57BL/6J小鼠頸椎脫臼處死,從骨關(guān)節(jié)處剪斷并分離大、小腿骨,生理鹽水清潔洗凈分離好的腿骨、置于冰上,并轉(zhuǎn)移到生物安全柜內(nèi)操作;將腿骨兩端剪斷,用1640培養(yǎng)基沖洗骨髓,收集液體后以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,用含GM-CSF等因子的RPMI 1640+30%AG8653細胞培養(yǎng)液重懸沉淀細胞,加紅細胞裂解液裂解2 min,再離心后棄去細胞上清溶液,重新懸浮細胞后行細胞計數(shù),以5×106/皿將細胞鋪于細胞培養(yǎng)皿、培育箱中培育,觀察細胞生長的情況;BMDCs為半貼壁細胞,待培育后第7天,用槍吹下細胞并收取待后續(xù)實驗用。

1.2.2BMDCs外泌體分離提取和鑒定 收集BMDCs細胞,放入離心機內(nèi),以1 000 r/min 條件離心10 min,取上清液;再用6 000 r/min 離心10 min后,取上清液,后15 000 r/min離心70 min后取得沉淀,添加PBS重懸,再15 000 r/min離心70 min后的沉淀便是外泌體;然后再次添加少量PBS重懸,于-80 ℃冰箱中保存。在外泌體內(nèi)添加RIPA裂解液,通過WB操作步驟觀察標(biāo)志物CD63和TSG101的表達情況;將外泌體在PBS中重懸,瞬時離心后,取50 μL涂在碳涂層網(wǎng)格中,濾紙吸干過量的液體,用0.75%的甲酸鈾酰染色30 s,最后再用電子顯微鏡數(shù)字化的掃描網(wǎng)格來觀察外泌體。

1.2.3CD63-GFP慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)皿中以2×106/皿將293T細胞鋪滿,第2天時等到細胞生長密度達到80%時便開始質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為:EP管1中加入psPAX27.5 g、pMD2.G 2.5 g+180lpti-MEM、CD63-GFP質(zhì)粒10 g;EP管2中加入Fugene 660l+740l Opti-MEM。將BMDCs鋪在用高聚賴氨酸(PDL)包被的培養(yǎng)皿中,加細胞3×106/皿中置于-80 ℃度冰箱中冷藏,第2天取出病毒液并溶化,在2 mL病毒液中加入polybrene(8 g/L)3 μL和RPMI1640完全培養(yǎng)基1 mL,將病毒液加入到有BMDCs細胞的培養(yǎng)皿中,置于37 ℃培育箱中培養(yǎng)12 h后丟棄病毒液、再于10 mL完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),48 h后，加入嘌呤霉素篩選;于倒置熒光顯微鏡下檢測GFP陽性細胞的比例,等待細胞篩選結(jié)果平穩(wěn)后留待后續(xù)實驗。

1.2.4BMDCs與HUVEC共培養(yǎng) 取transwell小室及配套的6孔板，以1×106/孔將HUVEC細胞鋪于孔板內(nèi)，以1×106/孔將BMDCs細胞鋪于小室內(nèi)(圖1)。分別標(biāo)注單純HUVEC培養(yǎng)組(Ⅰ組)、BMDC+HUVEC共培養(yǎng)組(Ⅱ組)和BMDC(加外泌體抑制劑GW4869)+HUVEC共培養(yǎng)組(Ⅲ組)。

圖1 BMDCs與HUVEC共培養(yǎng)Fig.1 Indication of co-culture BMDCs and HUVEC

1.2.5細胞免疫熒光檢測外泌體分布 HUVEC細胞與BMDCs細胞共培養(yǎng)48 h,移除transwell小室、棄掉培養(yǎng)基、PBS清洗、固定,每孔加入0.05% TritonX 孵育15 min破膜、清洗,2% BSA 2 mL封閉1 h,滴加稀釋的phalloidin 80 μL于石蠟紙上,蓋上濕盒蓋子室溫孵育30 min,清洗、DAPI染色1 min,清洗、蓋玻片滴加約80 μL防熒光猝滅保護液,中性樹膠固定，風(fēng)干后在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6p105和p100的蛋白表達 收集DCs細胞消化后的細胞沉淀，用RIPA裂解,4 ℃、12 000 r/min離心10 min后,取上清液于-80 ℃冰箱中保存,用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)將蛋白質(zhì)分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加入相應(yīng)抗體4 ℃孵育24 h、TBST洗膜3次、辣根過氧化物酶(HRP)二抗室溫孵育1 h,用增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒處理 PVDF 膜,QualityOne 軟件進行分析。

1.2.7檢測TNF-α、IL-6的mRNA表達 采用QIAGEN的RNA提取試劑盒,用去離子水50μL將RNA溶解,15 ℃水浴10 min,紫外分光光度計測定RNA的純度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃、2 min進行預(yù)反應(yīng),95 ℃變性,擴增40個循環(huán),60 ℃退火、延伸。引物序列見表1,比較循環(huán)閾值(Ct)法計算基因相對表達量ΔCt=(Ct mRNA-Ct mRNA對照)和倍數(shù)變化。

表1 內(nèi)參、IL-6及TNF-α引物序列Tab.1 Internal reference,IL-6,and TNF-α primer sequence

1.2.8檢測TNF-α和IL-6表達 根據(jù)試劑盒說明書，使用酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)試劑盒測定樣品的TNF-α、IL-6蛋白表達，根據(jù)相應(yīng)樣品的OD值和標(biāo)準曲線計算樣品實驗濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMDCs外泌體的鑒定

外泌體在電鏡下顯示為圓形或類圓形結(jié)構(gòu)、直徑約100 nm(圖2A),WB檢測示外泌體標(biāo)志物CD63和TSG101為陽性(圖2B),表明使用梯度離心法分離得到的為外泌體。

注：A圖為透視電鏡下觀察外泌體,B圖Western blot檢測CD63和TSG101表達。圖2 BMDCs的外泌體形態(tài)及標(biāo)志蛋白表達(200×)Fig.2 Identification of exosomes and marker protein expression of BMDCs(200×)

2.2 BMDCs的外泌體被HUVEC攝取

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別培養(yǎng)48 h后于免疫熒光染色下檢測相關(guān)抗原,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察可見:在Ⅱ組中,HUVEC可以攝取來自于BMDC的外泌體,但增加外泌體抑制劑GW4869之后,被攝取的外泌體數(shù)量減少,結(jié)果說明來源于BMDC的外泌體能被HUVEC攝取。見圖3。

注：白色箭頭指BMDC的外泌體被HUVEC攝取。圖3 BMDC來源的外泌體被HUVEC攝取Fig.3 BMDC-derived exosomes absorbed by HUVEC

2.3 BMDCs外泌體對HUVEC炎癥因子 TNF-α和IL-6的影響

比較LPS誘導(dǎo)的成熟BMDCs(mBMDCs)和未成熟的BMDCs(imBMDCs)細胞培養(yǎng)上清液中的表達情況，結(jié)果表明其中TNF-α和IL-6的表達無統(tǒng)計學(xué)差異。(圖4A)。共培養(yǎng)實驗表明，BMDC+HUVEC共培養(yǎng)組中HUVEC培養(yǎng)上清液內(nèi)的IL-6和TNF-α的表達水平均升高，而BMDC(加外泌體抑制劑GW4869)+HUVEC共培養(yǎng)組中IL-6和TNF-α表達下降(圖4B)。從BMDCs直接分離獲得的外泌體處理HUVEC模型實驗顯示，外泌體處理組HUVEC細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6濃度和Contorl組相比明顯升高(圖4C)。

注：(1)與HUVEC組比較，P<0.05；(2)與H+imB或H+mB組比較，P<0.05；(3)與Contorl組比較，P<0.05。圖4 BMDCs外泌體對HUVEC細胞炎癥因子 TNF-α和IL-6的影響Fig.4 BMDCs exosomes promote HUVEC inflammatory response

2.4 BMDCs外泌體激活HUVEC內(nèi)NF-κB信號通路

HUVEC與BMDCs共培養(yǎng)組實驗證明,p105和p100的磷酸化水平在共培養(yǎng)組中比單純HUVEC組更高,且成熟BMDCs共培養(yǎng)組中升高更明顯,但HUVEC中p105和p100的磷酸化水平在用外泌體抑制劑GW4869處理BMDCs后有明顯下降(圖5A、B);直接用從BMDC分離獲取的外泌體處理HUVEC后，顯示其p105和p100的磷酸化水平均升高,抑制劑處理的結(jié)果同樣升高(圖5C、D)。

注： A、C圖為Western blot實驗結(jié)果，B、D圖為蛋白表達直條圖；(1)與HUVEC組比較，P<0.05；(2)與H+imB或H+mB組比較，P<0.05;(3)與H+imB-Exo或H+mB-Exo比較，P<0.05。圖5 BMDCs外泌體對p105和p100的磷酸化水平的影響Fig.5 BMDCs exosomes activate phosphorylation of p105 and p100

2.5 HUVEC攝取BMDCs外泌體對炎癥因子 TNF-α和IL-6的影響

為了再次驗證以上結(jié)論，用NF-κB通路抑制劑BAY11-7082將HUVEC中NF-κB通路抑制，表明與單純的外泌體處理組比較，外泌體+抑制劑組中p105和p100的磷酸化水平降低(圖6A、B)，且HUVEC細胞中TNF-α和IL-6的表達也降低(圖6C、D)，提示來源于BMDCs的外泌體可能通過NF-κB通路增加炎癥因子TNF-α和IL-6的表達。

注：A圖為Western blot驗結(jié)果，B、C圖為蛋白表達直條圖，D圖為mRNA表達直條圖；(1)與HUVEC組比較，P<0.05；(2)與HUVEC+imB或HUVEC+mB比較，P<0.05。圖6 BMDCs外泌體被HUVEC攝取并通過NF-κB通路促炎癥應(yīng)答Fig.6 BMDCs exosomes wereabsorbed by HUVEC and promote inflammatory response via the NF-κB signal pathway

3 討論

DCs在動脈粥樣硬化過程調(diào)節(jié)中有著重要的作用，一般考慮有以下幾點因素：(1)在小鼠被基因敲除CX3CR1、CCR2、CCR5等因子后，其動脈粥樣硬化被抑制；(2)DC對膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響;(3)DC遷移的小分子和涉及抗原提呈因子被刪除后也會抑制動脈粥樣硬化[10-11]。由于DCs在動脈粥樣硬化過程中有著重要的影響作用，為了更深入討論DC在動脈粥樣硬化疾病過程中的影響機理，本研究通過觀察DC來源的外泌體被HUVEC攝取并影響內(nèi)皮細胞的生理過程，從C57BL/6J小鼠中分離并擴大培養(yǎng)骨髓巨噬細胞，后將巨噬細胞中基因轉(zhuǎn)入CD63-GFP質(zhì)粒中并示蹤外泌體，最后將HUVEC細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明HUVEC可以攝取來自于巨噬細胞分泌的外泌體，由于外泌體是極微小的囊泡結(jié)構(gòu)并能被機體內(nèi)大多數(shù)細胞分泌，其內(nèi)有許多如DNA、RNA和蛋白等成分[4-5]，HUVEC攝取來源于巨噬細胞的外泌體后，外泌體中的成分也會進入HUVEC細胞中，并對HUVEC細胞內(nèi)的生理過程產(chǎn)生影響。

有研究表明使用經(jīng)LPS誘導(dǎo)過的單核細胞處理HUVEC，CCL2和ICAM-1表達會升高，表明人單核細胞外泌體可能會經(jīng)NF-κB通路和內(nèi)皮細胞中Toll樣受體干擾內(nèi)皮功能[12]。本研究發(fā)現(xiàn)BMDC分泌的外泌體能夠被HUVEC攝取，并通過共培養(yǎng)模型和直接分離提取BMDC的外泌體處理HUVEC細胞的實驗表明，共培養(yǎng)模型和外泌體處理模型中HUVEC細胞中p105和p100的磷酸化水平均上升，即NF-κB通路激活。

近些研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活可分為兩個相互獨立的部分，一是由微生物或促炎因子(如IL-1、TNF-α)等誘導(dǎo)的具有RelA、cRel-的復(fù)合體激活[13]，亦或是具有BAFF、RANKL、TNFSF3、CD40L、等誘導(dǎo)的RelB/P52復(fù)合體激活[14]。NF-κB的激活對關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、慢性肺阻塞性疾病、哮喘、炎癥性腸炎等在內(nèi)的多種炎性疾病有調(diào)節(jié)作用；所以NF-κB通路也被廣泛認可為以上疾病的潛在治療靶點[15-16]。非經(jīng)典的NF-κB通路有IKKα誘導(dǎo)激活p100磷酸化升高的特點[17]；廣泛的IBs家族也包括p50的前體形式p105，和p52的前體p100[18]。本研究發(fā)現(xiàn)來源于BMDC的外泌體可以促進p100和p105的磷酸化水平，即NF-κB通路非經(jīng)典途徑的激活，為了探討該途徑在內(nèi)皮細胞中炎癥反應(yīng)的激活與應(yīng)答影響，本研究還測定了在內(nèi)皮細胞中TNF-α和IL-6的表達和分泌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞中的NF-κB通路經(jīng)非經(jīng)典途徑激活后，促炎因子IL-6和TNF-α的表達和分泌水平均升高，表明NF-κB通路非經(jīng)典途徑激活對炎癥有促進作用。為了更深入討論NF-κB通路的激活對促炎因子IL-6和TNF-α的影響，本研究在共培養(yǎng)的基礎(chǔ)上添加抑制劑來抑制內(nèi)皮細胞中NF-κB通路的激活，發(fā)現(xiàn)與無抑制劑組相比較，內(nèi)皮細胞中p100和p105的磷酸化水平降低，同時，IL-6和TNF-α的表達和分泌也均有降低，這也更加表明HUVEC細胞攝取BMDC的外泌體來激活NF-κB通路并影響致炎因子IL-6和TNF-α的釋放，即提高了炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)BMDCs來源外泌體可以通過激活內(nèi)皮細胞NF-κB信號通路增加促炎因子的表達和分泌，提示DCs可能通過外泌體參與動脈粥樣硬化疾病，有待體內(nèi)實驗研究進一步證實。