陳蔚，馬騰飛，武慧超，2，劉媛媛，仁青東主，張金魁，任小巧，2

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029；3.青海大學(xué)，青海 西寧 810016；4.青海藏醫(yī)藥研究院，青海 西寧 810016

膽囊炎(cholecystitis)是指膽囊壁的炎癥反應(yīng)，是臨床常見(jiàn)和多發(fā)的膽系疾病，常由膽囊管梗阻、細(xì)菌感染、化學(xué)性刺激、高脂飲食等所誘發(fā)的炎性病變所致[1]。根據(jù)發(fā)病緩急和經(jīng)過(guò)可分為急性膽囊炎和慢性膽囊炎；根據(jù)是否伴有結(jié)石可分為結(jié)石性膽囊炎和非結(jié)石性膽囊炎。藏藥十五味賽爾斗丸具有解熱鎮(zhèn)痛、抑菌、消炎、消腫、利膽溶石、排石，提高機(jī)體免疫功能等作用，臨床用于治療膽囊炎、膽囊結(jié)石、膽總管結(jié)石及肝內(nèi)膽管結(jié)石[2]，但其作用機(jī)制及有效成分尚不清楚。鑒于此，本研究基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析其潛在作用機(jī)制，然后應(yīng)用動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)出的核心靶點(diǎn)和通路，多角度分析藏藥十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的作用機(jī)制。

1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的作用機(jī)制

1.1 資料與方法

1.1.1 十五味賽爾斗丸活性成分的獲取及相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)檢索PubMed(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、CNKI、萬(wàn)方、維普等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)等數(shù)據(jù)庫(kù)，搜集十五味賽爾斗丸各藥的化學(xué)成分。將獲取的化學(xué)成分在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載SDF格式文件，逐一上傳至SwissADME(http：//swissadme.ch/)進(jìn)行活性成分篩選。滿足腸胃吸收(gatrointestinal absortion)為“High”，且5種類藥性(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)結(jié)果中有2個(gè)及2個(gè)以上為“Yes”的成分視為活性成分。再通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss Target Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)篩選出活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，整理并去重后作為十五味賽爾斗丸活性成分的靶點(diǎn)，以供后續(xù)分析。

1.1.2 膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點(diǎn)獲取在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenCards，https：//www.genecards.org)、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org)中以 cholecystitis、chronic cholecystitis、acute cholecystitis、gallstones和cholelithiasis為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得膽囊炎相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。將十五味賽爾斗丸有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)與膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，繪制venny圖，所得交集靶點(diǎn)即為十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點(diǎn)。

1.1.3 “藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點(diǎn)、活性成分和疾病導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，并通過(guò)“Network Analyzer”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯Y選十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關(guān)鍵成分。

1.1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將潛在靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.string-db.org/)，以“Homo sapiens”為分析條件，設(shè)置置信度蛋白質(zhì)參數(shù)>0.9，去除散在靶點(diǎn)，得出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中進(jìn)行可視化處理，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霁@得核心靶點(diǎn)。

1.1.5 富集分析將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//David.ncifcrf.gov/summary.jsp)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，以P≤0.5為條件進(jìn)行篩選并排序，選擇排名前20的條目，運(yùn)用微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn/)在線作圖工具作出氣泡圖。

1.1.6 分子對(duì)接通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關(guān)鍵成分的分子結(jié)構(gòu)，利用Chem3D進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化及能量最小化，將所得結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Schr?dinger軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)加氫、結(jié)構(gòu)優(yōu)化、能量最小化后作為分子對(duì)接的配體分子數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.rcsb.org/)獲得靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Maestro11.9平臺(tái)，用Schr?dinger的Protein Preparation Wizard模塊對(duì)蛋白進(jìn)行去除結(jié)晶水、補(bǔ)加缺失的氫原子、修復(fù)缺失鍵信息、修補(bǔ)缺失肽段處理，最后通過(guò)OPLS3e力場(chǎng)對(duì)蛋白進(jìn)行約束能量最小化以及幾何結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，并保存為受體。采用Schr?dinger Maestro軟件中的Glide模塊進(jìn)行分子對(duì)接。選取蛋白的原配體或者預(yù)測(cè)活性位點(diǎn)作為12 ?盒子的質(zhì)心，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(standard precision，SP)完成分子對(duì)接及篩選，采用Pymol2.1進(jìn)行可視化分析。

1.2 結(jié)果

1.2.1 十五味賽爾斗丸活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)篩選與整理，十五味賽爾斗丸組方的15味中藥中納入12味中藥，分別為印度獐牙菜(8)、小檗皮(5)、角茴香(35)、波棱瓜子(16)、榜嘎(11)、兔耳草(8)、五靈脂(75)、石榴子(4)、金腰草(4)、訶子(9)、川木香(12)、矮叢鳳毛菊(6)，滿足要求的活性成分193個(gè)。經(jīng)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取 1 069 個(gè)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)。見(jiàn)表1。

表1 十五味賽爾斗丸部分活性成分信息

1.2.2 膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)及十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點(diǎn)在GenCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索膽囊炎相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，去重后共得到膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)702個(gè)。將十五味賽爾斗丸有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)與膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，繪制venny圖，獲得141個(gè)交集靶點(diǎn)，即為十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 交集靶點(diǎn)韋恩圖

1.2.3 “藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)將十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點(diǎn)、活性成分和疾病導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，獲得“藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)中包含338個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)和2 166條邊(edge)。通過(guò)“Network Analyzer”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選出4個(gè)度值(degree)大于2倍平均值、介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)大于平均值的活性成分，即十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關(guān)鍵成分，分別是N-methylcorydaldine、氧化血根堿、金圣草(黃)素和7-羥基香豆素。見(jiàn)表2，圖2。

表2 十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關(guān)鍵成分拓?fù)鋮?shù)

圖2 “藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

1.2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)將141個(gè)潛在靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件中獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，則度值越大。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，根?jù)degree、BC、接近中心性(closeness centrality，CC)、集聚系數(shù)(clustering coefficient)及節(jié)點(diǎn)鄰居的平均連接度(neighborhood connectivity，NC)篩選出degree、BC均大于平均值的靶點(diǎn)，即為十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的核心靶點(diǎn)，共30個(gè)。排名前20位的核心靶點(diǎn)包括磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MAPK1)、MAPK3、腫瘤蛋白53(tumor protein 53，TP53)、蛋白激酶B(protein kinase1，AKT1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Harvey-RAS(HRAS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、凝血因子Ⅱ(coagulation factor II，F(xiàn)2)、雌激素受體1(estrogen receptor，ESR1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8(CXCL8)、緩激肽受體B2(recombinant bradykinin receptor B2，BDKRB2)、BDKRB1、Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、1-磷酸鞘氨醇受體1(sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1PR1)、發(fā)動(dòng)蛋白1(dynamin 1，DNM1)、組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)。見(jiàn)圖3、圖4及表3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 排名前20位的核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

圖4 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

1.2.5 富集分析將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析共得到661個(gè)條目，其中包含生物過(guò)程(biological process，BP)491個(gè)，細(xì)胞組分(cellular component，CC)62個(gè)，分子功能(molecular function，MF)108個(gè)。生物過(guò)程主要涉及對(duì)缺氧的反應(yīng)(response to hypoxia)、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)等。細(xì)胞組分主要涉及質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞外間隙(extracellular space)、細(xì)胞表面(cell surface)、小窩(caveola)等。分子功能主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)、氧結(jié)合(oxygen binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)、配體激活的序列特異性 DNA 結(jié)合(ligand-activated sequence-specific DNA binding)等。KEGG通路富集分析共得到113條通路，主要涉及缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路、催乳素(prolactin)信號(hào)通路、甲狀腺激素(thyroid hormone)信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等。見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

圖6 KEGG信號(hào)通路分析氣泡圖

1.2.6 分子對(duì)接以N-methylcorydaldine、氧化血根堿、金圣草(黃)素及7-羥基香豆素為配體分子，以PIK3CA、TNF、IL-6、EGFR、AKT1為受體進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，結(jié)合能均小于-6 kcal·mol-1，提示核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較高的匹配度和較好的結(jié)合活性，其中各化合物與TNF的結(jié)合能最低。見(jiàn)表4，圖7。

表4 分子對(duì)接結(jié)果

圖7 分子對(duì)接結(jié)果

2 基于NF-kB通路研究十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的作用機(jī)制

2.1 材料

2.1.1 動(dòng)物60只雌雄各半清潔級(jí)豚鼠，體質(zhì)量(350±50) g，由北京艾尼特科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京) 2016-0007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，室溫維持在(25±1)℃，濕度維持在(65±5)%，12 h循環(huán)交替光照(光照時(shí)間為730到1930)，控制干擾噪音及光線。在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用普通動(dòng)物飼料+蔬菜(大白菜、娃娃菜、小青菜和生菜)或維生素C，自由飲食、飲水。實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定，所有實(shí)驗(yàn)豚鼠的給藥、灌胃、喂養(yǎng)等嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)規(guī)定的動(dòng)物倫理福利條款。實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，動(dòng)物倫理審查編號(hào)：BUCM-4-202012100202-4120。

2.1.2 藥物與試劑十五味賽爾斗丸(青海久美藏藥藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20200701)；鹽酸林克霉素(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：AM191006)；消炎利膽片(廣東羅浮山國(guó)藥有限公司，批號(hào)：F20A005)；總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R1200、PC0020)；通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)：11141ES60、11201ES08)；核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65 抗體(美國(guó)proteintech公司，貨號(hào)：10745-1-AP)；羊抗兔HRP二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：bs-0295G-HRP)；TNF-α ELISA試劑盒(江萊生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：JL13090)；引物序列在上海晶萊生物技術(shù)有限公司北京晶萊生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.1.3 儀器3120000259型2～200 μL精密移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；Synergy H4型酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；ST-36WT型洗板機(jī)(上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；HDPN-88型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；80-2型臺(tái)式低速離心機(jī)(離心半徑：10 cm，上海醫(yī)療器械技術(shù)有限公司)；Genesy 98T型普通PCR儀(西安天隆科技有限公司)；MA-6000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、MA-6000型核酸檢測(cè)儀(蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司)、BSH-C2型組織破碎儀(杭州遂真生物技術(shù)有限公司)；5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；1645070型電泳儀、BE6085型電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-rad公司)。

2.2 方法

2.2.1 藥物制備十五味賽爾斗丸醇提物的制備：用電子天平準(zhǔn)確稱量十五味賽爾斗丸300 g，碾碎后加入10倍量 70%乙醇，回流提取1 h后，將提取液移置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中加熱旋蒸，溫度為60～70 ℃，當(dāng)藥液體積為0.5～1 L時(shí)，倒出并放置于水浴鍋中蒸干，再放置于真空干燥箱里面干燥，所得浸膏冷凍干燥后粉碎，使用時(shí)用生理鹽水配置；十五味賽爾斗丸水溶液和消炎利膽片溶液的制備：十五味賽爾斗丸丸劑及消炎利膽片使用時(shí)分別研成粉末，按照給藥劑量溶于生理鹽水。

2.2.2 膽囊炎模型制備、動(dòng)物分組與給藥隨機(jī)從60只豚鼠中選12只為正常組，其余48只豚鼠皮下注射30 mg·kg-1鹽酸林可霉素，每天1 次，連續(xù)7 d復(fù)制豚鼠膽囊炎模型。當(dāng)造模豚鼠出現(xiàn)蜷縮，精神萎靡，進(jìn)食減少，尿黃，體質(zhì)量明顯降低的現(xiàn)象；且病理檢查發(fā)現(xiàn)膽囊形態(tài)改變，出現(xiàn)明顯的炎癥，膽汁渾濁，可見(jiàn)黑色的泥沙樣結(jié)石等時(shí)視為模型建立成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的48只豚鼠隨機(jī)分為模型組、十五味賽爾斗丸水溶液組、十五味賽爾斗丸醇提組、消炎利膽片組，每組12只。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》不同動(dòng)物間體表面積折算等效劑量系數(shù)表可知，體質(zhì)量為70 kg的人與體質(zhì)量為0.4 kg的豚鼠之間換算系數(shù)為0.031[3]，結(jié)合比率按公式計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中豚鼠的用藥劑量為：豚鼠的給藥劑量=0.031×人的每日劑量4.5 g÷豚鼠體質(zhì)量0.4 kg=0.35 g·kg-1，即十五味賽爾斗丸水溶液組的給藥劑量為0.35 g·kg-1；由于十五味賽爾斗丸醇提物的成膏率為35%，十五味賽爾斗丸醇提組的給藥劑量為0.12 g·kg-1；消炎利膽片組的給藥劑量 0.36 g·kg-1；造模成功后，各給藥組給予相應(yīng)劑量的藥物進(jìn)行灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)15 d。

2.2.3 病理學(xué)檢查末次給藥后禁食禁水12 h，稱量豚鼠的質(zhì)量，按3.5 mL·kg-1劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，腹主動(dòng)脈取血后，結(jié)扎膽囊管，摘膽囊抽取膽汁，將膽囊分為三份，取一份豚鼠膽囊標(biāo)本，以10%甲醛固定24 h后換成新鮮的10%甲醛繼續(xù)固定24 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，HE 染色，顯微鏡下觀察其病理學(xué)改變。

2.2.4 TNF-α含量的測(cè)定用ELISA法測(cè)定血清和膽汁樣本中TNF-α的含量，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膽囊中NF-κB、TNF-α的mRNA表達(dá)提取每只豚鼠膽囊組織總 RNA，采用通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：5 μL cDNA、5 μL GoTaq反應(yīng)液、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、20 μL無(wú)菌超純水。將PCR 反應(yīng)混合液置于7500 Real Time PCR System進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 20 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用 2-△△CT相對(duì)定量法計(jì)算各樣本中TNF-αmRNA、NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表5。

表5 引物序列

2.2.6 Western Blot檢測(cè)膽囊組織中NF-κB蛋白表達(dá)水平分別于各組取適量膽囊組織，按照 19 的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，4 ℃震蕩至組織塊全部破碎，置于冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 rpm·min-1離心 20 min，取上清。上樣等量蛋白經(jīng)過(guò)電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為 200 mA 90 min(0.45 μm膜)，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入相應(yīng)的一抗(NF-κB、GAPDH稀釋比例分別為12 000和15 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次，每次10 min。加入二抗(稀釋比例為15 000)，室溫孵育1 h。TBST充分洗滌PVDF膜3次，每次10 min。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過(guò)氧化物酶溶液按11比例混勻，滴加適量工作液于PVDF膜上，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光，并使用Image J軟件分析灰度值。

2.3 結(jié)果

2.3.1 十五味賽爾斗丸對(duì)膽囊炎豚鼠膽囊組織病理的影響正常組膽囊形態(tài)正常，未見(jiàn)病理學(xué)改變。模型組豚鼠膽囊明顯腫大，組織局部增生、水腫或壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜水腫、散在性脫落、滲血。經(jīng)過(guò)藥物治療后，膽囊組織損傷得到明顯改善。見(jiàn)圖8。

A：正常組；B：模型組；C：十五味賽爾斗丸水溶液組；D：十五味賽爾斗丸醇提組；E：消炎利膽片組圖8 十五味賽爾斗丸對(duì)豚鼠膽囊組織病理的影響(HE染色，×400)

2.3.2 十五味賽爾斗丸對(duì)豚鼠血清及膽汁中TNF-α含量的影響與正常組相比，模型組血清中 TNF-α 含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，十五味賽爾斗丸醇提組血清中TNF-α含量顯著下降(P<0.01)。與正常組相比，模型組膽汁中TNF-α含量有所升高；與模型組比較，各給藥組膽汁中TNF-α含量有所下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6。

表6 十五味賽爾斗丸對(duì)豚鼠血清及膽汁中TNF-α含量的影響

2.3.3 十五味賽爾斗丸對(duì)膽囊炎豚鼠NF-κB和TNF-αmRNA表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組TNF-αmRNA、NF-κBmRNA的表達(dá)水平明顯升高 (P<0.01)。與模型組比較，各給藥組NF-κBmRNA表達(dá)水平顯著降低 (P<0.01)；十五味賽爾斗丸醇提組、消炎利膽片組TNF-αmRNA 的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表7。

表7 十五味賽爾斗丸對(duì)膽囊炎豚鼠NF-κB和TNF-α mRNA表達(dá)水平的影響

2.3.4 十五味賽爾斗丸對(duì)膽囊炎豚鼠NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響與正常組比較，模型組 NF-κB 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組蛋白表達(dá)水平有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖9，表8。

圖9 Western Blot檢測(cè)NF-κB蛋白水平表達(dá)的影響

表8 十五味賽爾斗丸對(duì)豚鼠NF-κB蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

十五味賽爾斗丸系傳統(tǒng)藏成藥，由印度獐牙菜、唐古特烏頭、矮叢鳳毛菊、金腰草、石榴子、黑冰片、火硝、波棱瓜子、川木香、角茴香、小檗皮、訶子、洪連、五靈脂、金精石組成[4]，藏醫(yī)理論認(rèn)為本方具有清利肝膽濕熱、舒膽排石退黃之效，臨床常用于肝膽熱癥、膽囊炎、膽石癥、膽總管結(jié)石等常見(jiàn)肝膽疾病。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，十五味賽爾斗丸具有解熱鎮(zhèn)痛、抑菌、消炎、消腫、利膽溶石、排石，提高機(jī)體免疫功能的功效，但其作用機(jī)制及有效成分尚不完全清楚，亦無(wú)具體的功效藥理學(xué)評(píng)價(jià)及分析。但有研究發(fā)現(xiàn)，十五味賽爾斗丸組方中單味藥的醇提物的利膽等作用效果比水提物強(qiáng)[5]。亦有研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，乙醇作為提取溶劑，更有利于后續(xù)的分離純化[6]，可為進(jìn)一步研究提取物的作用效果及有效成分分析，多方面了解藥物療效作用及靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關(guān)鍵活性成分有N-methylcorydaldine、氧化血根堿、金圣草(黃)素及7-羥基香豆素。N-methylcorydaldine具有抗分泌活性，可抑制胃酸分泌，其效果媲美奧美拉唑[7]；氧化血根堿具有抗瘧活性[8]。金圣草(黃)素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[9]；7-羥基香豆素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[10]。與核心靶點(diǎn)PIK3CA靶向的活性成分有雛菊葉龍膽酮、白屈菜紅堿、原阿片堿、隱品堿、別隱品堿、芹菜素等。雛菊葉龍膽酮是從獐牙菜莖中提取的一種呫噸酮化合物，具有保肝、抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性，是免疫缺陷病毒蛋白R(shí)的抑制劑[11-13]；白屈菜紅堿具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎活性[14]；Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)原阿片堿、隱品堿、別隱品堿等生物堿對(duì)金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和銅綠假單胞菌都有明顯的抑制作用。慢性膽囊炎的成因中包括細(xì)菌感染，其病原菌主要來(lái)源于腸道，腸道細(xì)菌可經(jīng)膽管至膽囊，以革蘭陰性菌為主，其中包括大腸埃希菌等[16]。

通過(guò)對(duì)關(guān)鍵活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，TNF、PIK3CA、AKT1、IL-6、EGFR是十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的核心靶點(diǎn)。其中，TNF是與各核心化合物結(jié)合表現(xiàn)最好的靶點(diǎn)，TNF是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，是免疫系統(tǒng)中極其重要的信號(hào)蛋白。TNF-α、TNF-β是TNF家族重要的成員[17]，TNF-α 主要通過(guò)上調(diào)MAPK、ERK、NF-kappa B等信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及促炎癥作用[18]。研究證明，PI3Ks可調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖、黏附、存活和運(yùn)動(dòng)的信號(hào)通路。對(duì)PIK3CA突變的分析表明，PIK3CA增加PI3K信號(hào)，刺激下游AKT信號(hào)，促進(jìn)不依賴生長(zhǎng)因子細(xì)胞的生長(zhǎng)并增加細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[19]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性膽囊炎多由大腸桿菌、厭氧桿菌等引起，膽囊結(jié)石同樣會(huì)誘發(fā)急性膽囊炎，損傷膽管壁，產(chǎn)生炎性介質(zhì)如IL-6，繼發(fā)性引起炎性細(xì)胞因子升高，參與炎癥反應(yīng)[20]。有研究證實(shí)，急性膽囊炎患者血中革蘭陰性桿菌感染易釋放過(guò)量的內(nèi)毒素，誘導(dǎo)IL-6等入血，引起炎性鏈級(jí)反應(yīng)，導(dǎo)致多器官障礙和并發(fā)癥[21]。所有存在結(jié)石的膽囊均有炎癥反應(yīng)變化，炎癥與黏蛋白的分泌異常有一定關(guān)系[22]，EGFR對(duì)于黏蛋白合成有中心調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而促進(jìn)膽囊結(jié)石的形成[23]。此外，部分靶點(diǎn)如AKT1[24]、VEGFA[25]等與腫瘤表達(dá)密切相關(guān)，推測(cè)十五味賽爾斗丸在治療腫瘤方面具有一定的潛能。根據(jù)《膽囊癌診斷與治療》2019版[26]，膽囊炎為膽囊癌發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)因素。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，十五味賽爾斗丸可改善對(duì)細(xì)胞缺氧的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)[27]以及氧結(jié)合等功能。由于代謝高度活躍的常駐細(xì)胞和活化的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞耗氧量增加以及血管功能障礙導(dǎo)致的氧氣供應(yīng)減少，因此，缺氧常作為慢性發(fā)炎組織的顯著特征。組織缺氧會(huì)對(duì)免疫和非免疫細(xì)胞中的炎癥信號(hào)通路產(chǎn)生重大影響，影響疾病進(jìn)展[28]。KEGG通路分析提示，十五味賽爾斗丸主要是通過(guò)HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等發(fā)揮協(xié)同作用來(lái)治療膽囊炎。HIF-1水平的變化與AKT、NF-κB通路有關(guān)，還可誘導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄，是干預(yù)炎癥損傷、氧化應(yīng)激、凋亡等的重要信號(hào)通路[29]。NF-κB信號(hào)通路的激活，可以有效抑制NF-κB介導(dǎo)的TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子及其蛋白的表達(dá)，減輕全身炎癥反應(yīng)和各組織器官的急性損傷[30]。雖然 NF-κB 信號(hào)通路在KEGG富集結(jié)果中排名未進(jìn)入前20，但參考前期課題組研究，經(jīng)過(guò)查詢文獻(xiàn)和討論后，認(rèn)為其有重要的研究意義。

為了驗(yàn)證十五味賽爾斗丸對(duì)膽囊炎模型的影響，本研究進(jìn)一步采用皮下注射鹽酸林可霉素建立豚鼠膽囊炎模型。結(jié)果顯示，模型組血清中 TNF-α 含量明顯升高，提示膽囊出現(xiàn)部分炎癥反應(yīng)；各給藥組TNF-α含量明顯下降，且十五味賽爾斗丸醇提組中TNF-α含量低于十五味賽爾斗丸水溶液組。與模型組比較，各給藥組NF-κBmRNA表達(dá)水平顯著降低，十五味賽爾斗丸醇提組、消炎利膽片組TNF-αmRNA 的表達(dá)水平顯著降低，且十五味賽爾斗丸醇提組作用效果更明顯。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步預(yù)測(cè)十五味賽爾斗丸可通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)及多通路治療膽囊炎；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示十五味賽爾斗丸可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路抑制TNF-α等炎癥因子及其蛋白的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，從而治療膽囊炎，與預(yù)測(cè)結(jié)果存在高度一致，明確了本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的可靠性，為今后繼續(xù)研究相關(guān)成分治療膽囊炎的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。