伏紅穎，潘艷伶，陳俞如，陳洪民

(1.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 中醫(yī)學教研室，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 中醫(yī)科，貴州 貴陽 550000)

糖尿病(diabetic mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病[1]。根據國際糖尿病聯盟發(fā)布的第9版《IDF全球糖尿病概覽》顯示，預計到2045年，中國糖尿病患者數量將達到1.164億人[2]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)患者最主要的病理改變之一是腎纖維化[3-4]。腎小球系膜細胞是腎小球的固有細胞之一，其增殖是導致DKD腎纖維化的重要因素[5]。近年來，有研究發(fā)現，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)/Smad信號通路被公認為在DKD的腎纖維化進程中起著重要作用，DKD發(fā)生發(fā)展時，TGF-β1/Smad信號通路被過度激活，進而引起腎小球系膜細胞增殖，細胞外基質(extracelluar matrix，ECM)的合成降解失衡，促進腎臟纖維化[6-8]。在TGF-β1/Smad信號通路中，TGF-β1被認為是腎小球硬化和腎小管間質纖維化機制中最關鍵的細胞因子，Smad2和Smad3則是促進TGF-β1介導組織纖維化的兩個主要下游調節(jié)因子[9-11]，因此，研究尋找抑制腎小球系膜細胞增殖以及TGF-β1/Smad信號通路過度激活的有效藥物，對DKD的防治具有重要意義。本課題組前期動物及臨床實驗研究發(fā)現，臨床經驗方糖通飲可抑制DKD大鼠腎組織TGF-β1/Smad 信號通路的激活；改善早期DKD患者尿微量白蛋白、空腹血糖、血脂及糖化血紅蛋白，從而達到預防腎纖維化、延緩DKD發(fā)展為終末期腎病的效果[12-13]。本研究擬觀察在高糖環(huán)境下，糖通飲含藥血清對大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)增殖和TGF-β1/Smad信號通路的影響，探尋糖通飲體外細胞層面的分子作用機制，完善糖通飲防治DKD的作用機制，為糖通飲的臨床使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 30只SPF級SD雄性大鼠，體質量(180±20) g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號SCXK(遼)2020-0001；大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1，購自深圳Otwo Biotech公司。

1.1.2藥物 糖通飲顆粒劑，由廣東一方制藥有限公司提供，規(guī)格21 g/袋，組成藥物為生地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮、黃芪、丹參、地骨皮、草決明。藥材質量標準：生地(TS-QM-C094)、山藥(TS-QM-C347)、山茱萸(TS-QM-C350)、茯苓(TS-QM-C117)、澤瀉(TS-QM-C460)、丹皮(TS-QM-C-275)、黃芪(TS-QM-0179)、丹參(TS-QM-C085)、地骨皮(TS-QM-C093)、草決明(TS-QM-C215)。

1.1.3試劑 胰酶細胞消化液、DMEM正常糖培養(yǎng)基、Opti-MEM Reduced Serum Medium由GIBCO公司提供，青鏈霉素雙抗由HyClone公司提供，Western blot一抗稀釋液、RIPA裂解液、脫脂奶粉由Solarbio公司提供，特級胎牛血清(南美)由BI公司提供，RNA提取用Trizol購自thermo公司,細胞RNA提取試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，PVDF膜和Whatman濾紙購自Millipore公司，GAPDH抗體購自proteintech公司，TGF-β1一抗、Smad3一抗、Smad2一抗購自abcam公司，Phospho-Smad2一抗、Phospho-Smad3一抗均購自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔IgG-HRP二抗購自proteintech公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞的傳代和培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞鑒定后，選取第3～15代細胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM正常糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，待細胞融合度達80%～90%時吸去瓶內培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞3次，吸除廢液，用0.1%胰蛋白酶(1 mL)消化收集細胞1 min，10%培養(yǎng)基2 mL終止消化反應，用移液槍輕輕吹打細胞懸液，混勻后吸入新的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2含藥血清的制備 30只SPF級雄性SD大鼠，隨機分為空白對照組和糖通飲含藥血清組，每組15只；灌胃前將糖通飲顆粒劑按1 g/L的生藥濃度充分溶于雙蒸水中，以12.4 g/(kg·d)灌胃糖通飲含藥血清組大鼠(按照人體-大鼠體表面積比值換算)，空白對照組給予等體積的雙蒸水，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，經股動脈取血，血樣靜置2 h，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，分離血清，60 ℃水浴30 min滅活補體，過濾除菌，-80 ℃凍存。

1.2.3含大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基配制 以高糖+10%糖通飲含藥血清組培養(yǎng)基(30 mmol/L葡萄糖，50 mL)配制方法為例：稱取 0.220 7 g葡萄糖充分溶于 正常糖培養(yǎng)液45 mL 中，在超凈工作臺用過濾器過濾后，加入糖通飲含藥血清5 mL，顛倒混勻后分裝入5 mL離心管中，充分混勻后于-20 ℃或4 ℃儲存。

1.2.4實驗分組 收集到的大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞共分為正常糖+空白血清組(5.5 mmol/L葡萄糖+10%空白對照組大鼠血清)、高糖+空白血清組(30 mmol/L葡萄糖+10%空白對照組大鼠血清)以及高糖+糖通飲含藥血清組(30mmol/L葡萄糖+10%糖通飲含藥血清組大鼠血清)[14]，共3組。

1.2.5糖通飲含藥血清干預 選取第3～15代大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板內，每孔細胞懸液2 mL，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含有相應大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.6CCK-8法檢測細胞的增殖情況 系膜細胞以3×104/mL接種于96孔板中，每孔體積100 μL，細胞貼壁后將培養(yǎng)基換成含有相應大鼠血清的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入0.5%的CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在搖床上溫柔的搖勻，用酶標儀檢測各孔在波長450 nm處吸光值，每組同時設置調零孔和對照孔。計算細胞增殖率，細胞增殖率=[(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%。

1.2.7實時熒光定量PCR法檢測TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達 收集培養(yǎng)的各組細胞，按Trizol說明書提取細胞總RNA，根據上海翊圣公司反轉錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉錄為cDNA，按熒光定量PCR試劑盒檢測TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達，以GAPDH作為內參，引物見表1，2-ΔΔCT計算各組基因相對表達量，進行統(tǒng)計分析。

表1 引物序列及目的片段大小Tab.1 Primer sequence and target fragment size

1.2.8Western blot法檢測TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達 將培養(yǎng)結束的六孔板拿出，吸去培養(yǎng)基，用含PMSF的裂解液提取上清液，BCA蛋白定量分析；4 ∶1加蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：制膠、上樣、電泳、PVDF轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 4 ℃孵育過夜；二抗常溫下孵育1 h，超敏發(fā)光液顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶，軟件ImageJ計算灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HBZY-1細胞的增殖情況

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比較，高糖+糖通飲含藥血清組細胞增殖率降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖1 各組HBZY-1細胞的增殖情況(n=3)Fig.1 Proliferation of HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.2 HBZY-1細胞TGF-β1 mRNA表達

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組TGF-β1 mRNA表達增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細胞TGF-β1 mRNA表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖2 各組HBZY-1細胞TGF-β1 mRNA表達(n=3)Fig.2 Expression of TGF-β1 mRNA in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.3 HBZY-1細胞Smad2 mRNA表達

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組Smad2 mRNA表達增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細胞Smad2 mRNA表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖3 各組HBZY-1細胞Smad2 mRNA表達(n=3)Fig.3 Expression of Smad2 mRNA in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.4 HBZY-1細胞Smad3 mRNA表達

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組Smad3 mRNA表達增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細胞Smad3 mRNA表達減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖4 各組HBZY-1細胞Smad3 mRNA表達(n=3)Fig.4 Expression of Smad3 mRNA in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.5 HBZY-1細胞TGF-β1蛋白表達

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組細胞 TGF-β1蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細胞TGF-β1蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖5 各組HBZY-1細胞TGF-β1蛋白表達(n=3)Fig.5 Expression of TGF-β1 proteins in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.6 HBZY-1細胞p-Smad2/Smad2蛋白表達

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組細胞p-Smad2/Smad2蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細胞p-Smad2/Smad2蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖6 各組細胞p-Smad2/Smad2蛋白表達(n=3)Fig.6 Expression of p-Smad2/Smad2 proteins in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.7 HBZY-1細胞p-Smad3/Smad3蛋白表達

與正常糖+空白血清組比較，高糖+空白血清組細胞p-Smad3/Smad3蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細胞p-Smad3/Smad3蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖7 各組HBZY-1細胞p-Smad3/Smad3蛋白表達(n=3)Fig.7 Expression of p-Smad3/Smad3 proteins in HBZY-1 cells in each group(n=3)

3 討論

研究表明，系膜細胞增殖在DKD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，過度增殖的系膜細胞可通過多種途徑影響腎臟功能且與腎纖維化密切相關[15]。TGF-β1/Smad作為DKD發(fā)生發(fā)展最主要的信號通路，它的激活對DKD腎間質纖維化起著重要的促進作用[16]。該通路中的TGF-β1是DKD發(fā)病過程的中心環(huán)節(jié)，處于DKD相關生長因子網絡中心地位[17]，在DKD發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1通過刺激系膜細胞活化增殖，分泌大量的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原及纖連蛋白等細胞外基質(ECM)成分，導致ECM的堆積。此外，TGF-β1的過度表達，還可刺激金屬蛋白抑制劑產生，抑制膠原酶的合成，從而使ECM降解減少，有利于ECM在腎臟的積聚，促進DKD的發(fā)生發(fā)展[18-19]。Smads蛋白是介導TGF-β信號轉導的蛋白，分為受體激酶、通用型和抑制型三種。Smad2和Smad3屬于受體激酶，是促進TGF-β1介導組織纖維化的2個主要下游調節(jié)因子，當DKD發(fā)生發(fā)展時，TGF-β1先與Ⅱ型受體(TβRⅡ)結合，磷酸化Ⅰ型受體(TβRI)，進一步激活下游Smad3信號，促進Smad復合物產生，入核并干擾相關基因的表達，比如ECM成分纖連蛋白(FN1)和膠原蛋白等，從而進一步加重DKD腎纖維化程度[20]。本實驗結果發(fā)現，HBZY-1細胞在高糖刺激下明顯增殖，且細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達升高，TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達升高，提示TGF-β1/Smad通路的激活參與了高糖環(huán)境對HBZY-1細胞的損害。

中醫(yī)學中無DKD這一病名，但按其臨床表現當隸屬于消渴病并虛勞、腎勞、水腫等范疇，消渴病的基本病機為陰虛燥熱，發(fā)展日久則氣陰兩虛、瘀血內生，且陰虛日久、陰損及陽、陰陽俱虛，導致臟腑功能受損而致濁毒內停[21]，最終形成DKD氣陰兩虛為本、痰瘀濁毒阻絡為標的基本病機特點。有研究指出，根據DKD這一基本病機特點創(chuàng)制了中藥復方糖通飲，該方是在六味地黃丸的基礎上易熟地黃為生地黃，伍入黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成[22]。本研究所采用的糖通飲是以黃芪為君，生地黃、山藥、山茱萸為臣，培補肝腎、調養(yǎng)氣陰以固本虛；佐以茯苓、牡丹皮、澤瀉、丹參、地骨皮、草決明，除標實之痰濁，通腎絡之瘀阻；諸藥合用，標本兼治，益氣養(yǎng)陰保腎，活血化瘀通絡?，F代藥理學研究表明，黃芪中的黃芪甲甙及黃芪多糖兩種主要活性成分，具有降低血糖、減輕蛋白尿以及保護腎臟功能的作用[23]；丹參中的酚酸類和二萜醌類成分可以抑制腎纖維化和炎癥，減輕臨床患者的尿蛋白排泄率[24]；地骨皮、草決明可降糖降脂[25]。糖通飲已在臨床使用多年，并且取得了較為肯定的療效[26]，但其作用機制仍不十分明確。本研究結果顯示，與高糖+空白血清組比較，高糖+糖通飲含藥血清組細胞增殖被抑制，HBZY-1細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達降低，TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達均有不同程度的降低，說明該方可緩解高糖環(huán)境對HBZY-1細胞的損害，并抑制TGF-β1/Smad通路的激活。

綜上，本實驗首次采用中藥血清藥理學方法，從細胞層面證實了糖通飲可以抑制高糖狀態(tài)下大鼠腎小球系膜細胞增殖，其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路的過度激活有關。