康小紅，王藝明*

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 精神科，貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(Alzheimer's desease，AD)是以進行性記憶損傷和認知障礙為主要表現的中樞神經退行性疾病[1-3]，在海馬、前額葉皮質等處沉積于神經元細胞周圍的β-淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)可引起膠質細胞活化、神經炎癥等，進而引起細胞內微管相關蛋白-Tau蛋白過度磷酸化，形成神經纖維纏結[4]，導致神經元死亡和突觸性壞死，最終引發(fā)嚴重的神經精神癥狀[5-8]。研究表明，白藜蘆醇(resveratrol，Res)可激活沉默信息調節(jié)因子2相關酶I(silencing information regulator 2 related enzyme Ⅰ，SIRT1)，再經維甲緯酸受體β(retinoic acid receptor beta，RARβ)間接或直接激活含有解整合素和金屬蛋白酶結構域的蛋白10(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10，ADAM10)，減少Aβ的產生[9]，但Res能否通過上調SIRT1/RARβ/ADAM10信號通路表達降低Tau蛋白磷酸化水平的報道尚未見到。因此，本研究擬通過SIRT1受體唯一激動劑Res干預AD模型小鼠，觀察小鼠前額葉皮質SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達水平及Tau蛋白絲氨酸396位點[phosphorylated Tau Ser396，p-tau(S396)]磷酸化水平，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 選取6月齡C57BL/6雄性小鼠6只，6月齡APP/PS1雙轉基因雄性小鼠12只，均購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK(蘇)2018-0008]。

1.1.2主要儀器 動物通用活動箱(上海吉量)，臺式高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter)，超聲波細胞/組織破碎儀(上海利聞)，生物安全柜和分光光度計NanoPhotometer?(美國Thermo Fisher Scientific)，7500聚合酶鏈式反應基因擴增儀和普通聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國ABI)，多功能酶標儀和小型垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad)，化學發(fā)光成像儀(上海勤翔)。

1.1.3主要藥物和試劑 Res粉末(西安格林)，TRIZOL RNA提取液(美國賽默飛)，反轉錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TAKARA)，引物(上海生物)，高效RIPA組織/細胞裂解液、蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、彩虹marker、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白加樣緩沖液(5×)及SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(北京索萊寶)，2,2-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)，Tau phospho S396單克隆抗體和Tau蛋白單克隆抗體(英國Abcam)，SIRT1、ADAM10/MADM、RAR β及β-actin多克隆抗體(北京博奧森)。

1.2 研究方法

1.2.1實驗動物造模和分組 C57BL/6小鼠設為空白對照組(blank control，BC組)，APP/PS1雙轉基因小鼠參考文獻[10]制備的AD小鼠模型隨機均分為AD組和AD+Res組；稱取Res粉末32 mg，加生理鹽水3.9 mL，再加二甲基亞砜0.1 mL混合均勻，現用現配，每日于同一時間對AD+Res組小鼠予800 mg/kg Res溶液灌胃3個月，其余組小鼠予相應量生理鹽水灌胃3個月。

1.2.2Morris水迷宮實驗(morris water maze,MWM) 取直徑40 cm的圓柱體玻璃水缸，加25 ℃清潔水至25 cm，中央放置一個高于水面5 cm的平臺，將各組小鼠依次放入水缸，引導小鼠找到水中平臺，訓練4次/d、共4 d；訓練結束后將小鼠從原來進入水缸位置的對側放入水缸，記錄小鼠在非引導狀態(tài)下找到水中平臺的時間，以測試小鼠的學習、記憶及空間探索能力，即認知能力[11]。所有小鼠9月齡時再次測試，第2次MWM前不再進行訓練。MWM期間各組小鼠飼養(yǎng)于溫度21 ℃、濕度50%的適宜環(huán)境，自由進食，每組3只小鼠分籠飼養(yǎng)。

1.2.3熒光實時定量PCR(real-time fluorescent PCR，RT-qPCR)檢測小鼠前額葉皮質SIRT1、ADAM10 mRNA表達水平 各組小鼠于9月齡再次完成MWM后適時麻醉處死，冰上快速取腦，分離出前額葉皮質，稱取前額葉皮質5 mg，Trazol法提取總RNA，按照反轉錄試劑盒操作說明書合成cDNA，再按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒操作說明書進行RT-qPCR反應，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列及目的片段大小Tab.1 RT-qPCR primer sequence and target fragment size

1.2.4免疫蛋白印跡(Western blot)檢測小鼠前額葉皮質SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達及Tau蛋白磷酸化水平 將高效RIPA組織/細胞裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑PMSF以100 ∶1 ∶1配置裂解液，稱取各組小鼠前額葉組織10 mg，加裂解液200 μL，超聲研磨均勻，冰上裂解30 min、混勻1次/5min，14 000 r/min于4 ℃離心15 min。吸取上清液后按照BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明書測定總蛋白濃度，剩余樣品與5×SDS-PAGE蛋白加樣緩沖液以4 ∶1混合均勻后100 ℃加熱5 min。以每孔定量蛋白樣品30 μg進行電泳，90 V恒壓電泳30 min，120 V恒壓電泳1.5 h，200 mA恒流轉膜1.5 h，5%牛奶或BSA封閉液封閉1 h，相應一抗4 ℃孵育過夜，次日進行二抗孵育、洗膜及曝光。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MWM

與同組6月齡比較，9月齡AD組和AD+Res組小鼠找到水中平臺的時間均明顯延長(P<0.01)，BC組小鼠6月齡時與9月齡時MWM指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與9月齡BC組比較，AD組小鼠找到平臺的時間明顯延長(P<0.01)，但AD+Res組小鼠與AD組組間差異則無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠MWM中找到水中平臺的時間Tab.2 Time to find water platform in MWM of mice in each

2.2 SIRT1和ADAM10 mRNA表達

與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質SIRT1和ADAM10 mRNA表達均下降(P<0.01)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質ADAM10 mRNA表達水平升高(P<0.01)，但SIRT1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠前額葉組織SIRT1和ADAM10 mRNA的表達Tab.3 SIRT1 and ADAM10 mRNA expression

2.3 SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達及p-tau(S396)水平

與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質SIRT1、ADAM10蛋白表達水平降低(P<0.01)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質SIRT1、ADAM10表達水平升高(P<0.05)。與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質RARβ表達水平降低(P<0.05)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質RARβ表達水平升高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質p-tau(S396)磷酸化水平升高(P<0.001)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質p-tau(S396)磷酸化水平降低(P<0.01)。見圖1。

注：A為免疫印跡條帶，B～E分別為SIRT1蛋白、RARβ蛋白、ADAM10蛋白及p-tau(S396)磷酸化定量結果；(1)與BC組比較，P<0.01；(2)與AD組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠前額葉皮質SIRT信號通路相關蛋白的表達和p-tau(S396)磷酸化水平Fig.1 Expression of SIRT signaling pathway related proteins and phosphorylation level of p-tau (S396) in prefrontal cortex of mice in each group

3 討論

有研究報道，6～7月齡的APP/PS1小鼠腦內Aβ開始沉積并逐漸形成老年斑[12]。因此本研究采用6月齡小鼠作為研究對象，通過對比BC組、AD組、AD+Res組小鼠前額葉皮質處的p-tau(S396)磷酸化程度和認知水平的改變，評估AD小鼠和經Res治療后的AD小鼠前額葉神經纖維纏結程度以及與SIRT1/RARβ/ADAM10信號通路的轉導的相關性。

MWM是常見的用于評估神經、精神疾病模型動物認知功能的實驗方法，通過觀察小鼠訓練后找到水中平臺的時間評估小鼠的學習、記憶能力及空間探索能力，也可在一定程度上反映實驗小鼠的行為活動能力[13]。本研究中，BC組小鼠在6月齡和9月齡時的MWM測試中，找到平臺的時間無差異，而AD組小鼠與AD+Res組小鼠則在9月齡時表現出搜索潛伏期明顯延長、直游及圈游次數減少，迷宮周邊停留時間顯著增加，表明APP/PS1雙轉基因處理所導致的小鼠大腦病理改變損害了小鼠的認知能力以及運動功能，同時，經Res干預的小鼠與同月齡BC組和AD組小鼠組間比較MWM測試時間均無差異，由此推測Res干預可能在一定程度上改善了APP/PS1雙轉基因處理所導致的認知損害，對AD的認知能力以及運動功能下降有一定治療作用但并不能完全緩解，這與前期相關研究報道結果一致[14-15]。因此，本課題將在后續(xù)研究中擴大樣本量，應用更加全面的認知能力與運動功能的測試方法，進一步深入探究Res干預APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠的效果評價。

關于AD發(fā)生發(fā)展的機制雖然尚未研究清楚，但Aβ級聯假說與Tau蛋白過度磷酸化假說卻得到了相當一部分研究成果的支持，證明Aβ可以誘導Tau蛋白的過度磷酸化，進而引起中樞神經纖維扭曲、纏結[16-19]。Aβ代謝分為有β-分泌酶和γ-分泌酶參與的淀粉樣代謝途徑和有α-分泌酶參與的非淀粉樣代謝途徑，β淀粉樣前體蛋白可被蛋白水解作用產生Aβ，起到神經毒性作用，Aβ分布于大腦多個皮質層區(qū)域，以海馬、額顳葉等處尤其明顯，α-分泌酶ADAM10則參與β淀粉樣前體蛋白的非淀粉樣代謝途徑，產生可溶性片段sAPPa，競爭性降低Aβ水平，sAPPa在一定范圍內的升高有利于神經保護作用[20-25]。

SIRT1可直接激活ADAM10，也可通過RARβ間接地增加ADAM10的表達，減少毒性Aβ的生成與沉積，由此推測Res激活SIRT1也可減輕小鼠前額葉皮質Tau蛋白磷酸化水平，并改善小鼠的認知功能、探索能力、活動能力及記憶力[26]。本研究中，在基因水平，SIRT1、ADAM10在AD組小鼠表達較BC組降低，SIRT1在AD+Res組與AD組無差異，AD+Res組小鼠ADAM10表達高于AD組。在蛋白水平，APP/PS1轉基因使AD組小鼠SIRT1、RARβ、ADAM10水平均低于BC組，并且AD組小鼠Tau蛋白磷酸化程度明顯高于BC組，Res處理則使上述信號通路上調，并且降低Tau蛋白磷酸化程度，說明AD發(fā)生發(fā)展的機制之一可能是該信號通路的下調。最終本研究證明，AD小鼠的SIRT1/RARβ/ADAM10信號通路下調，Tau蛋白磷酸化水平升高，Res則上調了上述信號通路中相關蛋白的表達水平，降低了小鼠前額葉皮質Tau蛋白的磷酸化水平，改善了實驗小鼠的認知功能。

綜上所述，AD 小鼠前額葉信號通路中SIRT1、RARβ及ADAM10表達降低，Tau蛋白磷酸化程度升高；Res可改善AD小鼠認知功能，與AD小鼠前額葉SIRT1、RARβ、ADAM10表達上調及Tau蛋白磷酸化程度降低有關。