吳昌安，曹岐新，艾宗耀

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 湖州 313000)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性退行性疾病，發(fā)病機(jī)理仍不明確，有研究認(rèn)為β-分泌酶(BACE1)可能是治療AD的重要靶標(biāo)。蛋白質(zhì)的降解主要通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome system, UPS)，蛋白質(zhì)在泛素化修飾中調(diào)整細(xì)胞生理生化功能，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)保護(hù)靶蛋白不被水解。泛素化特異性蛋白酶11(USP11)是DUBs成員之一，可調(diào)節(jié)胞內(nèi)多種蛋白的活性，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

米托蒽醌(Mitoxantrone，MTX)是一種蒽環(huán)類廣譜化療藥，目前臨床上主要用于治療急性髓系白血病等惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)MTX可作為USP11的小分子抑制劑，能夠特異性抑制USP11的活性。本文通過AD細(xì)胞模型，研究MTX對AD的治療作用及可能的機(jī)制，以期為開發(fā)治療AD藥物提供新的作用靶點與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 米托蒽醌(Mitoxantrone，美侖公司，批號：MB1404)；ELISA檢測試劑盒(美國Abnova公司，批號：KA1158)。高爾基試劑盒(美國hitobiotec 公司，批號：HTKNS1125)；本實驗所需抗體購自美國Proteintech公司；水迷宮系統(tǒng)購自上海移數(shù)。實驗所需細(xì)胞株H4來源于本院菌種保藏中心。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80 ℃冰箱取出H4細(xì)胞，復(fù)蘇操作后轉(zhuǎn)移至含有10 mL已預(yù)熱DMEM完全培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃含5%CO的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待其密度達(dá)到80%～90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例為1∶9。

1.3 USP11-siRNA合成及轉(zhuǎn)染 按照siRNA靶點的設(shè)計規(guī)則，根據(jù)USP11的序列，利用Invitrogen公司的設(shè)計軟件，設(shè)計USP11的siRNA及對照序列，USP11的對照序列及siRNA序列由上海吉瑪科技有限公司合成，分別命名為NT-siRNA、USP11-siRNA。取復(fù)蘇后H4細(xì)胞，待其達(dá)到70%～80%密度后，將合成的NT-siRNA、USP11-siRNA按照脂質(zhì)體試劑說明操作經(jīng)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入H4細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為NT siRNA組、USP11 siRNA組。

1.4 免疫印跡法(WB)檢測目的蛋白 從細(xì)胞培養(yǎng)皿上刮下細(xì)胞，滴加蛋白裂解液，并超聲破碎后靜置30 min，4 ℃下離心12 000 r/min 25 min，留取上清。測定蛋白濃度后制成等蛋白濃度的樣品。聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，而后電轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉2 h后，分別與特異性一抗GAPDH(1∶3 000)、USP11(1∶500)、BACE1(1∶800)、ADAM10(1∶800)以及PS1(1∶800)在4 ℃下孵育過夜，而后二抗(1∶3 000)孵育2 h，暗房顯色。Image J圖像分析軟件分析各條帶的吸光度值，以目的蛋白對GAPDH 相對值計算結(jié)果,各標(biāo)本重復(fù)3次。

1.5 免疫共沉淀檢測USP11和BACE1之間調(diào)控作用 將細(xì)胞裂解，制成等體積等質(zhì)量樣品后置于EP管，利用免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)，采用WB檢測USP11和BACE1水平。構(gòu)建USP11-HA過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至H4細(xì)胞中，再次利用Co-IP，使用HA標(biāo)簽抗體免疫共沉淀等量的BACE1，采用WB檢測BACE1蛋白上所連接的泛素蛋白Ub表達(dá)水平，觀察USP11對BACE1蛋白進(jìn)行泛素化蛋白酶體降解的影響。

1.6 實驗動物和分組 SPF級C57BL/6J小鼠8只與5×FAD小鼠16只，雄性，20周齡，體質(zhì)量30～35 g，購于上海南方模式生物科技股份有限公司(合格證號:312024300000732)。其中C57BL/6J小鼠為對照組(Ctrl組)，5×FAD小鼠(AD組)分為2組各8只，分別給予等劑量PBS腹腔注射(AD+PBS組)、等劑量MTX腹腔注射(AD+MTX組)，均于訓(xùn)練前3天開始腹腔注射，連續(xù)3 d。

1.7 水迷宮實驗

1.7.1 訓(xùn)練期 將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠找到平臺的時間，讓小鼠在平臺上停留10 s。每只小鼠每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練5 d。

1.7.2 測試期 最后一次訓(xùn)練結(jié)束后的第二天，將平臺撤除，開始60 s的探查訓(xùn)練。將小鼠由原先平臺象限的對側(cè)放入水中。記錄小鼠找到目標(biāo)象限(原先放置平臺的象限)所花的時間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

1.8 小鼠腦組織檢測 水迷宮實驗后，各組小鼠斷頭取腦，剝離海馬，取適量海馬組織勻漿，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min取得待測樣本，利用Westen blot檢測小鼠腦組織中USP11、BACE1的表達(dá)水平，ELISA檢測Aβ蛋白含量。然后通過高爾基染色(按高爾基染色試劑盒說明書操作)，顯微鏡下(×100)觀察和統(tǒng)計小鼠海馬中突觸的密度(10 μm長度的樹突的突觸數(shù)量)。

1.9 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，采用檢驗和方差分析。<0.05為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H4細(xì)胞中USP11、BACE1的表達(dá)水平 USP11-siRNA處理后，H4細(xì)胞中USP11、BACE1的表達(dá)水平分別為(0.300±0.114)和(0.267±0.125)，與NT siRNA組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)。ADAM10、PS1表達(dá)水平分別為(0.933±0.249)、(1.130±0.175)，與NT siRNA組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(>0.05)，見圖1。

注：1) 與NT siRNA組比較，P<0.01。

2.2 USP11與BACE1之間存在的調(diào)控作用 IP檢測結(jié)果顯示，USP11可以免疫共沉淀下BACE1，同樣的BACE1也可以免疫共沉淀下USP11，見圖2A。蛋白泛素化檢測結(jié)果如圖2B所示，過表達(dá)USP11的H4細(xì)胞中，BACE1蛋白上所連接的泛素蛋白Ub的相對表達(dá)量為(0.3±0.141)，明顯低于NT siRNA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(=1.8，<0.01)。

注：1) 與NT siRNA組比較，P<0.01。

2.3 小鼠在水迷宮中尋找平臺的時間 水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠注射MTX后初期尋找平臺所需時間為(93±2.16)s，訓(xùn)練5 d后為(38±2.87)s；AD+PBS組小鼠初期尋找平臺所需時間為(87±4.03)s，第5天為(57±2.05)s；2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=1.947,<0.01)。對照組小鼠訓(xùn)練第1天和第5天尋找平臺所需時間分別為(61±1.25)s、(11±2.94)s，見圖3。

注：1) 與AD+PBS組比較，P<0.01。

2.4 各組小鼠海馬中USP11、BACE1、Aβ的表達(dá)水平 Westen blot檢測顯示，MTX組的UPS11、BACE1蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.22±0.09)、(0.18±0.10)，ELISA檢測Aβ蛋白含量為(30.25±3.56)pg/mL，相對于對照組，AD+MTX組中UPS11、BACE1、Aβ的表達(dá)水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.01)，見圖4。

注：1) 與對照組比較，P<0.01。

2.5 小鼠海馬中突觸的密度 通過高爾基染色可以發(fā)現(xiàn)，AD+MTX組和AD+PBS組小鼠海馬中突觸的密度分別為(9.0±0.71)個/10 μm、(5.75±1.09)個/10 μm，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=2.375，<0.01)。對照組小鼠中，注射MTX和注射PBS的小鼠間海馬突觸密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(=0.4198)，見圖5。

注：1) 與對照組比較，P<0.01。

3 討論

AD主要臨床癥狀為進(jìn)行性記憶力與認(rèn)知能力的減退，并發(fā)言語功能障礙或精神運動異常等，對患者及家屬乃至社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，但至今為止，其發(fā)病機(jī)制仍不明確。其中Aβ在腦神經(jīng)細(xì)胞外的沉積是目前最被認(rèn)可的假說，研究認(rèn)為其在AD的病理生理進(jìn)程中起到非常重要的作用。Aβ可內(nèi)由β淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)α-分泌酶(ADAM10)、β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(PS1)水解后產(chǎn)生，并在大腦海馬和皮層聚集、沉積形成Aβ斑塊，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變。而BACE1是APP切割產(chǎn)生Aβ最關(guān)鍵的酶，被認(rèn)為是治療AD的重要靶標(biāo)。

蛋白質(zhì)降解的途徑之一是UPS。可通過對蛋白質(zhì)泛素化修飾,改變胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)其定位或活性，從而影響蛋白的功能。泛素化特異性蛋白酶USP可逆轉(zhuǎn)這一過程。其中USP11已被證實在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。在本研究中，我們嘗試構(gòu)建USP11-siRNA敲低H4神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中USP11的表達(dá)水平，并進(jìn)一步檢測其對APP水解酶ADAM10、BACE1與PS1的表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)敲低USP11可下調(diào)BACE1的表達(dá)，但對ADAM10與PS1沒有影響，這說明，USP11與BACE1存在關(guān)聯(lián)性，且相對特異。

為了進(jìn)一步探討USP11與BACE1之間的關(guān)系，首先我們應(yīng)用IP的方法檢測USP11與BACE1之間是否存在相互作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP11與BACE1可相互沉降對方，說明兩者之間存在直接的相互作用。但USP11到底是通過何種作用模式調(diào)控BACE1的表達(dá)還未知?，F(xiàn)有研究表明：USP11是USP家族的一員，可對其靶蛋白去泛素化，從而抑制靶蛋白降解并穩(wěn)定其的表達(dá)。例如：USP11能對IκBα去泛素化，通過穩(wěn)定IκBα進(jìn)而抑制TNFα介導(dǎo)的NF-κB的激活；另外USP11還可通過對ALK5去泛素化，同時參與調(diào)控SMAD2/3磷酸化和SMAD核轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)TGFβ通路的信號。因此，我們嘗試在H4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染USP11-HA質(zhì)粒以過表達(dá)USP11，并利用BACE1抗體免疫共沉淀下BACE1以分析BACE1蛋白上所連接的泛素蛋白，通過Westen blot的結(jié)果可知，過表達(dá)USP11后，BACE1蛋白上連接的泛素蛋白Ub明顯下降。這說明USP11可與BACE1相互作用并對BACE1去泛素化。因此USP11有望成為治療AD的潛在靶點。

現(xiàn)已有報道證實廣譜化療藥米托蒽醌(MTX)可作為USP11的小分子抑制劑，且MTX現(xiàn)在已經(jīng)投放臨床，用于治療多種腫瘤疾病，因此我們提出假設(shè)，MTX對AD存在治療作用。由于MTX存在細(xì)胞毒性，我們應(yīng)用最低有效濃度的MTX處理AD小鼠，發(fā)現(xiàn)AD小鼠海馬中USP11與BACE1的表達(dá)均出現(xiàn)下降，進(jìn)一步以ELISA檢測Aβ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Aβ的表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，這與細(xì)胞實驗中的結(jié)果一致。為此，我們推測MTX可改善AD小鼠的行為認(rèn)知。為了驗證這個假設(shè)，我們進(jìn)一步以高爾基染色法與水迷宮檢測MTX對AD小鼠海馬組織與行為認(rèn)知的影響，發(fā)現(xiàn)MTX可促進(jìn)AD小鼠海馬中突觸的形成，并減少AD小鼠尋找平臺的時間，這與細(xì)胞實驗的結(jié)果與其所推測的假設(shè)一致。

綜上，米托蒽醌MTX可通過抑制USP11進(jìn)一步促進(jìn)BACE1泛素化及降解，從而抑制Aβ的表達(dá)，并有可能進(jìn)而達(dá)到對Aβ引起的神經(jīng)退行性病變起到抑制或延緩作用，可為米托蒽醌臨床應(yīng)用于治療AD病變提供實驗依據(jù)。