王秀萍，葉太生，艾望，周珍，張瑩雯

1.武漢大學中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071；2.武漢大學，湖北 武漢 430000

乳腺癌是威脅女性健康最常見的惡性疾病之一，近幾年在我國的發(fā)病率快速上升，每年新發(fā)患者數(shù)居全球第一[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organizatio，WHO)統(tǒng)計，全球每年約有140萬名新發(fā)乳腺癌患者[2]。中醫(yī)認為，惡性腫瘤的發(fā)生與正氣不足、癌毒邪氣趁虛入侵密切相關(guān)。導師張瑩雯教授長期從事惡性腫瘤的臨床基礎(chǔ)研究，依據(jù)其多年的臨床經(jīng)驗，總結(jié)出治療乳腺癌的經(jīng)驗方復方開口箭合劑，臨床使用效果良好。雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等多方面均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究擬考察復方開口箭合劑體內(nèi)抑制乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移作用及其對mTOR表達的影響，進一步探討其抑制乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移的作用機制。

1 材料

1.1 動物及細胞株6周齡SPF級雌性BALB/C小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。小鼠飼養(yǎng)于武漢大學中南醫(yī)院SPF級動物實驗中心，環(huán)境溫度20～26 ℃，濕度60%～70%，光照 12 h。4T1高轉(zhuǎn)移小鼠乳腺癌細胞株(簡稱：4T1細胞株)，由武漢大學腫瘤病理實驗中心贈送。

1.2 藥物與試劑開口箭、茯苓、黃芪、伸筋草、絲瓜絡(luò)、昆布、浙貝母、白花蛇舌草、三棱、水蛭、郁金、夏枯草、莪術(shù)、紅藤、蒲公英、皂角刺(武漢大學中南醫(yī)院草藥房)；依維莫司(美國MCE公司，貨號：HY-10218)。Trizol試劑(美國ambion公司，貨號：15596026)；SYBR Green PCR試劑盒(美國KAPA Biosystems公司，貨號：KM4101)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKARA 公司，貨號：639505)；DNase I(加拿大Fermentas公司，貨號：EN0521)；DEPC處理水(武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，貨號：PAB180005)；氯仿、異丙醇、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10006818、80109218、10009218)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 儀器SW-CJ-2D型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；MLS-3781L-PC型高壓滅菌鍋(日本 Panasohic公司)；微量移液槍(各種型號，美國 Rainin PiPet-Lite公司)；G80F20CN1L-DG(W0)型微波爐(廣東格蘭仕集團有限公司)；Centrifuge 5424 R型離心機(德國 Eppendorf公司)；T100-Thermal Cycler型PCR儀、CFX-96型熒光定量PCR儀、DYC-31D型水平電泳設(shè)備、Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；DHG-924385-III型恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；HH-W600型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市國旺儀器制造有限公司)；XW-80A型微型渦旋混合儀(上海青浦瀘西儀器廠)；ULUPURE 型優(yōu)普特實驗室超純水儀(法國 MilliPORE公司)；DHP-9052型37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(上海齊欣科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備按量稱取復方開口箭合劑各藥材，生藥浸水1 h，煮沸40 min，過濾后的藥渣再次加水煮沸，合并2次煎煮液，水浴濃縮為最終濃度分別是1.5 g·mL-1、3 g·mL-1、6 g·mL-1的復方開口箭合劑溶液，置4 ℃冰箱備用。

2.2 模型制備、分組與給藥60只BALB/C小鼠隨機分為空白對照組、模型組、依維莫司組及復方開口箭合劑高、中、低劑量組，每組10只。取對數(shù)生長期的4T1細胞制備成細胞密度為1×106mL-1的細胞懸液，除空白對照組外，其余組小鼠均乳墊下接種50 μL細胞懸液，建立乳腺癌模型[3-4]，空白對照組乳墊下注射等量生理鹽水。以注射部位出現(xiàn)肉眼可見或可觸及不規(guī)則結(jié)節(jié)為造模成功。造模成功次日開始給藥，復方開口箭合劑高、中、低劑量組分別以10 mL·kg-1的體積灌胃給予濃度為6 g·mL-1、3 g·mL-1、1.5 g·mL-1的復方開口箭合劑溶液，空白對照組及模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每日1次；依維莫司組腹腔注射2 mg·kg-1的依維莫司，每周2次[5]。

2.3 瘤質(zhì)量及抑瘤率檢測給藥7 d后，各組隨機選取5只小鼠處死，取原位瘤(空白對照組小鼠取乳腺組織，排除原發(fā)性腫瘤對數(shù)據(jù)造成的影響)，稱其質(zhì)量。其余小鼠給藥14 d后處死，取原位瘤，稱其質(zhì)量。各組小鼠的瘤質(zhì)量取平均值，計算抑瘤率。

抑瘤率(%) = (模型組瘤質(zhì)量-實驗組瘤質(zhì)量) /模型組瘤質(zhì)量×100%[6]

2.4 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率檢測各組小鼠分兩批分別于給藥7 d和給藥14 d后處死，取肺組織，經(jīng)體積分數(shù)4%多聚甲醛固定48 h后連續(xù)切片，顯微鏡下觀察肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)情況，計數(shù)結(jié)節(jié)數(shù)目，取各組平均值計算肺轉(zhuǎn)移抑制率。

肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)=(模型組結(jié)節(jié)數(shù)-治療組結(jié)節(jié)數(shù))/模型組結(jié)節(jié)數(shù)×100%[7]

2.5 瘤組織mTORmRNA測定采用RT-PCR測定乳腺原位瘤組織mTORmRNA的表達水平。取瘤組織100 mg于研磨器內(nèi)，研磨后倒入含1 mL Trizol的勻漿管中，勻漿 20 s，待其充分混勻后放于冰上靜置5 min，12 000 r·min-1離心10 min。取上清，加入氯仿200 μL，混勻后于4 ℃靜置2 min，12 000 r·min-1離心10 min；取上清，加入約 0.5 mL 異丙醇，混勻后于4 ℃靜置15 min，12 000 r·min-1離心15 min，棄上清；沉淀物中加入預冷的75%乙醇 1 mL 進行洗滌，7 500 r·min-1離心5 min，棄上清，重復洗滌一次，室溫干燥約10 min，即為提取出的RNA；在管中加入DEPC水40 μL，使RNA充分溶解。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴增體系：SYBR Green Mix預混液 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O補至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸25 s，進行39個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，計算目的基因的表達水平。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 復方開口箭合劑對乳腺原位癌生長的影響瘤質(zhì)量檢測結(jié)果表明：空白對照組小鼠均未發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腫瘤。與給藥7 d后比較，給藥14 d后，模型組及復方開口箭低劑量組小鼠的瘤質(zhì)量顯著增加(P<0.05)；依維莫司組及復方開口箭合劑中、高劑量組小鼠的瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組小鼠的瘤質(zhì)量均顯著降低(P<0.05)。與依維莫司組比較，給藥7 d后，復方開口箭合劑低、中劑量組小鼠的瘤質(zhì)量均顯著升高(P<0.05)；給藥14 d后，復方開口箭合劑高劑量組小鼠的瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，而復方開口箭合劑低、中劑量組小鼠的瘤質(zhì)量均顯著升高(P<0.05)。與復方開口箭合劑高劑量組比較，復方開口箭合劑中、低劑量組小鼠瘤質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)。與復方開口箭合劑中劑量組比較，復方開口箭合劑低劑量組小鼠瘤質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)。抑瘤率檢測結(jié)果表明：給藥7 d后，各組的抑瘤率范圍為 6.67%～18.67%；給藥14 d后，各組的抑瘤率均有所提高，范圍為14.44%～47.78%。見表2。

表2 各組小鼠乳腺原位瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

3.2 復方開口箭合劑對乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)檢測表明：空白對照組小鼠乳腺癌未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。與給藥7 d后比較，給藥14 d后模型組及復方開口箭合劑中、低劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)顯著增加(P<0.05)，復方開口箭合劑高劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，給藥7 d和14 d后依維莫司組與復方開口箭合劑高、中劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少(P<0.05)；給藥14 d后，復方開口箭合劑低劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少(P<0.05)。與依維莫司組比較，復方開口箭合劑高劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少(P<0.05)，而復方開口箭合劑中、低劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)增加(P<0.05)；與復方開口箭合劑高劑量組比較，復方開口箭合劑中、低劑量組小鼠肺組織中轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)增加(P<0.05)。肺轉(zhuǎn)移抑制率檢測結(jié)果表明：給藥7 d后，各組小鼠的肺轉(zhuǎn)移抑制率范圍為1.61%～14.52%；給藥14 d后，各組的肺轉(zhuǎn)移抑制率均有所提高，范圍為6.82%～38.64%。見表3。

表3 各組小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率

3.3 復方開口箭合劑對乳腺原位瘤組織mTORmRNA表達的影響與給藥7 d后比較，給藥14 d后，依維莫司組及復方開口箭合劑高、低劑量組小鼠乳腺原位瘤組織內(nèi)mTORmRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)；與空白對照組比較，模型組及各給藥組小鼠乳腺原位瘤組織內(nèi)mTORmRNA的表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組小鼠乳腺原位瘤組織內(nèi)mTORmRNA的表達水平均顯著降低(P<0.05)。與依維莫司組比較，給藥7 d后，復方開口箭合劑各劑量組小鼠乳腺原位瘤組織內(nèi)mTORmRNA的表達水平均顯著升高(P<0.05)；給藥14 d后，復方開口箭合劑中、低劑量組小鼠乳腺原位瘤組織內(nèi)mTORmRNA的表達水平均顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 小鼠原位瘤組織內(nèi)mTOR mRNA相對表達情況

4 討論

乳腺癌屬于中醫(yī)學“乳疽”“乳巖”“乳核”等范疇。公元350年，東晉·葛洪在石廱上記載：“乳中隱核、不痛不癢、底結(jié)腫堅如石……”，隋代《諸病源候論·乳石癰候》中記述：“石癰之狀，微強不甚大，不赤微痛癢……但結(jié)核如石”，均概述了本病的特征。中醫(yī)認為，乳腺癌的病因病機主要為正氣虛弱、癌毒邪氣趁虛入侵[8-9]?！夺t(yī)宗必讀》記載：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之?！敝赋稣龤獠蛔?，既不能抵抗外邪入侵又不能祛邪外出，邪氣聚集滯而成瘤，認為“正虛”是腫瘤發(fā)生的根本原因?！吨T病源候論》云：“有下于乳者，其經(jīng)虛，為風寒氣客之，則血澀結(jié)……無大熱，但結(jié)核如石?！敝赋鐾庑俺颂撊雰?nèi)聚于乳絡(luò)，寒凝血澀，氣血運行不暢，瘀血內(nèi)停，積久成巖。癌毒是導致乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，既可直接外客，亦可因臟腑機能失調(diào)而內(nèi)生[10-11]。癌毒阻滯，病變乖戾，耗傷人體氣血津液以自養(yǎng)，并可誘生濕、熱、痰、瘀等多種病理因素。

針對乳腺癌的病因病機及病理特點，導師張瑩雯教授依據(jù)多年的從醫(yī)經(jīng)驗，采用復方開口箭合劑用于乳腺癌的臨床治療，可有效控制病情，減少并發(fā)癥，延長患者生存期。復方開口箭合劑由開口箭、茯苓、黃芪等16味中藥組成。方中開口箭，味苦辛，性寒，清熱解毒，為君藥，前期研究中證實其對甲狀腺髓樣癌細胞具有抑制作用[12-13]；浙貝母苦寒，昆布咸寒，夏枯草辛苦寒，白花蛇舌草苦甘、性寒，四藥助開口箭清熱解毒、軟堅散結(jié)，為臣藥；黃芪甘溫，合茯苓益氣托毒、利水滲濕；三棱、莪術(shù)、水蛭、郁金行氣破血、消積；伸筋草、絲瓜絡(luò)祛風通絡(luò)；紅藤、蒲公英、皂莢刺托毒消腫，共為佐藥。為進一步明確其抗乳腺癌作用及機制，本實驗采用接種4T1乳腺癌細胞株的方法建立乳腺癌模型，以高、中、低劑量復方開口箭合劑進行干預，發(fā)現(xiàn)復方開口箭合劑可有效抑制乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移，其作用呈時間、劑量依賴性。在給藥7 d后，高劑量復方開口箭合劑對乳腺原位癌生長的抑制作用并無明顯優(yōu)勢，但可更好地抑制肺轉(zhuǎn)移；在給藥14 d后，高劑量復方開口箭合劑的抑瘤率可達47.78%，肺轉(zhuǎn)移抑制率為53.41%，在抑制乳腺原位癌生長、肺轉(zhuǎn)移上效果均優(yōu)于用于中晚期乳腺癌治療藥物依維莫司(選擇性mTOR抑制劑)[14-16]。依據(jù)中草藥抗腫瘤有效性標準及《現(xiàn)代腫瘤治療藥物學》相關(guān)標準：抑瘤率 >30%被認為有效[17-18]，本實驗結(jié)果證實，給藥14 d后，高、中劑量復方開口箭合劑對4T1乳腺原位癌生長具有有效的抑制作用，其中高劑量復方開口箭合劑還可有效抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)細胞凋亡與自噬，參與腫瘤細胞的生長、代謝、侵襲、轉(zhuǎn)移等重要環(huán)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路在包括乳腺癌、肝癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中過度激活，促進腫瘤細胞生長，增加細胞侵襲力，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、不良預后密切相關(guān)[19-24]。研究認為，針對mTOR的治療可能是乳腺癌尤其是中晚期乳腺癌的一個有效應(yīng)對策略[25-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，依維莫司在給藥7 d后可較好的抑制mTORmRNA的表達，且隨著作用時間的延長，在給藥14 d后抑制作用增強，但其抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移作用并未同步增強。復方開口箭合劑亦可有效下調(diào)mTORmRNA的表達，其作用與用藥時間、劑量呈正相關(guān)，雖然給藥7 d后復方開口箭合劑下調(diào)mTORmRNA表達的作用明顯弱于依維莫司組，但在給藥14 d后，復方開口箭合劑高劑量組較之依維莫司組mTORmRNA表達無明顯差異，并可更好的抑制乳腺原位癌的生長及肺轉(zhuǎn)移。

綜上所述，復方開口箭合劑可能部分通過下調(diào)mTOR的表達抑制乳腺癌的生長及肺部轉(zhuǎn)移。依維莫司作為mTOR靶向抑制劑，雖可較好的抑制mTOR的表達，但單獨使用依維莫司對乳腺癌生長轉(zhuǎn)移的抑制作用低于高劑量復方開口箭合劑，提示乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，應(yīng)從多方面著手綜合治療，復方開口箭合劑可能還通過其他途徑發(fā)揮抗乳腺癌作用，其具體機制有待進一步研究。