白童瑜，吳宿慧

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

消化性潰瘍是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及復(fù)合性潰瘍[1]。消化性潰瘍與胃酸分泌過多、飲食因素以及壓力有關(guān)，會(huì)造成胃、十二指腸的酸性消化而導(dǎo)致黏膜糜爛，目前往往以幽門螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)感染發(fā)病率增高、非甾體抗炎藥的廣泛使用以及酗酒和吸煙為主要誘發(fā)因素[2]。此外在治療不及時(shí)的情況下容易并發(fā)潰瘍穿孔、出血和幽門梗阻，甚至引起潰瘍癌變，嚴(yán)重威脅患者健康[3]。西醫(yī)對(duì)于Hp感染消化性潰瘍患者以四聯(lián)藥物治療為主，雖可在一定程度上減輕相關(guān)癥狀，但卻伴隨Hp耐藥性增高而療效逐漸降低[4-5]。

消化性潰瘍屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“反酸”“嘈雜”“痞滿”等范疇，以規(guī)律性的上腹疼痛、燒心、反酸、惡心、嘔吐、腹脹、黑便等癥狀為主?！鹅`樞·邪氣臟腑病形》云：“胃病者，胃脘當(dāng)心而痛，上支兩脅……取之足三里[6]。”《靈樞·脹論》云：“脾脹者善噦；胃脹者，腹?jié)M胃脘痛。寒氣逆上，真邪相攻，兩氣相搏，乃合為脹也[6]。”首次提出胃脘疼痛、脹滿與脾胃之經(jīng)氣寒凝壅塞不通相關(guān)?！端貑枴ぬ庩柮髡摗穂7]云：“太陰陽明為表里，生病而異者……是以犯賊風(fēng)虛邪者陽受之；食飲不節(jié)起居不時(shí)，陰受之。”陽明胃為水谷之海，脾為胃之使，胃為脾之市，故外犯虛邪賊風(fēng)，內(nèi)傷于飲食勞倦，兩虛相得脾胃乃傷?！秱摗け嫣柌∶}證并治》曰：“但滿而不痛者，此為痞……腹?jié)M而吐……自利不渴者屬太陰，以其臟有寒故也，當(dāng)溫之，宜服四逆輩?！敝赋銎⑽柑摵?，中陽不足則導(dǎo)致脾胃升降不衡，則發(fā)為痞滿，治以四逆輩溫補(bǔ)中焦，如理中湯溫陽散寒并舉，標(biāo)本兼治[8]。

木白散為王國(guó)斌教授辨治消化性潰瘍的自擬經(jīng)驗(yàn)方，方中蓽茇、白術(shù)健運(yùn)脾氣而祛寒，木香、草豆蔻、檳榔、甘松、砂仁醒脾開胃而行氣止痛，以復(fù)脾胃升降之機(jī)能。以中焦虛寒為本、濁瘀阻滯為標(biāo)辨證，臨床取得良好效果，但其作用機(jī)制未明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索的基礎(chǔ)上，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等學(xué)科，具有系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，可以解析藥物與疾病之間的分子關(guān)聯(lián)，進(jìn)行藥物作用機(jī)制的研究并且能夠發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物[9]。而高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中具有真實(shí)臨床樣本基因芯片數(shù)據(jù)，能夠通過篩選差異表達(dá)基因準(zhǔn)確、可靠、高效地反映疾病本質(zhì)特征和規(guī)律[10]。因此本文擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和GEO數(shù)據(jù)庫研究木白散治療消化性潰瘍的作用機(jī)制，為日后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 篩選木白散中藥活性成分以及靶點(diǎn)信息利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選木香、白術(shù)、蓽茇、檳榔、草果、甘松、砂仁、半夏、草豆蔻、白芍、瓦楞子、甘草的活性成分，根據(jù)口服生物利用度OB≥30%，類藥性DL≥0.18為條件篩選有效活性成分，并篩選靶基因信息，其中草豆蔻、瓦楞子的有效活性成分和靶基因運(yùn)用ETCM中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(http：//tcmip.cn/ETCM/index.php)結(jié)合文獻(xiàn)研究進(jìn)行檢索，然后利用Unipront數(shù)據(jù)庫將靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 搜索消化性潰瘍疾病靶基因，獲取藥物-疾病互作基因利用GeneGards 疾病數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM 疾病數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)以“Peptic ulcer”為關(guān)鍵詞篩選消化性潰瘍的疾病靶基因，去除重復(fù)靶基因。利用Venny2.1數(shù)據(jù)庫(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html 2.1) 將藥物靶基因與消化性潰瘍靶基因取交集，繪制韋恩圖，得到藥物-疾病共同基因。

1.3 制作木白散中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖利用篩選好的中藥活性成分、靶基因以及藥物-疾病互作基因，在Cytoscape3.7.2軟件上繪制中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 繪制蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，獲取關(guān)鍵基因利用String平臺(tái)，對(duì)藥物-疾病共同基因進(jìn)行蛋白互作分析，選擇蛋白質(zhì)屬種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence”為0.4，其他參數(shù)選擇默認(rèn)參數(shù)。輸出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，利用Cytoscape3.7.2軟件中CytoNCA進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)度中心性DC、介度中心性BC、接近中心性CC、特征向量中心性EC、局部邊連通性LAC等數(shù)值，其中選DC為2倍中位值，其他選中位值，篩選核心基因。

1.5 進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析利用R3.5.2軟件對(duì)藥物-疾病共同基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，分析結(jié)果篩選q值≤0.05的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，GO數(shù)據(jù)選擇前20組，KEGG選擇前20組，繪制柱狀圖和氣泡圖，并繪制相關(guān)通路的通路圖。

1.6 基于GEO數(shù)據(jù)庫分析基因芯片獲取消化性潰瘍差異基因基于Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)計(jì)算機(jī)檢索，以“Peptic ulcer”為檢索式，選擇“Homo scapiens”人類樣本。通過閱讀摘要，以如下標(biāo)準(zhǔn)選擇：①樣本量20例以上；②正常人作為對(duì)照組；③臨床樣本為血清。使用GEO2R工具，對(duì)GSE60427芯片中mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，采用logFC和adj.P.Val作為篩選條件，并繪制火山圖。

1.7 繪制熱圖和小提琴圖驗(yàn)證部分核心基因的差異表達(dá)提取部分核心基因表達(dá)矩陣的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R軟件的“pheatmap”和“ggpubr”包繪制核心基因的差異表達(dá)熱圖和小提琴圖。在基因表達(dá)數(shù)據(jù)中如果輸入文件的數(shù)值很大，需要對(duì)數(shù)據(jù)取log2。其中熱圖中以“green”和“red”分別代表基因呈低表達(dá)和高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 木白散活性成分結(jié)果通過TCMSP網(wǎng)站篩選出活性成分152個(gè)，相關(guān)靶基因335個(gè)，其中木香6個(gè)、白術(shù)4個(gè)、蓽茇10個(gè)、檳榔7個(gè)、草果5個(gè)、甘松4個(gè)、砂仁8個(gè)、半夏12個(gè)、草豆蔻11個(gè)、白芍8個(gè)、瓦楞子2個(gè)、甘草88個(gè)?？芍景咨⒛軌蛲ㄟ^多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，部分成分信息如表1所示。

表1 木白散部分活性成分信息表

2.2 藥物-疾病互作基因經(jīng)過Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選并去除重復(fù)基因，得到消化性潰瘍靶基因1 015個(gè)。將藥物基因與疾病基因在Venny2.1網(wǎng)站上獲取藥物潛在基因位點(diǎn)92個(gè)，見圖1。

圖1 木白散-消化性潰瘍互作基因韋恩圖

2.3 中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖通過Cytoscape3.7.2繪制中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖2所示。其中木香、砂仁、半夏共有豆甾醇(Stigmasterol)、白芍、半夏、砂仁共有β谷甾醇(beta-sitosterol)、白芍、甘草共有山柰酚(kaempferol)、草果、甘草共有槲皮素(quercetin)、半夏含有黃芩素(baicalein)。

圖2 中藥-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，藥物-疾病核心基因靶點(diǎn)通過CytoHubba插件得到藥物-疾病核心基因PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，篩選出35個(gè)基因?yàn)楹诵幕?，根?jù)GEO基因表達(dá)矩陣分析發(fā)現(xiàn)，核心基因中前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、IL-10、C-C基序趨化因子2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、胞間黏附分子1(cell adhesion molecule1，ICAM1)、血管細(xì)胞黏附蛋白1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)8個(gè)基因?yàn)楹诵幕蛟谙詽兓颊咧胁町惐磉_(dá)，如圖3所示。

圖3 Cytohub篩選核心基因結(jié)果示意圖

2.5 GO基因功能注釋結(jié)果在R4.0.2軟件上進(jìn)行GO功能注釋得到共同基因聚集在生物過程(Biological Process)對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)；細(xì)胞組成(Cell Composition)囊腔(vesicle lumen)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、血小板α顆粒腔(platelet alpha granule lumen)；分子功能(Molecular Function)核受體活性(nuclear receptor activity)、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)抗氧化活性(antioxidant activity)如圖4所示。

圖4 藥物-疾病共同基因GO功能注釋結(jié)果圖

2.6 KEGG富集通路分析結(jié)果木白散-消化性潰瘍疾病基因在R4.0.2軟件上進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果得出互作基因主要富集在MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、NF-κB信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)、IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)，如圖5所示。其中 NF-κB 信號(hào)通路的通路圖信息見圖6。

圖5 藥物-疾病共同基因KEGG富集分析結(jié)果圖

圖6 NF-κB信號(hào)通路示意圖

2.7 消化性潰瘍GEO數(shù)據(jù)差異基因結(jié)果通過GEO2R工具，對(duì)GSE60427芯片中mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍患者中差異基因?yàn)? 822個(gè)。上調(diào)的為1 391個(gè)，下調(diào)的為431個(gè)，如圖7火山圖所示。

圖7 GSE60427芯片消化性潰瘍患者差異基因火山圖

2.8 部分核心基因差異表達(dá)的熱圖和小提琴圖利用R軟件對(duì)提取部分核心基因表達(dá)矩陣的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，繪制熱圖和小提琴圖，發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍患者PTGS2、IL-6、IL-10等部分核心基因顯著高表達(dá)，且P<0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如圖8、圖9所示。

圖8 部分核心基因熱圖

圖9 部分核心基因小提琴圖

3 討論

目前認(rèn)為消化性潰瘍的發(fā)病機(jī)制為藥物損傷、Hp感染等致病因素造成的胃酸、胃蛋白酶對(duì)胃黏膜的侵襲作用與黏膜屏障的防御能力失衡所致[11]。而Hp等侵襲因子引起的IL-1β、TNF-α、IL-17以及IFN-γ等黏膜促炎細(xì)胞因子的增加則會(huì)導(dǎo)致潰瘍的惡化[12]。隨著質(zhì)子泵抑制劑、胃黏膜保護(hù)劑以及抗Hp耐藥的出現(xiàn)，新的研究發(fā)現(xiàn)配合中藥治療不但能夠提高Hp的根除率、促進(jìn)潰瘍的愈合而且能夠降低西藥的耐藥性[13]。

王國(guó)斌教授辨治消化性潰瘍多以中焦虛寒為本，濁瘀阻滯為標(biāo)，根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)在理中湯的基礎(chǔ)上自擬經(jīng)驗(yàn)方木白散，方中蓽茇、白術(shù)健運(yùn)脾氣而祛寒；木香、草豆蔻、檳榔、甘松、砂仁醒脾開胃而行氣止痛以復(fù)脾胃升降之機(jī)能；瓦楞子制酸止痛以化瘀；檳榔消積導(dǎo)滯止痛，以溫中補(bǔ)虛、行氣化濁、理氣止痛、消積除脹，還能夠改善胃脘痛并促進(jìn)潰瘍創(chuàng)傷面的修復(fù)[14]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)服檳榔煎劑則可以通過殺滅Hp，從而切斷Hp的感染途徑，清除Hp對(duì)胃腸黏膜的損傷，使胃黏膜糜爛灶和十二指腸潰瘍?cè)畹靡宰孕行迯?fù)[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)木白散加減聯(lián)合三聯(lián)方案治療消化性潰瘍，可以通過改善炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜厚度及腺體形態(tài)，以促進(jìn)胃黏膜組織修復(fù)，并提高臨床癥狀改善程度和Hp根除率[16]。

通過中藥-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)分析得到，木白散可以通過槲皮素、豆甾醇、β谷甾醇、山柰酚、黃芩素等成分治療消化性潰瘍。研究發(fā)現(xiàn)吲哚美辛可以引起大鼠胃黏膜表面損傷，造成黏膜充血、糜爛以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而槲皮素相對(duì)于法莫替丁能夠阻止吲哚美辛引起的胃潰瘍胃黏膜損傷[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)納米槲皮素能夠通過下調(diào)基質(zhì) MMP-9和NOS-2的表達(dá)以阻斷乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍的氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。研究發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠通過抑制中性粒細(xì)胞積累和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)水平，并改善NO的產(chǎn)生以降低潰瘍指數(shù)，保護(hù)胃黏膜免受損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過降低還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和MPO活性，抑制乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍形成、減少炎癥過程、刺激細(xì)胞抗氧化機(jī)制和增加黏液量[20]。由此可知，木白散可以通過多種成分抑制乙醇等誘導(dǎo)的消化性潰瘍中的炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)胃黏膜免受損傷。

通過PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析篩選，GEO基因表達(dá)矩陣分析發(fā)現(xiàn)，木白散治療消化性潰瘍的靶點(diǎn)可能為PTGS2、IL-6、IFN-γ、MMP-9、CCL2、ICAM1、VCAM1等蛋白。非甾體抗炎藥通過阻斷前列腺素合酶1和合酶2同工酶環(huán)氧合酶的活性抑制前列腺素的合成，最終誘導(dǎo)胃黏膜損傷而導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生，而研究表明PTGS2選擇性抑制劑NS-398能夠?qū)е聺冇系娘@著延遲[21-22]。另有研究表明益氣活血方能夠通過增加消化性潰瘍黏膜組織中的環(huán)氧合酶的活性和前列腺素2的分泌以促進(jìn)消化性潰瘍的愈合[23]。IL-6是一種多功能因子，可以通過中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞釋放各種有害產(chǎn)物、活性氧自由基以及溶酶體等炎癥因子，以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使胃潰瘍中的胃黏膜損傷向愈。研究發(fā)現(xiàn)在遺傳誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型中IL-6表達(dá)水平升高，而氧白藜蘆醇可以抑制IL-6的表達(dá)，從而治療消化性潰瘍[24]。Hp能夠在小鼠胃潰瘍的胃黏膜中觸發(fā)CD+T細(xì)胞反應(yīng)，釋放IFN-γ和其他促炎因子，并且IFN-γ在Hp誘導(dǎo)的胃炎中發(fā)揮重要作用[25]。MMPs能夠選擇性降解胃組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)而調(diào)節(jié)ECM重塑參與胃潰瘍的形成，而活性氧和氮物質(zhì)則能夠通過破壞MMP活化和失活的平衡，參與胃潰瘍?cè)趦?nèi)的多種疾病發(fā)病機(jī)制[26]。另外在乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型中發(fā)現(xiàn)MMP-9的活性增強(qiáng)與小鼠胃黏膜損傷的程度呈正相關(guān)，而作為一種抗炎劑，褪黑素可以通過降低MMP-9的活性發(fā)揮抗?jié)兊淖饔肹27]。通過對(duì)核心靶基因進(jìn)行繪制熱圖和小提琴圖發(fā)現(xiàn)，上述核心基因在消化性潰瘍患者中表達(dá)增高，由此可知木白散可以通過調(diào)節(jié)上述核心基因以抑制炎癥反應(yīng)干預(yù)胃潰瘍的胃黏膜損傷。

通過GO生物功能注釋和KEGG通路富集分析得知，木白散治療消化性潰瘍可能與脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源性分子的反應(yīng)、抗氧化活性等生物學(xué)過程，以及MAPK、NF-κB、IL-17、HIF-1、腫瘤壞死因子等信號(hào)通路有關(guān)?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)能夠?qū)е戮€粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)而損傷胃黏膜細(xì)胞，在胃潰瘍的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。而氧化應(yīng)激能夠通過激活NF-κB、IFN-γ 以及IL-1β等炎癥通路以增強(qiáng)炎癥反應(yīng)損傷細(xì)胞，在吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍研究中發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸能夠通過抑制IFN-γ以及 IL-1β 的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用治療消化性潰瘍[28]。非甾體抗炎藥能夠誘導(dǎo)胃黏膜大鼠胃腺細(xì)胞壞死、胃黏膜彌漫性出血，以及TNF-α、IL-6等炎性因子的增高[29]。IL-17作為一種炎癥因子，能夠募集中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，在許多慢性炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。有研究證明Hp感染后小鼠胃黏膜中IL-17水平升高，而IL-17基因敲除后的小鼠可以免受Hp誘導(dǎo)的胃黏膜損傷[30]。由此可知，預(yù)測(cè)木白散治療消化性潰瘍的生物過程和富集分析通路，涉及通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激防止胃黏膜損傷。

綜上所述，木白散能夠通過山柰酚、槲皮素、黃芩素等成分作用于PTGS-2、IL-6、MMP-9等基因，調(diào)控MAPK、NF-κB、IL-17等信號(hào)通路，抑制炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生，治療消化性潰瘍，其具體調(diào)控機(jī)制尚待實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。