張凱波，李桓，王鎖剛

1.蘭考縣中醫(yī)院，河南 蘭考 475300；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是由于前列腺移行區(qū)和尿道周圍區(qū)域的上皮和纖維肌組織增生，導致前列腺良性增大[1]。本病常見于老年男性，隨著老齡化社會的到來，BPH已成為嚴重影響老年男性生活質量的疾病之一[2]。BPH主要表現(xiàn)為前列腺體積增大、膀胱出口梗阻，出現(xiàn)以下尿路癥狀為主的臨床癥狀[3-4]。目前治療BPH多采用手術及藥物治療，如α受體阻滯劑、5α還原酶抑制劑等[5]，雖然能緩解癥狀，但性欲障礙、失眠等藥物不良反應嚴重。

BPH屬于中醫(yī)學“癃閉”的范疇，早在《黃帝內經》中就有關于本病的論述，如《素問·宣明五氣》就有“膀胱不利為癃”的相關記載。該病主要因膀胱氣化不利，病位在腎和膀胱[5]。五苓散出自《傷寒雜病論》，是治療太陽蓄水證的經典名方，由茯苓、豬苓、白術、桂枝和澤瀉5味藥組成，具有利水滲濕、溫陽化氣之功效[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)五苓散能縮小增大的前列腺，明顯改善BPH患者排尿功能[7-11]，但其具體作用機制不詳，嚴重阻礙了該方的臨床使用。

網絡藥理學可以整合多個數(shù)據(jù)庫的資源，通過構建“藥物-靶點-疾病”之間的網絡關系，進而闡釋藥物作用靶點與疾病靶點關系，揭示中藥有效成分的生物學作用，從微觀層面到宏觀層面揭示藥物治療疾病的機制，與中醫(yī)學所闡述的整體理念一致[12-13]。本研究通過網絡藥理學及分子對接技術研究五苓散治療BPH的作用機制，為五苓散治療BPH的基礎研究和臨床應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集五苓散有效成分及其作用靶點在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(https：//tcmsp-e.com/)分別檢索茯苓、豬苓、白術、桂枝和澤瀉的化學成分信息。再通過生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選出五苓散中所有藥物的有效成分及有效成分作用靶點，并構建“中藥-化合物-靶點”網絡圖。

1.2 BPH疾病靶點獲取以“benign prostatic hyperplasia”為關鍵詞，使用DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)、GeneCards(http：//www.genecareds.org/)、OMIM(http：//www.omim.org/)以及TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)等與疾病相關的數(shù)據(jù)庫中分別獲取BPH的靶點，去重后即為疾病的相關靶點。

1.3 五苓散治療BPH的靶點獲取將五苓散有效成分的靶點與疾病的靶點進行韋恩(Veen)分析，取交集后獲得共有基因，即為五苓散可能作用于BPH的相關靶點，并繪制中藥-成分-靶點-疾病網絡圖。

1.4 五苓散治療BPH的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建將1.3項下獲得的靶點上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https：//www.string-db.org/)，設置種屬為“Homo sapiens”，隱藏游離節(jié)點，進行PPI網絡圖的構建，運用Cytoscape 3.8.2對PPI網絡圖進一步分析和優(yōu)化。

1.5 基因功能(gene ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集運用R軟件進行GO和KEGG通路富集分析，并通過氣泡圖將結果可視化，氣泡越大，代表富集的基因數(shù)量越多；顏色越深，代表富集的顯著性更強。

1.6 分子對接通過PDB(http：//www.rcsb.org/)、Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網站和ChembioOffice、PyMOL、Autodocktools、Vina軟件，運用分子對接技術驗證關鍵靶點蛋白與化學有效成分的結合能力。

2 結果

2.1 五苓散有效成分收集、篩選及相關靶點獲取結果通過1.1項下的數(shù)據(jù)庫平臺，經檢索及條件篩選，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，獲得五苓散組方中的化學有效成分共計64個(桂枝7個，白術7個，豬苓11個，茯苓15個，澤瀉10個)。再次利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的靶點預測功能，經過數(shù)據(jù)篩選找到其對應的靶點蛋白，刪除重復和無效值，得到64個五苓散藥物作用靶點。將五苓散藥物、藥物有效成分及靶點導入至Cytoscape 3.8.2中，構建五苓散化學有效成分及預測靶點的關系網絡圖，如圖1所示。

圖1 中藥—化合物—靶點網絡圖

2.2 疾病作用靶點獲取結果通過1.2項下的疾病靶點數(shù)據(jù)庫，綜合各數(shù)據(jù)庫所獲靶點后去重，最終獲取BPH的相關靶點3 951個。與五苓散的靶點進行匹配，構建“藥物-疾病”靶點韋恩圖，得到共有靶點46個，如圖2所示。并構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡圖，見圖3。

圖2 藥物預測靶點與疾病靶點的韋恩圖

圖3 中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖

2.3 蛋白相互作用網絡構建結果運用String在線數(shù)據(jù)庫，輸入五苓散與BPH交集基因，獲得PPI網絡，將獲得數(shù)據(jù)導入Cytoscape，將PPI網絡圖進行可視化(見圖4)。該圖由46個節(jié)點和200條邊構成，其中節(jié)點大小、顏色深淺、連線疏密，代表靶點地位的重要性，分析得到度值前10位的核心基因：AR、ESR1、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3、HSP90AA1、RELA、CAT、NR3C1。

圖4 PPI蛋白互作網絡圖

2.4 五苓散治療BPH關鍵靶點GO生物學過程富集分析結果為獲得關鍵靶點蛋白的生物作用，對交集靶點進行GO生物學功能富集分析，發(fā)現(xiàn)關鍵靶點在2 899個條目上富集，包括2 436個生物過程(biological process，BP)、174條細胞組分(cellular component，CC)和289條分子功能(molecular function，MF)。BP結果顯示可能與類固醇激素反應、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程和應對雌二醇等生物學過程相關；CC的結果表現(xiàn)可能與膜筏、膜微區(qū)及膜區(qū)等密切相關；而MF結果表明可能與G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、乙酰膽堿受體的活動和核受體的活動等有關。圖5展示了BP、CC和MF各前10位GO分析的結果。

圖5 關鍵靶點GO富集分析

2.5 五苓散治療BPH關鍵靶點的KEGG通路富集分析結果為獲得關鍵靶點所富集的通路，對關鍵靶點進行KEGG通路分析，結果顯示五苓散治療BPH的關鍵靶點在211條通路上富集，其中包括雌激素信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、膽堿能突觸、化學致癌-受體激活、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、鈣信號通路等通路，圖6為KEGG富集分析結果前20位的氣泡圖。其中，在PPI網絡中位于核心基因的AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3等涉及前20位的多條通路(圖7)，表明AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3可能為五苓散治療BPH的關鍵靶點。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖7 KEGG和弦圖

2.6 活性成分與核心靶點的分子對接結果通過分子對接技術探討五苓散的主要活性成分是否通過關鍵靶點AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3、HSP90AA1、CAT和NR3C1發(fā)揮治療BPH作用。從數(shù)據(jù)庫中獲取關鍵靶點的晶體結構，并下載PDB Formant格式文件，運用AutoDock4.2.6軟件將化合物及靶點蛋白逐一進行分子對接(見表1)。由表2可知，五苓散所含的小分子化合物與關鍵靶蛋白對接能都小于-5.0 kcal·mol-1，說明結合較好。借助Pymol2.5.0軟件對β-谷甾醇(MOL000358)與AR、ESR1進行分子對接可視化(圖8)。

圖8 分子對接模式圖

3 討論

BPH屬于中醫(yī)“癃閉”范疇，癃閉之名最早見于《黃帝內經》?！鹅`樞·五味》曾記載：“酸走筋，多食之，令人癃?！薄端貑枴の宄Ｕ笳摗吩唬骸捌洳●]，邪傷腎也?！敝赋鲴]的病位在膀胱，認為其病機主要是膀胱和三焦的氣化不利?！秱s病論》提出用通陽化氣方五苓散治療癃閉?！秱摗泛汀督饏T要略》指出該方原為治療蓄水證，注重化氣行水，氣助水行，陽氣宣通，正如葉天士曰：“通陽不在溫，而在利小便[14]?！彪S著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，五苓散在中醫(yī)臨床辨證施治的理論指導下，臨床應用更加廣泛，不僅局限于腫脹利水等方面，在消化、血栓、關節(jié)炎、腎病及皮膚疾病等的治療中亦有重要意義[15-19]，但其藥方的開發(fā)與研究進展較慢，作用機制尚不明確。中醫(yī)理論通過生物信息學工具，可以從多成分、多靶點角度揭示中藥作用機制，對中醫(yī)藥未來的發(fā)展產生新的改變[12]。本研究在中醫(yī)理論指導下，基于五苓散成分靶點和BPH靶點預測、藥物-成分-靶點網絡構建、Hub節(jié)點PPI網絡構建、五苓散作用于BPH的核心靶點的GO富集分析和KEGG富集分析相結合的網絡藥理學方法，借助相關軟件和數(shù)據(jù)庫，從化合物分子角度進一步預測和闡明了五苓散治療BPH的作用機制。

通過在TCMSP平臺收集五苓散的5味中藥，得到hederagenin、Cerevisterol、ergosta-7，22E-dien-3beta-ol、ent-Epicatechin、beta-sitosterol、(+)-catechin、taxifolin、sitosterol、Alisol B monoacetate、1-Monolinolein、ergosta-7，22-diene-3β-ol、ergosta-5，7，22-trien-3-ol等46個主要成分[6]，其中17個主要成分對應46個疾病靶點，網絡拓撲分析獲得五苓散治療BPH的10個核心靶點，包括ESR1、RELA、AR、CAT、NR3C1、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3等，為了更加明確五苓散治療BPH的生物學過程、細胞功能和分子組成，對10個核心靶點進行GO分析，這些靶點主要涉及類固醇激素反應、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程和應對雌二醇等生物學過程、膜筏、膜微區(qū)及膜區(qū)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、乙酰膽堿受體的活動和核受體的活動等生物過程。細胞組分方面，主要集中在G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、乙酰膽堿受體和核受體的活動等生物過程中。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)核心靶點對應的相關通路包括脂質和動脈粥樣硬化、膽堿能突觸、化學致癌-受體激活、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、鈣信號通路、雌激素信號通路、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、凋亡-多種物種、弓形體病、含血清素的神經突觸、甲狀腺激素信號通路、神經退行性變的途徑-多種疾病、結腸直腸癌、細胞凋亡、麻疹、刺激神經組織的交互、EB病毒感染等信號通路。為了驗證網絡藥理學的推測，本研究選取五苓散的關鍵藥效物質進行分子對接，對接結果顯示，所有對接結合能均小于-5.0 k·mol-1。表明雄激素受體(androgen receptor，AR)、雌激素受體(estrogen receptor，ESR1)均與beta-sitosterol(β-谷甾醇)對接較好，由此可見五苓散的關鍵藥效物質與BPH核心靶點蛋白能夠穩(wěn)定結合，驗證了網絡藥理學關于五苓散作用機制的預測。

BPH發(fā)病機制復雜，關于激素誘導、老年發(fā)病、上皮-間質轉化理論以及炎癥/生長因子發(fā)病等理論較多[20]。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇對增生的前列腺組織在病理形態(tài)上具有一定的改善作用，并且對丙酸睪酮所致的BPH模型小鼠具有一定的治療作用[21-23]。ESR1、AR與BPH密切相關[24-26]。睪酮是男性體內重要的雄激素，可與AR結合從而具有生物活性，可以調節(jié)前列腺上皮細胞和基質細胞的增殖與分化[27]。Asiedu等[28]通過收集健康對照組和BPH患者血液樣本，檢測后發(fā)現(xiàn)BPH患者的血液樣本中雄甾烷二醇、雄烯二酮以及游離睪酮的含量均較正常男性顯著降低，但雙氫睪酮的含量卻顯著增加。其機制可能是在5α-還原酶作用下，雄激素轉化為雙氫睪酮，在芳香化酶的作用下轉化為雌二醇，導致前列腺上皮和基質細胞增殖、分裂，促進BPH的發(fā)病[29]。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素也參與調節(jié)男性的生殖系統(tǒng)，男性睪丸產生大約30%雌激素，雌激素在睪丸的間質和上皮細胞中發(fā)揮重要作用，可見雄激素/雌激素二者的平衡對男性BPH的發(fā)生發(fā)展至關重要[30]。Chen等[31]也發(fā)現(xiàn)ESR1在BPH患者的前列腺組織中呈區(qū)域依賴性表達，雌激素能促進前列腺的基質細胞增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五苓散中有效成分可能作用于BPH的關鍵靶點ESR1和AR，通過升高雌激素水平，降低前列腺和血清中睪酮和雙氫睪酮濃度，調節(jié)雌激素/雄激素的平衡，抑制前列腺中上皮和基質細胞生長、增殖，從而治療BPH[23，32-33]。但由于網絡藥理學自身的局限性，未來將采取基礎研究的方法進一步探討五苓散治療BPH的作用機制，為五苓散治療BPH提供更客觀的證據(jù)。