李貽珍 張衛(wèi)兵 張忠明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院/甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

凝乳酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，在世界范圍內(nèi)被廣泛使用，來源眾多[1]。相較植物源和動物源的凝乳酶，微生物源的凝乳酶以其顯著的優(yōu)點備受關(guān)注[2]。近年來，源自芽孢桿菌的凝乳酶因其獲取方法便捷、凝乳活性強、安全性高，且在干酪成熟過程中產(chǎn)生的苦澀味物質(zhì)少[3]等優(yōu)點引起了學術(shù)界的廣泛關(guān)注。

研究表明，利用凝乳酶生產(chǎn)干酪時，在預熱的鮮乳中添加適宜濃度的凝乳酶后，幾分鐘內(nèi)即可引發(fā)酪蛋白凝聚反應(yīng)[4]，這種快速的凝膠聚集活動是牛乳中酪蛋白膠體-磷酸鈣顆粒(即酪蛋白膠束)穩(wěn)定性被破壞所導致的結(jié)果[5-6]。隨著鈣離子含量的增加，酪蛋白形成凝膠結(jié)構(gòu)的硬度不斷增大，這也是在制作干酪的牛乳中添加一定量氯化鈣的本質(zhì)原因[7]。因此，添加鈣離子濃度與凝乳時間、凝乳效果、干酪產(chǎn)率等密切相關(guān)[8]，適量添加氯化鈣可以縮短凝乳時間，增大凝塊硬度，使干酪質(zhì)地更加緊致[9-10]。

通常情況下，在凝乳過程中，黏度值用于表示蛋白質(zhì)之間的相互作用力，隨著凝聚反應(yīng)的進行，酪蛋白膠束間距離縮小，凝膠結(jié)構(gòu)體積變大，從而使黏度值逐漸變大；濁度值表示酪蛋白膠束的聚集程度，凝乳體系對光的透過率越低，濁度值越大；而乳清光密度(optical density，OD)值是凝乳過程中排出乳清的吸光值，體系中蛋白聚集率越高，乳清OD值越?。涣街抵饕改勰z束的體積，隨著凝乳過程的進行，膠束體積不斷增大，粒徑值也隨之變大；持水力表示體系中束縛水的含量，凝乳后體系的持水力越大，表示凝塊中束縛水含量越高；儲能模量(即彈性模量)G′是凝乳過程中評價凝乳網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)強度的重要指標，指在振動條件下每個應(yīng)變周期所儲存的能量大小。趙笑等[11]在研究一種酒曲凝乳酶時發(fā)現(xiàn)，隨著氯化鈣添加量的增加，體系凝乳時間明顯提前，持水力、黏度值逐漸增大。Udabage等[12]研究表明，適當增加鈣離子含量可增大凝乳體系的黏度值和凝塊硬度，有利于縮短凝乳時間。Sbodio等[13]研究表明，在一定范圍內(nèi)，凝乳酶的凝乳性能與鈣離子濃度呈正相關(guān)關(guān)系，鈣離子的存在有利于酪蛋白的凝聚，且可以有效地改善凝乳結(jié)構(gòu)，使蛋白聚集地均勻有致。目前，隨著干酪市場的不斷擴大，關(guān)于傳統(tǒng)凝乳酶替代品的研究雖然較多，但微生物凝乳酶的探索研究仍限制很大，特別是關(guān)于細菌凝乳酶在凝乳過程中凝乳特性的研究還鮮有報道。在干酪生產(chǎn)中，影響凝乳酶作用的條件有很多，主要包括pH值、溫度、鈣離子濃度、凝乳酶添加量、底物濃度等因素。因此，研究不同凝乳條件對細菌凝乳酶凝乳性能的影響有重要意義。

甘肅省功能乳品工程實驗室前期已從甘肅省天祝藏族自治縣牦牛牧區(qū)土壤中篩選得到一株高效產(chǎn)凝乳酶的地衣芽孢桿菌菌株D3.11，并已詳細考察了地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶在不同pH值[14]、不同溫度[15]條件下的凝乳特性。本研究旨在不同氯化鈣添加量條件下，探究地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶在凝乳過程中及凝乳后的相關(guān)特性，并以商品酶為對照，分析氯化鈣添加量對該酶凝乳性能的影響，以期為細菌凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 新鮮荷斯坦牛乳，甘肅農(nóng)業(yè)大學奶牛場；地衣芽孢桿菌 D3.11(BacilluslicheniformisD3.11)，由甘肅省功能乳品工程實驗室分離純化并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(保藏編號為 CGMCC NO：3289)；麩皮，淮南鴻汶農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；商品凝乳酶(由70%皺胃酶和30%牛胃蛋白酶組成，活力100 000 U·g-1)，深圳富晟生物科技有限公司；纖維素透析袋(12 000～14 000 Da)，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 尼羅紅(超級純)，梯希愛(上海)化城工業(yè)發(fā)展有限公司；無水乙醇(分析純)，甘肅易飛儀器科技有限公司；氯化鈣(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。其他試驗試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蛋白胨10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。麩皮培養(yǎng)基：麩皮18 g、水100 mL，煮沸10 min，然后用4層紗布過濾，將濾液補水至100 mL，121℃滅菌25 min。液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.2～7.4。

1.2 儀器與設(shè)備

LSM 800型激光掃描共聚焦顯微鏡，德國卡爾·蔡司股份公司；754 PC型紫外可見光分光光度計，上海光譜儀器有限公司；LVDV-1型數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計，上海方瑞儀器有限公司；Discovery HR-1型混合流變儀，美國TA Instruments公司；Bettersize2600激光粒度分布儀，丹東百特儀器有限公司；Scientz-ND型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 菌株發(fā)酵試驗

1.3.1 菌種活化 將實驗室斜面保藏的BacilluslicheniformisD3.11菌種轉(zhuǎn)接至斜面種子培養(yǎng)基上，先在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，再接入液體培養(yǎng)基于37℃、175 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 粗酶液發(fā)酵 將活化后的液體菌液以4%的接種量接入麩皮培養(yǎng)基中，37℃搖床(轉(zhuǎn)速175 r·min-1)培養(yǎng)72 h，8 000 r·min-1離心10 min后得到粗酶液。

1.4 酶液與脫脂乳的制備

1.4.1 地衣芽孢桿菌凝乳酶的制備 向粗酶液中邊緩慢攪拌邊加硫酸銨細粉末，磁力攪拌2 h，使硫酸銨充分溶解，飽和度達到20%。然后于4℃、8 000 r·min-1條件下離心15 min，收集上清液，緩慢加入硫酸銨至飽和度達到75%；4℃冰箱中靜置過夜，8 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于0.05 mol·L-1、 pH值6.2的磷酸緩沖液中，置于透析袋中，在4℃條件下透析20 h。將透析后的酶液，倒入鋁盒置于真空冷凍干燥機凍干23 h，收集酶粉，-20℃保存。

1.4.2 酶液的配制 稱取一定量的地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶酶粉，溶解于磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1， pH值6.2)中，將其酶活調(diào)整為150 SU·mL-1，40℃條件下預熱5 min備用。稱取商品酶5 g，加適量蒸餾水溶解后，調(diào)整酶活為150 SU·mL-1，40℃條件下預熱5 min備用。

1.4.3 脫脂乳的制備 取新鮮荷斯坦牛乳于4 000 r·min-1離心20 min去除上層脂肪，加0.02%疊氮鈉備用。

1.5 試驗方法

1.5.1 黏度的測定 參照孔學民等[16]的方法。將脫脂乳在40℃條件下水浴預熱5 min，分別在6個燒杯中加入乳樣50 mL，依次按0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%添加無水氯化鈣，充分溶解后分別加入5 mL酶液，采用數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計，選取3號轉(zhuǎn)子，每隔10 min測定體系黏度值。

1.5.2 濁度的測定 參照Mizuno等[17]的方法。將脫脂乳在40℃條件下水浴預熱5 min，取乳樣各5 mL于6個離心管中，依次按0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%添加無水氯化鈣，充分溶解后加0.5 mL酶液，充分混勻，每隔5 min取少量樣品加蒸餾水稀釋，采用紫外可見光分光光度計在450 nm處測定體系的透光率(T%)，以(100-T)%代表濁度。

1.5.3 粒徑的測定 參照Glantz等[18]的方法，采用激光粒度分布儀測定凝乳過程中酪蛋白聚集體粒徑分布。將脫脂乳在40℃條件下水浴預熱5 min，取乳樣各5 mL于6個離心管中，依次按0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%添加無水氯化鈣，充分溶解后加入0.5 mL酶液，充分混勻，在室溫下凝乳0、10、20 min后，采用激光粒度分布儀測定凝乳酶誘導的酪蛋白膠束聚集體粒徑大小，凝乳酶的添加對應(yīng)時間為0 min。樣品和水的折射率分別為1.52和1.33。以中位徑D50表示酪蛋白膠束的平均粒徑。

1.5.4 流變學特性的測定 參照Zhang等[1]的方法，并略作修改。將脫脂乳在40℃條件下水浴預熱5 min，取乳樣各5 mL于6個離心管中，依次按0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%添加無水氯化鈣，充分溶解后加入0.5 mL酶液，充分混勻，分別取不同鈣離子濃度條件下乳樣4 mL，加0.4 mL酶液，混勻30 s后立即轉(zhuǎn)移到流變儀玻耳帖平板上測定儲能模量 (G′)，其中測試溫度為40℃，測試探頭為60 mm平行板，間隙1 000 μm，頻率1 Hz，應(yīng)力0.1 Pa，采點間隔5 s，測定時長60 min。所有測試均在線性粘彈性區(qū)域內(nèi)。

1.5.5 持水力的測定 參照《GB 5009.239-2016 食品安全國家標準 乳和乳制品酸度的測定》[19]。取脫脂乳各5 mL于6個10 mL離心管中，依次按0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%添加無水氯化鈣，充分溶解后加入0.5 mL酶液，充分混勻，在40℃條件下凝乳30 min，于4℃、7 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清稱重。按照公式計算乳樣持水力：

持水力=上清質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100%

1.5.6 乳清OD值的測定 參照李偉等[20]的方法。取脫脂乳各5 mL于6個10 mL離心管中，依次按0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%添加無水氯化鈣，充分溶解后加入0.5 mL酶液，充分混勻，40℃條件下凝乳30 min，4℃、7 000 r·min-1條件下離心10 min，取上層排出的乳清，用紫外可見光分光光度計測定乳清在500 nm處的吸光值。

1.5.7 凝塊微觀結(jié)構(gòu)的測定 參考Lopez等[21]的方法。在脫脂乳中分別添加地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶和商品酶酶液，凝乳60 min，使用不銹鋼刀片從凝乳樣品切取4 mm×5 mm×2 mm的薄片，置于帶槽載玻片上，加2滴尼羅紅乙醇溶液(0.1 g·L-1)于暗室中染色6 min；染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗染料，然后蓋上蓋玻片在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)重復測定3次。采用Origin 8.0軟件進行繪圖，并用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝乳過程中黏度的變化

由圖1-A可知，當鈣離子濃度為0.014%時，凝乳40 min時兩種酶體系的黏度均達到峰值。此時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的最大黏度值為3 352 mPa·s，商品酶體系的最大黏度值為3 349 mPa·s。在凝乳40～60 min內(nèi)，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系比商品酶體系下降得更快。由圖1-B可知，當鈣離子濃度為0.016%時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度在凝乳50 min時達到最大值(3 342 mPa·s)， 商品酶體系的黏度值在凝乳30 min時達到最大值(3 278 mPa·s)，兩種酶體系的黏度值在30 min后均保持穩(wěn)定。

注：A～F分別代表氯化鈣添加量為0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%。不同小寫字母表示不同凝乳時間之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A～F represent 0.014%, 0.016%, 0.018%, 0.020%, 0.022%, 0.024% of CaCl2addition, respectively.Different lowercase letters indicate significant difference among different curd times at 0.05 level. The same as following.圖1 不同氯化鈣添加量條件下凝乳過程中黏度的變化Fig.1 The change of viscosity during the skimmed milk coagulation process under different CaCl2 addition

圖1-C～E表明，當鈣離子濃度為0.018%、0.020%、0.022%時，兩種酶體系的黏度值在凝乳0～20 min內(nèi)逐漸增大，兩種酶體系的黏度值有凝乳20 min時達到峰值(地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系峰值分別是3 334、3 351、3 354 mPa·s，商品酶體系峰值分別是3 340、3 348、3 342 mPa·s)，凝乳20～60 min內(nèi)，兩種酶體系的黏度值保持穩(wěn)定，變化不顯著(P>0.05)。

由圖1-F可知，當氯化鈣添加量為0.024%時，兩種酶體系的黏度值在凝乳10 min時達到最大(地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶為3 349 mPa·s，商品酶體系為3 353 mPa·s)，當凝乳時間為20～60 min時，兩種酶體系的黏度值均顯著下降(P<0.05)，且地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的黏度值比商品酶體系的黏度值下降更快。

2.2 凝乳過程中濁度的變化

由圖2可知，當氯化鈣添加量為0.014%～0.022%時，凝乳0～20 min內(nèi)兩種酶體系的濁度值均隨鈣離子濃度的增加而增大。其中，當氯化鈣添加量為0.020%時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系濁度值在凝乳20 min內(nèi)分別增長了22.13、12.60、7.50、9.31，商品酶體系濁度值在凝乳20 min內(nèi)分別增長了23.76、8.77、12.09、6.06；當氯化鈣添加量為0.022%時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系濁度值在凝乳20 min內(nèi)分別增長了24.48、9.28、10.87、9.03，商品酶體系濁度值在凝乳20 min內(nèi)分別增長了28.10、8.47、8.49、6.79。這說明鈣離子在促進酪蛋白組分凝聚過程中起到了促進作用[22]，隨著蛋白微粒凝聚體體積的增大，透過率降低，濁度值增大。

圖2 不同氯化鈣添加量條件下濁度的變化Fig.2 The change of turbidity under different CaCl2addition

2.3 凝乳過程中粒徑的變化

由圖3-A、D可知，凝乳0 min時，兩種酶體系的蛋白粒徑分布均呈單峰分布，且氯化鈣添加量越小，峰向分布越偏向左側(cè)。由圖3-B、E可知，凝乳10 min時，兩種酶體系的蛋白粒徑分布以雙峰為主，兩種酶體系的主峰均在氯化鈣添加量為0.014%時分布最左，即粒徑值增長最慢；此時，商品酶體系的平均粒徑較地衣芽孢桿菌凝乳酶體系的粒徑更大，仍然呈現(xiàn)出鈣離子濃度越大、體系蛋白粒徑值越大的趨勢，且兩種酶體系的粒徑變化差異較大。由圖3-C、F可知，凝乳20 min時，兩種酶體系的粒徑分布出現(xiàn)多峰分布現(xiàn)象，但主峰明顯，其中地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的主峰主要分布在136.9～246.7 μm范圍內(nèi)，且當氯化鈣添加量為0.020%時粒徑值最大；商品酶體系的主峰主要分布在108.1～154.0 μm范圍內(nèi)，且當氯化鈣添加量為0.022%時粒徑值最大；總體來說，在凝乳0～20 min時，粒徑值隨氯化鈣添加量的增加而增大，變化速度也隨之越快。

注：A、B、C分別表示地衣芽孢桿菌凝乳酶體系凝乳0、10、20 min時蛋白聚集體粒徑分布；D、E、F分別表示商品酶體系凝乳0、10、20 min時蛋白聚集體粒徑分布。Note: A, B and C represent the particle size distribution of protein aggregates in the Bacillus licheniformis D3.11 rennet system at 0, 10 and 20 min of coagulation, respectively. D, E and F represent the particle size distribution of protein aggregates in the commercial rennet system at 0, 10 and 20 min of coagulation, respectively.圖3 不同氯化鈣添加量條件下凝乳過程中蛋白聚集體粒徑分布圖Fig.3 Particle size distribution of protein aggregates during enzyme coagulation process under different CaCl2addition

2.4 凝乳過程中的流變學特性

儲能模量的大小代表凝乳過程中凝結(jié)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強度，儲能模量G′值越大，凝乳網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強度越大，凝乳結(jié)構(gòu)中的鍵合數(shù)目越多。

由圖4-A可知，當氯化鈣添加量分別為0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系儲能模量G′的峰值分別為49.51、43.27、30.21、26.96、43.81、37.86 Pa，達到峰值的時間分別是383、371、366、333、327、316 s。由圖4-B可知，商品酶體系儲能模量G′的峰值分別為14.16、32.54、34.42、30.07、47.56、58.27 Pa，達到峰值的時間為156、144、139、122、105、101 s。由此可知，商品酶體系達到峰值的時間依次提前了12、5、17、17、4 s，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系達到峰值的時間依次提前了12、5、33、6、11 s，說明商品酶體系所能達到儲能模量G′的峰值比地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的更大，且兩種酶體系儲能模量G′到達峰值的時間均隨鈣離子濃度上升而縮短。綜上所述，添加適宜濃度的鈣離子可以促使凝乳過程中儲能模量G′的增大，且隨著鈣離子濃度的上升，儲能模量G′增大的速率也隨之增大。

注：A：地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系；B：商品酶體系。Note: A : The Bacillus licheniformis D3.11 rennet system. B: The commercial rennet system.圖4 不同氯化鈣添加量條件下儲能模量G′的變化Fig.4 The change of storage modulus inenzyme coagulation process under different CaCl2addition

2.5 持水力變化

由圖5可知，0.014%、0.016%、0.018%、0.020%氯化鈣添加量下，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的持水力分別為78.36%、86.36%、94.18%、97.09%，依次顯著增加了8.00、7.82、2.91個百分點(P<0.05)；商品酶體系的持水力分別為80.00%、87.09%、94.73%、97.64%，依次顯著增加了7.09、7.64、2.91個百分點(P<0.05)。

當氯化鈣添加量由0.022%增加到0.024%時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的持水力降低了4.57個百分點，商品酶體系的持水力降低了2.93個百分點，說明當氯化鈣添加量大于0.022%時，鈣離子對持水力的增大有抑制作用。

2.6 乳清OD值的變化

乳清OD值是凝乳過程中排出乳清的吸光值，乳清OD值越小，表示乳清中蛋白質(zhì)量分數(shù)越低。由圖6可知，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶和商品酶體系的乳清OD值隨鈣離子濃度的增大呈不斷增大的趨勢。當氯化鈣添加量為0.014%、0.016%、0.018%、0.020%、0.022%、0.024%時，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的乳清OD值分別為0.263、0.367、0.377、0.383、0.394、0.446，商品酶體系的乳清OD值分別為0.251、0.321、0.362、0.377、0.382、0.412。其中，當氯化鈣添加量由0.022%增加到0.024%時，鈣離子對兩種酶體系乳清OD值的影響最顯著(P<0.05)，地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的乳清OD值增大了13.20%，商品酶體系的乳清OD值增大了7.85%。

2.7 氯化鈣添加量對凝乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖7為激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)的不同氯化鈣添加量條件下凝乳的微觀結(jié)構(gòu)，橫向表示不同凝乳酶，縱向表示不同氯化鈣添加量。當氯化鈣添加量為0.014%時，商品酶體系形成的蛋白微粒比地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的蛋白微粒更大，微粒間孔隙更小(圖7-A、D)；當氯化鈣添加量為0.018%時，兩種酶體系的孔隙無較大差別，蛋白凝聚好，結(jié)構(gòu)致密，且商品酶體系形成的蛋白凝聚結(jié)構(gòu)的孔洞更小(圖7-B、E)；當氯化鈣添加量為0.022%時，商品酶體系形成的蛋白聚集體比地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的蛋白聚集體更緊密，顆粒更均勻(圖7-C、F)?？傮w來說，隨著氯化鈣添加量的增加，兩種酶體系所呈現(xiàn)的蛋白聚集均凝結(jié)的更緊密，說明在一定范圍內(nèi)，添加適量的氯化鈣對蛋白凝聚有促進作用。

3 討論

3.1 氯化鈣添加量對凝乳體系特性的影響

前人研究表明，在游離鈣離子存在條件下，酪蛋白凝聚速度加快，黏度值隨凝乳進程逐漸增大[23]；當鈣離子濃度過高時，會導致酪蛋白凝聚不徹底，質(zhì)地松散，從而使黏度值下降[24]。此外，鈣離子含量的增加促進了蛋白微粒的凝聚，隨著凝聚體體積的增大，透過率降低，濁度值增大[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，當氯化鈣添加量大于0.022%時，兩種酶體系的濁度值在凝乳5 min時先上升后減小，可能是因為鈣離子濃度過高，導致蛋白微粒凝聚較快，乳清中透過率增大，濁度值緩慢減小。兩種酶體系儲能模量G′到達峰值的時間均隨氯化鈣添加量的增加而縮短，說明添加適量的氯化鈣可以促使凝乳過程中儲能模量G′的增大，且隨著鈣離子濃度的上升，儲能模量G′增大的幅度也隨之增大，這與倪瑩宙[26]的研究結(jié)果基本一致。鈣離子濃度的降低會顯著減緩蛋白凝膠的形成過程，在適宜的范圍內(nèi)，鈣離子濃度越高，酪蛋白凝聚越快，最終形成的蛋白膠束粒徑也越大[10,27-28]。

注：不同小寫字母表示不同氯化鈣添加量之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different curd times at 0.05 level. The same as following.圖5 不同氯化鈣添加量條件下持水力的變化Fig.5 The change of water-holding capacity under different CaCl2addition

圖6 不同鈣離子濃度條件下乳清OD值的變化Fig.6 The change of whey OD value under different CaCl2addition

注：紅色部分為被尼羅紅染色的乳蛋白；黑色部分即孔隙為水相。Note: The red part is milk protein stained by Nile red. The black part is water phase.圖7 不同氯化鈣添加量對凝乳微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effects of different CaCl2 addition on the microstructure of curd

3.2 氯化鈣添加量對乳清析出和凝塊結(jié)構(gòu)的影響

持水力是蛋白質(zhì)凝聚過程中很重要的一個物理特性，強烈依賴于鈣離子的含量，通常情況下，隨著鈣離子濃度的增大，乳清的析出率會上升，持水力會降低[29-31]。趙笑等[11]研究表明，當氯化鈣添加量達到0.040%時，凝乳時間、黏度值和持水力的變化均不明顯；當氯化鈣添加量小于0.020%時，表現(xiàn)出的凝乳效果較好。Amaro-hernndez等[32]研究發(fā)現(xiàn)凝乳體系中鈣離子濃度過低會導致乳清中酪蛋白聚集不徹底，透過率降低，乳清OD值增大，但若鈣離子濃度過高，酪蛋白凝聚速度過快，則會造成蛋白損失，使乳清中蛋白含量增加，乳清OD值增大。這與本試驗中乳清OD值的變化規(guī)律一致。通過觀察微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，鈣離子濃度的增加有利于微觀蛋白粒子的凝聚，這與Priyashantha等[8]的研究結(jié)果相似。本試驗中，兩種酶體系的持水力均隨氯化鈣添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，這可能是由于鈣離子含量的增加使凝乳體系中的蛋白發(fā)生自我絮凝，乳清析出量增多，從而使得持水力下降，與Belenkaya等[33]的研究結(jié)果相近。

4 結(jié)論

本研究通過在不同氯化鈣添加量條件下，對地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶體系的凝乳過程和凝塊品質(zhì)進行分析，基本掌握了氯化鈣添加量影響地衣芽孢桿菌D3.11凝乳酶凝乳性能的規(guī)律。當氯化鈣添加量在0.016%～0.022%時，凝乳體系的黏度、濁度均隨鈣離子濃度的增大而增大，粒徑變化較快，達到儲能模量G′峰值的時間較短。當氯化鈣添加量為0.020%時，持水力達到最大，微觀蛋白凝聚體均勻度最佳，凝乳效率及凝塊品質(zhì)均明顯提高。