萬彬彬，楊惠琴，胡剛明，鄒榮

（1.武漢市第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，湖北 武漢 430022；2.漢川市人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，湖北 漢川 431600；3.武漢市第一醫(yī)院 腎病科，湖北 武漢 430022）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種復(fù)雜、慢性、進(jìn)行性的自身免疫性疾病，影響全世界約1%人口[1]。如果未得到有效治療，40%～70%患者最終會(huì)發(fā)展為殘疾。目前尚無治療RA 的特效藥物，分析RA 的病因至關(guān)重要[2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞（rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASFs）促進(jìn)RA 的發(fā)生、發(fā)展，其大量增殖并侵襲進(jìn)入滑膜和骨組織，分泌炎癥細(xì)胞因子，發(fā)揮促炎癥作用[3]。Dickkopf-1（DKK1）蛋白是一種配體蛋白，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，DKK1 升高與RA 患者早期炎癥反應(yīng)有關(guān)[4]。MicroRNA（miRNA）是一種長度約為22 個(gè)核苷酸且高度保守的單鏈RNA，轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因表達(dá)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-126 在RA 患者中下調(diào)，并且能抑制RA 小鼠模型中RASFs 介導(dǎo)的炎癥因子分泌[6]。但是miR-126 對RASFs 生物學(xué)行為的影響和作用機(jī)制仍不清楚。本研究主要分析miR-126 通過靶向DKK1 參與RASFs 增殖、侵襲、凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2018 年6 月—2019 年9 月在武漢市第一醫(yī)院就診的25 例RA 患者的滑膜組織（RA 組），同時(shí)收集在本院同期接受膝關(guān)節(jié)十字韌帶斷裂重建手術(shù)的21 例非類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織作為健康組（均無急性或慢性關(guān)節(jié)異常的病史）。RA 患者男性14 例，女性11 例；年齡39～65 歲，平均（51.25±3.08）歲。正?；そM織者年齡35～65 歲，平均（50.94±3.18）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No：20190618），患者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①組織收集前3 個(gè)月內(nèi)接受過RA 相關(guān)治療；②合并惡性腫瘤、血液學(xué)疾病、感染或其他炎癥；③合并其他骨關(guān)節(jié)疾病。

1.3 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基血清和抗體（美國Invitrogen公司），胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶（美國Sigma-Aldrich 公司），miR-126 mimic、DDK1 過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對照（negative control，NC）（蘇州吉瑪基因股份有限公司），miRNeasy Mini 試劑盒（美國GE 公司），TaqMan miRNA 試劑盒（美國Thermo Fisher 公司），快速定點(diǎn)誘變試劑盒和Renilla 螢光素酶質(zhì)粒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），基質(zhì)膠和Transwell裝置（美國Corning公司），凋亡試劑盒（Annexin V-FITC 和PI）（北京百普賽斯生物科技股份有限公司），兔單克隆抗體和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000 稀釋，#ab6721）（美國Abcam 公司），PVDF 膜（美國Bio-Rad公司），ECL 顯色試劑盒（美國Thermo Fisher 公司）。螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒和檢測儀1000 System（美國Promega公司），流式細(xì)胞儀（美國Becton公司）。

1.4 RASFs培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將RA 患者滑膜組織用2.5 g/L 胰蛋白酶在37℃條件下消化2 h，離心獲得RASFs[7]。RASFs 在37℃、5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至接近匯合狀態(tài)時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代，將第3～8 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

RASFs 分為4 組：對照組、miR-126 組、DKK1組、miR-126+DKK1 組。miR-126 組和DKK1 組分別轉(zhuǎn)染miR-126 mimic、DKK1 過表達(dá)質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染等量NC 質(zhì)粒，miR-126+DKK1 組轉(zhuǎn)染miR-126 mimic 和DKK1。將細(xì)胞在6 孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至60%時(shí)，添加Opti 100 μL和LipofectamineTM2000 5 μL 并孵育5 min 作為試劑A。加入Opti 100 μL mimic 或者DKK1 質(zhì)粒20 ng/μL 并孵育5 min 作為試劑B。將A 和B 混合在一起孵育20 min。16 h 后更換培養(yǎng)基并收獲細(xì)胞。

1.5 方法

1.5.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativerealtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測miR-126的表達(dá) 使用miRNeasy Mini 試劑盒提取滑膜組織或RASFs 中總RNA，并用TaqMan miRNA 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：37℃、15 min，98℃、5 min。以cDNA 為模板行qRT-PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸4 min。以U6為內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值計(jì)算miR-126 相對表達(dá)量。qRT-PCR 引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5.2Western blotting檢測DKK1蛋白的表達(dá)健康組滑膜組織、RA組RASFs裂解后，4℃、12 000 r/min離心5 min 收集總蛋白。通過8% SDS-PAGE 分離每個(gè)樣本中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h，封閉非特異性抗原。將膜與兔單克隆抗體在4℃條件下孵育過夜，然后將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 顯色試劑盒顯影，使用Quantum One 軟件分析灰度，計(jì)算DKK1 蛋白相對表達(dá)量。

1.5.3雙螢光素酶報(bào)告檢測miR-126 和DKK1 的靶向關(guān)系通過Starbase 得到miR-126 與DKK1 的堿基結(jié)合位點(diǎn)。將野生型（Wt）的DKK1 序列擴(kuò)增到pGL4 螢光素酶載體的下游位點(diǎn)，使用快速定點(diǎn)誘變試劑盒生成突變型（Mut）DKK1。將RASFs 細(xì)胞按3×104/孔的密度接種在24 孔板中，24 h 后使用LipofectamineTM2000 將1 μg Wt/Mut-DKK1 螢光素酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后分別轉(zhuǎn)染50 nmol/L miR-126 mimic（miR-126 mimic 組）或者miR-126 NC 質(zhì)粒（miR-126 NC 組）。細(xì)胞在37℃下孵育36 h，使用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。所有數(shù)據(jù)以Renilla 螢光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力將100 μL 細(xì)胞懸浮液添加到96 孔板中孵育48 h，將10 μL CCK-8 溶液添加到每個(gè)孔中并孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每個(gè)孔的光密度（optical density, OD）值，間接反映細(xì)胞活力。

脂類是生物的能量儲(chǔ)存庫，是構(gòu)成生物膜的重要物質(zhì)，對機(jī)體具有重要的生物學(xué)作用和生理學(xué)調(diào)控功能[12,13]。蟹類的體脂含量受溫度和氣候的影響較大[14]。不同規(guī)格的中華絨螯蟹在囤養(yǎng)期間受時(shí)間階段的影響波動(dòng)較大，可能是由于囤養(yǎng)階段溫度太低，不同規(guī)格的蟹應(yīng)對環(huán)境的耐力不同，導(dǎo)致囤養(yǎng)階段脂含量的不同。

1.5.5Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力將基質(zhì)膠（1∶8 稀釋）加入上室，并在37℃條件下孵育30 min。將600 μL 完全培養(yǎng)基填充到24 孔板Transwell 下室，37℃條件下，將各組細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 進(jìn)行饑餓處理。消化后向Transwell 上室中加入100 μL 細(xì)胞溶液（5×105個(gè)細(xì)胞/mL），24 h 后洗去未侵入的細(xì)胞。滲入下室的細(xì)胞用95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min，最后在400 倍視野中隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.5.6流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡將細(xì)胞用PBS 洗滌并懸浮在100 μL 結(jié)合緩沖液中。分別加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，并在室溫下黑暗中孵育10～15 min。最后將400 μL 結(jié)合緩沖液添加到樣品中，并在1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；兩組比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康組與RA 組滑膜組織miR-126 和DKK1蛋白相對表達(dá)量比較

健康組和RA組滑膜組織miR-126相對表達(dá)量分別為（0.32±0.03）和（1.01±0.02），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.855，P=0.000），RA組低于健康組。健康組和RA 組滑膜組織中DKK1 蛋白相對表達(dá)量分別為（0.46±0.03）和（1.03±0.12），t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=27.921，P=0.000），RA組高于健康組。見圖1。

圖1 健康組和RA組滑膜組織中DKK1蛋白的表達(dá)

2.2 miR-126與DKK1的靶向關(guān)系

miR-126 與DKK1 的靶向結(jié)合位點(diǎn)見圖2。miR-126 NC 組、miR-126 mimic 組與DKK1 Wt 共轉(zhuǎn)染后的相對螢光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-126 mimic 組低于miR-126 NC 組，證明miR-126 與DKK1 靶向結(jié)合。miR-126 NC 組、miR-126 mimic 組與DKK1 Mut 共轉(zhuǎn)染后的相對螢光素酶活性比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 miR-126與DKK1 mRNA 3＇端的非翻譯區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)

表2 不同轉(zhuǎn)染方式的細(xì)胞相對螢光素酶活性比較 （±s）

表2 不同轉(zhuǎn)染方式的細(xì)胞相對螢光素酶活性比較 （±s）

組別miR-126 NC組miR-126 mimic組t 值P 值DKK1 Wt 1.03±0.11 0.52±0.03 27.013 0.008 DKK1 Mut 1.09±0.02 1.01±0.07 1.236 0.935

2.3 各組RASFs中miR-126和DKK1蛋白相對表達(dá)量比較

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 中miR-126 相對表達(dá)量分別為（1.02±0.02）、（5.09±0.18）、（0.81±0.03）和（3.82±0.06），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.528，P=0.000），miR-126 組高于對照組（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 中DKK1 蛋白相對表達(dá)量分別為（1.02±0.07）、（0.39±0.05）、（3.82±0.06）和（0.91±0.05），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.016，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：DKK1 組高于對照組（P＜0.05）；miR-126 組低于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組RASFs中DKK1蛋白的表達(dá)

2.4 miR-126和DKK1對RASFs增殖的影響

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 的OD 值分別為（0.72±0.06）、（0.59±0.05）、（0.91±0.09）和（0.70±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.361，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：miR-126 組低于對照組（P＜0.05）；DKK1 組高于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。

2.5 miR-126和DKK1對RASFs侵襲的影響

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（65.38±3.62）個(gè)、（31.76±2.54）個(gè)、（119.04±4.27）個(gè)和（62.58±3.77）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.214，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：miR-126 組低于對照組（P＜0.05）；DKK1 組高于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組RASFs侵襲細(xì)胞數(shù) （×400）

2.6 miR-126和DKK1對RASFs凋亡的影響

對照組、miR-126 組、DKK1 組、miR-126+DKK1組RASFs 的凋亡率分別為（5.59±0.53）%、（18.74±1.06）%、（3.61±0.34）%和（10.62±0.99）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.014，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：miR-126 組高于對照組（P＜0.05）；DKK1 組低于對照組（P＜0.05）；miR-126+DKK1 組高于miR-126 組（P＜0.05），但低于DKK1 組（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組RASFs流式細(xì)胞術(shù)圖

3 討論

RA 表現(xiàn)為滑膜增生、炎癥和骨質(zhì)破壞。除關(guān)節(jié)受累外，病程較長的RA 患者還可能有各種關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如間質(zhì)性肺疾病、心血管疾病等，極大地增加了患者和社會(huì)的負(fù)擔(dān)[8]。現(xiàn)階段，RA 的主要治療方法是對癥治療，以及抗炎、免疫抑制、中藥治療[9]，尚無特效根治藥物。因此分析其發(fā)病機(jī)制對于探究新的RA 治療藥物和方法具有重要意義。

RASFs 是維持關(guān)節(jié)正常結(jié)構(gòu)和功能的重要細(xì)胞，也是RA 的主要靶細(xì)胞，抑制其病變是緩解RA的重要方法[10]。RA 中RASFs 會(huì)過度增殖，一方面，大量的RASFs 會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)RA發(fā)展；另一方面，RASFs 也會(huì)侵襲進(jìn)入軟骨甚至骨組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)膨大、活動(dòng)性降低[11-12]。miRNA 可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和生物學(xué)行為[13]。近年來，目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在RA 的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如miR-20a 調(diào)節(jié)RA 中RASFs 增殖和凋亡，促進(jìn)RA 病情進(jìn)展[14]。miR-126 是一種新發(fā)現(xiàn)的RA 相關(guān)miRNA。有研究顯示，RA 患者miR-126 顯著降低，并且miR-126 降低與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[15]。然而，也有研究顯示RA 患者miR-126 升高，目前miR-126在RA 中的意義仍不清楚[16]。本研究結(jié)果表明，RA患者滑膜組織miR-126 相對表達(dá)量降低。為分析miR-126 對RASFs 生物學(xué)行為的影響，利用RA 患者滑膜組織構(gòu)建了原代RASFs，并通過轉(zhuǎn)染提高細(xì)胞中miR-126 表達(dá)，結(jié)果顯示miR-126 會(huì)顯著抑制RASFs 的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡。WANG 等[17]的研究顯示，miR-126 通過VEGF-Notch 信號通路，促進(jìn)青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-126 通過下調(diào)抗凋亡蛋白MCL，誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞系Karpas707 凋亡，抑制增殖[18]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和本研究結(jié)果，提示miR-126 缺失可能會(huì)減少RASFs凋亡并促進(jìn)RASFs 過度增殖和侵襲，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)異常。

DKK1 蛋白通過抑制LRP5/6 與Wnt 的相互作用，以及與促進(jìn)LRP5/6 內(nèi)化來拮抗經(jīng)典的Wnt 通路的信號傳導(dǎo)[19]。DKKs 在脊椎動(dòng)物發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其可局部抑制Wnt 調(diào)節(jié)過程，調(diào)控肢體發(fā)育、體節(jié)發(fā)生和眼睛形成。最新臨床研究顯示，治療后RA 患者血清DKK1 水平降低，并且滑膜組織病變得到緩解[20]；并且DKK1 靶向型siRNA 削弱了RA 中RASFs 活性[21]。此外，DKK1 受到miRNA 的靶向調(diào)節(jié)，miR-BART10-3p 可通過靶向抑制DKK1 水平，抑制細(xì)胞增殖和侵襲[22]。本研究結(jié)果顯示，RA 患者滑膜組織中DKK1 水平顯著高于健康者，其變化趨勢與miR-126 相反。通過預(yù)測和驗(yàn)證，本研究證實(shí)miR126 能夠與DKK 靶向結(jié)合，并抑制DKK1 蛋白的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)DKK1 顯著促進(jìn)RASFs 的增殖和侵襲，并抑制凋亡。此外，過表達(dá)DKK1 顯著緩解miR-126 對RASFs 增殖和侵襲的抑制作用，并緩解miR-126 對RASFs 凋亡的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果提示，RASFs 中miR-126 降低可能會(huì)引起DKK1 蛋白過表達(dá)，而過表達(dá)則可通過靶向抑制DKK1 蛋白，緩解RA 患者RASFs 病變。

然而，本研究也存在不足之處，其中miR-126 在RA 滑膜中的表達(dá)特點(diǎn)仍需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行分析，關(guān)于miR-126 通過靶向DKK1 對RASFs 增殖、分化和氧化應(yīng)激的影響仍需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。綜上所述，miR-126 在RA 滑膜組織中低表達(dá)，miR-126 可通過靶向DKK1，抑制RASFs 增殖、侵襲及凋亡。