楊 勐

(安徽省宿州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 安徽 宿州 234000)

胃癌(Gastric cancer,GC)作為一種非常常見的惡性腫瘤，目前在全球癌癥死亡中排名第二[1]。截止目前，手術(shù)作為GC的唯一治療手段仍被廣泛應(yīng)用，但經(jīng)根治性切除手術(shù)的GC患者有超過半數(shù)都會表現(xiàn)出局部復發(fā)或伴遠處轉(zhuǎn)移，已嚴重降低了患者的生存質(zhì)量[2]。因此，有必要尋找新的GC治療靶點，以便更好地了解GC發(fā)生的分子機制從而開發(fā)出高效的靶向治療藥物。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，主要通過介導下游基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達來參與調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種生物學過程[3]。越來越多的研究表明miRNAs在GC發(fā)生發(fā)展的多個階段異常表達[4,5]。最近有研究報道[6]，miR-30a-5p可以在調(diào)控GC進展中作為腫瘤抑制因子存在，通過靶向下調(diào)YAP1的表達抑制GC細胞的增殖和侵襲。此外，細胞增殖調(diào)控基因4(Up-regulated gene 4/Up-regulator of cell proliferation,URG4/URGCP)作為促癌因子已被證實在包括GC在內(nèi)的多種人類腫瘤中高表達[7]。本研究通過探討miR-30a-5p和URGCP在GC細胞中的表達差異及兩者對GC細胞凋亡和糖酵解的影響，旨在為GC的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及耗材:人正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)和GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)購買自上海生命科學研究院；RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購買自美國Gibco公司；TRIzol試劑和LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購買自美國Invitrogen公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購買自上海碧云天生物科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaqMan Reverse Transcription kit和PCR熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit購買自日本Takara公司；miR-30a-5p mimic及其陰性對照miR-NC和URGCP過表達質(zhì)粒(pcDNA-URGCP)及其空載質(zhì)粒(pcDNA-NC)合成自上海漢恒生物公司； PCR引物合成自上海生物工程有限公司合成；其他常見分子生物學相關(guān)試劑與耗材購買自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)和GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱孵育條件設(shè)置為37度C，5%CO2和95%的相對濕度。待細胞融合度達到90%以上時進行傳代培養(yǎng)，取3代以后的對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。對數(shù)期GC細胞按2×104個/孔的密度接種于6孔板中，按實驗要求將細胞分為Control組、miR-NC組、miR-30a-5p mimic組、pcDNA-NC組、pcDNA-URGCP組和pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic組，除Control組外，采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-30a-5p mimic、pcDNA-NC、pcDNA-URGCP和pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic。轉(zhuǎn)染24h后，RT-PCR用于檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2CCK-8實驗檢測細胞增殖:將轉(zhuǎn)染后的各組HGC-27細胞按1×103個/孔的密度接種于96孔板中，分別孵育24h、48h、72h后再于每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h。采用自動酶標儀檢測各孔細胞在450nm波長處的吸光度值以反映各組細胞增殖能力。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡:將轉(zhuǎn)染后的各組HGC-27細胞按3×105個/孔的密度接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)過夜。細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化后經(jīng)高速低溫離心，再懸浮在100μL的FITC結(jié)合緩沖液中。隨后，在避光條件下，加入5μL Annexin V/FITC和5μL PI與細胞混勻，室溫孵育30min。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.4ELISA試劑盒檢測細胞ATP和乳酸水平:將轉(zhuǎn)染后的各組HGC-27細胞按1×106個/孔的密度接種于6孔板中常規(guī)孵育24h。嚴格按照ELISA試劑盒操作方法，通過ATP檢測試劑盒和乳酸檢測試劑盒檢測miR-30a-5p和URGCP對細胞內(nèi)ATP和乳酸水平的影響。

1.2.5PCR檢測細胞相關(guān)mRNA表達:采用TRIzol試劑從轉(zhuǎn)染后的各組HGC-27細胞中提取總RNA。隨后，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)制造商的說明，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit試劑盒在ABI 7500H檢測系統(tǒng)中實施PCR定量反應(yīng)。PCR條件為：72℃預(yù)變性20min，95℃變性10min，60℃退火3min，共計45個循環(huán)。以GAPD或U6分別作為miR-30a-5p和URGCP的內(nèi)參。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCq方法進行統(tǒng)計分析。PCR引物序列如下所示：miR-30a-5p引物序列，F(xiàn):5′-TACGGATCCCCTTCATCTTACTTTTTTCCCCCAA-3′和R:5′-ATCGCTAGCGAAACTAGAAGCTCGGTGTGAATA-5′；URGCP引物序列，F(xiàn):5′- GACCTTGCTGCCGACATTTAT-3′和R:5′-GCAGGAAACTGTCTGAGGAGAG-5′；GAPDH引物序列，F(xiàn):5′-GCGGTGTCAAAGTGGAGAG-3′和R:5′-TGCTCGGTAGAAGGAGAAGATG-3′；U6引物序列，F(xiàn):5′-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3′和R:5′-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-5′。

1.2.6雙熒光酶素報告檢測miR-30a-5p和URGCP之間的靶向關(guān)系:設(shè)計合成URGCP的野生型(WT)和突變型(MUT)3'UTR，并將其克隆到psiCHECK-2熒光酶素表達載體中，以此得到URGCP-WT和URGCP-MUT熒光酶素報告載體。將miR-30a-5p mimic或miR-NC分別與URGCP-WT或URGCP-MUT通過LipofectamineTM3000試劑共轉(zhuǎn)染293T細胞。雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)用于檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。使用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用t檢驗或單因素方差分析來評估兩組或多組間的差異。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組GC細胞中的miR-30a-5p和URGCP mRNA表達水平:相比較正常胃黏膜上皮細胞GES-1，GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)中的miR-30a-5p表達水平均明顯下降(t=12.531,P<0.01;t=13.213,P<0.01;t=12.912,P<0.01)，見圖1A。此外，URGCP在GC細胞(AGS、HGC-27和SGC-7901)中的表達水平明顯高于GES-1組(t=11.124,P<0.01;t=10.214,P<0.01;t=12.141,P<0.01)。值得注意的是，miR-30a-5p在HGC-27細胞中的表達水平最高，而URGCP在HGC-27細胞中的表達水平最低，因此選擇差異性表達最大的HGC-27細胞用于后續(xù)實驗研究。見圖1B。

圖1 各組GC細胞中的miR-30a-5p和URGCPmRNA表達水平

2.2過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞增殖和凋亡的影響:相比較miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic的miR-30a-5p mimic組細胞中的miR-30a-5p表達明顯升高(F=134.142,P<0.01)。這一步驟代表了miR-30a-5p過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，見圖2A。接下來，通過CCK-8實驗檢測過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞增殖能力的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞的增殖活性在72h時明顯降低(F=213.213,P<0.01)，提示過表達miR-30a-5p能抑制HGC-27細胞增殖，見圖2B。通過流式細胞儀檢測過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞凋亡能力的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞的凋亡水平明顯升高(F=421.243,P<0.01)，提示過表達miR-30a-5p能促進HGC-27細胞凋亡，見圖2C。

圖2 過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞增殖能力的影響

2.3過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞糖酵解功能的影響:通過ELISA試劑盒檢測過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞中ATP和乳酸產(chǎn)生的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞的ATP水平明顯降低(F=311.143,P<0.01)，同時乳酸水平也明顯降低(F=324.142,P<0.01)，提示過表達miR-30a-5p能抑制HGC-27細胞中ATP和乳酸的產(chǎn)生，從而抑制HGC-27細胞的糖酵解功能，見圖3。

圖3 過表達miR-30a-5p對HGC-27細胞中ATP和乳酸產(chǎn)生的影響

2.4雙熒光酶素報告實驗檢測miR-30a-5p和URGCP之間的靶向關(guān)系:通過Starbase生物信息網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)分析預(yù)測，miR-30a-5p與URGCP之間存在潛在的結(jié)合位點，見圖4A。雙熒光酶素報告實驗結(jié)果顯示，相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組細胞中的URGCP-WT熒光酶素活性明顯降低(t=15.143,P<0.01)，而對miR-30a-5p mimic組細胞中的URGCP-MUT熒光酶素活性無明顯影響(t=1.873,P=0.172)，見圖4B。隨后，通過RT-PCR檢測過表達miR-30a-5p對URGCP表達的影響。相比較miR-NC組，miR-30a-5p mimic組的URGCP表達明顯降低(F=431.139,P<0.01)，見圖4C。上述結(jié)果表明miR-30a-5p可以直接靶向集合URGCP并負調(diào)控URGCP在HGC-27細胞中的表達。

圖4 雙熒光酶素報告實驗檢測miR-30a-5p和URGCP之間的靶向關(guān)系

2.5共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質(zhì)粒對HGC-27細胞增殖和凋亡的影響:相比較pcDNA-NC組，pcDNA-URGCP組URGCP明顯升高(F=336.297,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組，pcDNA-URGCP+miR-30a-5p mimic組URGCP明顯降低(F=451.192,P<0.01)，見圖5A。隨后，通過CCK-8實驗檢測共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP對HGC-27細胞增殖能力的影響。相比較pcDNA組，pcDNA-URGCP組細胞增殖活性在72h時明顯升高(F=298.123,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組細胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP組細胞的增殖活性在72h時明顯降低(F=314.342,P<0.01)，預(yù)示了過表達URGCP能緩解miR-30a-5p mimic對HGC-27細胞增殖活性的抑制作用，見圖5B。通過流式細胞儀檢測共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP對HGC-27細胞凋亡能力的影響。相比較pcDNA組，pcDNA-URGCP組細胞增凋亡水平明顯降低(F=441.194,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組細胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP組細胞的凋亡水平明顯升高(F=493.192,P<0.01)，預(yù)示了過表達URGCP能緩解miR-30a-5p mimic對HGC-27細胞凋亡水平的促進作用，見圖5C。

圖5 共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質(zhì)粒對HGC-27細胞增殖能力的影響

2.6共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質(zhì)粒對HGC-27細胞糖酵解功能的影響:最后，通過ELISA試劑盒檢測共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和pcDNA-URGCP對HGC-27細胞中ATP和乳酸產(chǎn)生影響。相比較pcDNA組，pcDNA-URGCP組細胞的ATP和乳酸水平明顯升高(F=392.231,P<0.01；F=332.832,P<0.01)。相比較pcDNA-URGCP組細胞，miR-30a-5p mimic+pcDNA-URGCP組細胞的ATP和乳酸水平明顯降低(F=413.141,P<0.01；F=392.194,P<0.01)，預(yù)示了過表達URGCP能緩解miR-30a-5p mimic對HGC-27細胞糖酵解功能的抑制作用，見圖6。

圖6 共轉(zhuǎn)染miR-30a-5p mimic和URGCP過表達質(zhì)粒對HGC-27細胞中ATP和乳酸產(chǎn)生的影響

3 討 論

最近研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p在GC中具有腫瘤抑制作用[6]。然而，miR-30a-5p調(diào)控GC發(fā)生發(fā)展的分子機制仍尚不清楚。本研究揭示了miR-30a-5p在GC中的表達模式及其對GC細胞生物學過程的調(diào)控。發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p在GC細胞中的表達明顯降低。此外，下調(diào)miR-30a-5p表達能有效抑制GC細胞增殖和糖酵解，并促進細胞凋亡。此外，還揭示了miR-30a-5p可以負靶向調(diào)控URGCP。過表達URGCP能緩解miR-30a-5pmimic對GC細胞生長的抑制作用。

MiR-30a-5p作為一種被廣泛研究的非編碼RNAs已被報道在多種腫瘤中發(fā)揮作用[8,9]。例如，沉默miR-30a-5p基因可以通過靶向Septin-7和PRDM1基因來抑制膠質(zhì)瘤細胞生長[10]。結(jié)腸癌中，過表達miR-30a-5p可以通過靶向DLT抑制癌細胞的增殖。目前miR-350-5p在GC中的研究局限于miR-30a-5p在GC中可以作為抑癌因子存在，抑制細胞增殖、遷移和侵襲緩解GC細胞生長。本研究顯示miR-30a-5p在GC細胞系中的表達明顯降低，提示其下調(diào)可能參與GC的發(fā)生發(fā)展。隨后，證實了miR-30a-5p過表達可以顯著抑制HGC-27細胞的增殖并誘導細胞凋亡，提示miR-30a-5p對GC有明顯的抑制作用。此外，研究首次證實了miR-30a-5p對GC細胞糖酵解功能的影響。研究表明大多數(shù)癌細胞即使在有氧氣的情況下也會優(yōu)先利用糖酵解，而不是線粒體氧化磷酸化來獲取能量。這種能量代謝方式可以滿足包括GC細胞在內(nèi)各種腫瘤細胞的快速增殖和惡性進展加劇。本研究結(jié)果首次證實在HGC-27細胞中過表達miR-30a-5p在抑制細胞增殖并誘導凋亡的同時，能顯著減少HGC-27細胞內(nèi)ATP和乳酸的產(chǎn)生，這一結(jié)果表明了miR-30a-5p可以通過抑制GC細胞的糖代謝過程發(fā)揮抑癌作用。

由于miRNAs可以通過負調(diào)控其靶mRNA蛋白表達影響GC細胞的生長，本研究繼續(xù)探討了miR-30a-5p在GC中的可能靶點。生物信息學分析表明，URGCP是miR-30a-5p的潛在靶點。為了驗證這一預(yù)測，進行了熒光素酶報告分析。結(jié)果表明，miR-30a-5p與URGCP mRNA的3'UTR直接結(jié)合，提示URGCP是miR-30a-5p的直接靶點。進一步觀察后，HGC-27細胞中URGCP的表達是由miR-30a-5p在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控的。既往報道顯示，URGCP是一種細胞增殖上調(diào)因子，在多種腫瘤的生長過程中發(fā)揮著促進作用。在GC中也有研究報道，miR-671-5p通過靶向URGCP抑制GC細胞增殖，促進細胞凋亡，對胃癌具有保護作用。然而，關(guān)于URGCP在GC中的上游調(diào)控機制仍需要進一步探索。在本研究中，URGCP表達的上調(diào)明顯逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p過表達對HGC-27細胞增殖及糖酵解的抑制作用和細胞凋亡的促進作用，表明URGCP在miR-30a-5p介導的抑制GC細胞生長中起下游效應(yīng)。

本研究證明了miR-30a-5p作為一種在GC中顯著下調(diào)的miR，可以通過直接靶向URGCP抑制GC細胞的增殖和糖酵解，并誘導細胞凋亡。這些結(jié)果進一步揭示了miR-30a-5p/URGCP軸在GC中的調(diào)控機制，提示了miR-30a-5p可以作為GC治療的潛在靶點。