張俊霞，晁利芹，王付

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

抑郁癥是一種嚴(yán)重危害人類健康的精神情感障礙性疾病[1]，臨床常表現(xiàn)為情緒低落、反應(yīng)遲鈍、思維活動(dòng)減退、失眠等精神癥狀，其病位主要在腦部?，F(xiàn)代研究表明，抑郁癥與諸多因素相關(guān)，如炎性因子分泌、神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)異常、神經(jīng)細(xì)胞通路改變、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)持續(xù)紊亂、腸道菌群改變、線粒體結(jié)構(gòu)異常等[2-4]。目前，西醫(yī)治療主要以服用抗抑郁藥物為主，短期療效尚可，但長期服用不良反應(yīng)較多[5-6]。

抑郁癥作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名詞，在中醫(yī)學(xué)歸屬于“郁病”范疇。近年來，隨著中醫(yī)藥在抑郁癥方面的深入研究，越來越多研究證實(shí)中藥、中藥復(fù)方可通過多靶點(diǎn)、多機(jī)制、多途徑來調(diào)節(jié)并改善抑郁癥[7-9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦為髓之海，腎為生髓之器，腦部疾病采用補(bǔ)腎之法，療效顯著。宋代錢乙的六味地黃丸作為補(bǔ)腎經(jīng)典方劑具有“三補(bǔ)與三瀉”的特點(diǎn)，熟地黃、山藥、山茱萸補(bǔ)則益精填髓、滋水涵木，牡丹皮、澤瀉、茯苓瀉則平肝、疏肝、柔肝[10-11]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，構(gòu)建“藥物活性成分-潛在作用靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，探究六味地黃丸治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 六味地黃丸藥物活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)篩選采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索六味地黃丸組方中熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≧30%、類藥性(drug likeness，DL)≧0.18、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)≧-0.3為條件對(duì)所獲得的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，得到符合條件的活性成分。運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、BABEL軟件、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)、SEA在線平臺(tái)(http：//sea.bkslab.org/)預(yù)測(cè)活性成分的相應(yīng)靶點(diǎn)，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：// www.uniprot.org/)將得到的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行名稱規(guī)范整理[12-14]。

1.2 六味地黃丸治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/)獲取抑郁癥的疾病靶點(diǎn)，并運(yùn)用Venn Diagram平臺(tái)(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)六味地黃丸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)及抑郁癥疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到交集靶點(diǎn)，即為六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)輸入 STRING數(shù)據(jù)庫(https：//STRING-db.org/)，物種限定為人，設(shè)定置信度閾值≥0.9。將結(jié)果中的 node 1、node 2 數(shù)據(jù)信息輸入 Cytoscape 3.2.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析并構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù) PPI 網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(node)度值(degree)的大小，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 FunRich功能富集分析將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)輸入FunRich軟件，物種限定為人，設(shè)定P值≤0.01，進(jìn)行功能富集分析。

1.5 “藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)與六地黃丸相關(guān)活性成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)，導(dǎo)入 Cytoscape 3.2.1 軟件，構(gòu)建“藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選出關(guān)鍵成分[15-16]。

1.6 分子對(duì)接應(yīng)用DockThor軟件將PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值首位的靶點(diǎn)蛋白分別與六味中藥中拓?fù)浞治鰠?shù)首位的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證(如果拓?fù)鋮?shù)中的首位活性成分在PubChem 數(shù)據(jù)庫無法得到三維結(jié)構(gòu)，將依序順接選擇相應(yīng)活性成分)。從RCSB PDB 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http：// www.rcsb.org/ pdb/home/home.do)獲得靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)，并從PubChem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得活性分子化合物的三維結(jié)構(gòu)，采用DockThor平臺(tái)(https：// dockthor.lncc.br/v2/)對(duì)靶點(diǎn)蛋白和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能值 (affinity)，數(shù)值越小結(jié)合力越強(qiáng)。將所得結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件，進(jìn)行可視化繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸活性成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)通過TCMSP獲得六味地黃丸化學(xué)成分508個(gè)，其中熟地黃76個(gè)，山藥71個(gè)，山茱萸226個(gè)，牡丹皮55個(gè)，澤瀉46個(gè)，茯苓34個(gè)。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3為條件進(jìn)行篩選后，獲得六味地黃丸活性成分40個(gè)，其中熟地黃2個(gè)，山藥12個(gè)，山茱萸14個(gè)，牡丹皮3個(gè)，澤瀉3個(gè)，茯苓6個(gè)。運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫、BABEL軟件、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫、SEA平臺(tái)得到活性成分相關(guān)靶點(diǎn) 3 706 個(gè)，其中熟地黃200個(gè)，山藥1 100個(gè)，山茱萸1 303個(gè)，牡丹皮203個(gè)，澤瀉300個(gè)，茯苓600個(gè)。

2.2 六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取抑郁癥疾病靶點(diǎn)1 478個(gè)。運(yùn)用Venn Diagram平臺(tái)對(duì)六味地黃丸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)與抑郁癥疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到抑郁癥疾病靶點(diǎn)與六味地黃丸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)38個(gè)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將抑郁癥疾病靶點(diǎn)與六味地黃丸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING數(shù)據(jù)庫中獲取靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件繪制 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)圖共有38個(gè)節(jié)點(diǎn)和101條邊，其中圓形表示蛋白質(zhì)，圓形內(nèi)為蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)，邊代表蛋白之間的關(guān)聯(lián)。篩選出重要的子網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)拓?fù)鋮?shù)篩選得到絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)為首位關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖1、圖2及表1。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)子網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)拓?fù)浞治鰠?shù)

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)主要靶點(diǎn)的子網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將六味地黃丸治療抑郁癥的潛在作用靶點(diǎn)與六地黃丸相關(guān)活性成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)，導(dǎo)入 Cytoscape 3.2.1 軟件，構(gòu)建“藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并進(jìn)行拓?fù)浞治龊Y選出關(guān)鍵成分。見表2。

表2 “藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰠?shù)

2.5 富集分析將38個(gè)交集靶點(diǎn)輸入FunRich軟件進(jìn)行功能富集分析，得到生物過程13個(gè)，包括蛋白質(zhì)代謝、新陳代謝、能量途徑、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、核酸酶調(diào)控、核苷、核苷酸和核酸代謝、基因表達(dá)調(diào)控、骨重建、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路、激素代謝、轉(zhuǎn)錄；細(xì)胞組分37個(gè)，主要包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等；分子功能15個(gè)，主要包括轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、氧化還原酶活性等；通路有319條，主要包括Cdc42活性調(diào)節(jié)通路、質(zhì)膜雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)通路等。見圖3-圖6。

圖3 生物過程富集分析圖

圖4 細(xì)胞成分富集分析圖

圖5 分子功能富集分析圖

圖6 生物通路富集分析圖

2.6 分子對(duì)接將靶點(diǎn)蛋白MAPK3分別與六味中藥拓?fù)浞治鰠?shù)值首位的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。若結(jié)合能<0，表明配體分子能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合；結(jié)合能<-5.0 kJ·mol-1，表明其結(jié)合性好，結(jié)合能越小對(duì)接越好[17]。采用PyMOL軟件做可視化處理。黃色虛線代表氫鍵，與氫鍵結(jié)合的氨基酸處理成紅色。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，化合物均穩(wěn)定地位于對(duì)接口袋內(nèi)。豆固醇與活性位點(diǎn)附近的氨基酸PRO-347形成氫鍵結(jié)合到MAPK3。薯蕷皂苷與活性位點(diǎn)附近的3個(gè)氨基酸ASN-138、GLU-171、ARG-78形成氫鍵結(jié)合到MAPK3。丁子香萜與活性位點(diǎn)附近的2個(gè)氨基酸GLU-328、ARG-15形成氫鍵結(jié)合到MAPK3。[(1S，3R)-1-[(2R)-3，3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R，8S，9S，10S，11S，14R)-11-hydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-3-oxo-1，2，5，6，7，9，11，12，15，16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate與活性位點(diǎn)附近的3個(gè)氨基酸LYS-328、ARG-38、ARG-78形成氫鍵結(jié)合到MAPK3。麥角甾烷-7，22-二烯-3β-醇與活性位點(diǎn)附近的氨基酸PRO-347形成氫鍵結(jié)合到MAPK3。見表3、圖7。

表3 六味地黃丸活性成分與MAPK3的分子對(duì)接結(jié)果

注：A-F：熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓中的活性成分與MAPK對(duì)接圖；藍(lán)色線條：化合物分子；紅色線條：與化合物相連的氨基酸；虛線：化合物與蛋白質(zhì)相連的氫鍵圖7 重要活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

3 討論

近年來，關(guān)于六味地黃丸臨床應(yīng)用研究的探討逐漸引起關(guān)注[18-21]，多圍繞在抗炎、抗氧化應(yīng)激、抑制PKC活性、調(diào)節(jié)多元醇通路、改善細(xì)胞損傷等方面[22-25]，關(guān)于六味地黃丸抗抑郁的作用機(jī)制研究較少。目前，抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，而六味地黃丸復(fù)方成分復(fù)雜。為全面了解六味地黃丸治療抑郁癥的作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討六味地黃丸治療抑郁癥的作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸的活性成分40個(gè)，治療抑郁癥的相關(guān)靶點(diǎn)38個(gè)，充分證明了六味地黃丸治療抑郁癥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。六味地黃丸治療抑郁癥的潛在靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有38個(gè)節(jié)點(diǎn)、101條邊，各靶點(diǎn)間存在多種相互作用，其中靶點(diǎn)的自由度越大，表明六味地黃丸通過該靶點(diǎn)治療抑郁癥的可能性越大，根據(jù)拓?fù)鋮?shù)篩選得到MAPK3為首位關(guān)鍵靶點(diǎn)。根據(jù)“藥物活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析得出，熟地黃主要作用成分是豆固醇、谷固醇；山藥關(guān)鍵作用成分是薯蕷皂苷、異巖藻糖甾醇、豆固醇、山酮C、海風(fēng)藤酮、玉蘭脂素B、山蒟醇、蓽茇寧等；山茱萸主要有效成分為2，6，10，14，18-五甲基肼-2，6，10，14，18-五烯、康努達(dá)尼酮、亞麻酸乙酯、豆甾醇、鄰苯二甲酸二異辛酯、谷甾醇、β-谷甾醇等；牡丹皮的主要有效成分是丁子香萜、谷甾醇；澤瀉主要的有效成分是[(1S，3R)-1-[(2R)-3，3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R，8S，9S，10S，11S，14R)-11-hydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-3-oxo-1，2，5，6，7，9，11，12，15，16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate、乙酰澤瀉醇B、谷甾醇；茯苓的主要有效成分是麥角甾烷-7，22-二烯-3β-醇、麥角甾醇過氧化物、3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛脂烯-21-油酸、去氫齒孔酸、常春藤皂甙元、氫化松苓酸。以上結(jié)果可以看出，熟地黃、山藥、山茱萸均含有有效成分豆固醇，熟地黃、山茱萸、牡丹皮、澤瀉均含有有效成分谷固醇，與已有研究結(jié)果一致[26]。推測(cè)這些含有相同成分的中藥可能具有中藥配方的協(xié)同作用，其他中藥可能發(fā)揮相使作用。六味地黃丸組方中每味中藥的重要成分與MAPK3進(jìn)行分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、澤瀉、茯苓的中藥活性成分與MAPK3的結(jié)合能均小于-7.0 kJ·mol-1，表明六味地黃丸組方中藥中的活性成分能高效結(jié)合抑郁癥的靶點(diǎn)，從而發(fā)揮治療作用。

通過FunRich軟件對(duì)六味地黃丸治療抑郁癥的38個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析得出，六味地黃丸治療抑郁癥參與的生物過程有13個(gè)，包括神經(jīng)遞質(zhì)代謝，信號(hào)傳導(dǎo)，能量通道、運(yùn)輸、細(xì)胞通訊，蛋白質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)核酸堿基、核苷、核苷酸和核酸代謝，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳，骨重塑，G蛋白耦合的受體蛋白信號(hào)通路，激素代謝、轉(zhuǎn)錄；信號(hào)通路319條，主要包括Cdc42活性調(diào)節(jié)通路，Cdc42信號(hào)，細(xì)胞膜雌激素受體信號(hào)等；細(xì)胞成分37個(gè)，主要包括胞質(zhì)，胞質(zhì)膜等；分子功能15個(gè)，主要包括轉(zhuǎn)錄因子活性，轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，氧化還原酶活性等。

研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的發(fā)生可能與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)[27-28]，患者腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分泌不足導(dǎo)致自主神經(jīng)功能嚴(yán)重失調(diào)。神經(jīng)遞質(zhì)主要有5-HT、NE、DA等單胺類和GABA、谷氨酸等氨基酸類，是維持神經(jīng)回路的物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。本課題研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸治療抑郁癥的生物過程含有神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步揭示了六味地黃丸治療抑郁癥的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了一定理論依據(jù)，同時(shí)為中醫(yī)藥治療抑郁癥疾病提供了新思路。