翟芬芬 劉毓菲 張傳濤 楊洋 黃青松 高培陽 陳新

〔摘要〕 目的 基于網(wǎng)絡藥理學與生物信息學研究方法，探討小青龍湯治療慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）和哮喘“異病同治”的療效及其作用機制。方法 通過ETCM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫搜集小青龍湯治療COPD和哮喘的作用靶點。通過STRING 11.0分析作用靶點之間的相互關系，運用cytoNCA和MCODE插件篩選出核心作用靶點。使用ClueGO和DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行KEGG通路富集分析和GO功能分析。在GEO數(shù)據(jù)庫下載COPD和哮喘的基因芯片，運用R語言sav包去批次效應后驗證核心作用靶點是否差異表達，并對差異表達明顯的核心靶點進行分子對接驗證。結果 共篩選出小青龍湯治療COPD和哮喘的作用靶點95個，篩選出19個核心作用靶點。富集分析結果顯示共涉及82條信號通路及120種生物過程、16種分子功能、21種細胞組分。GEO芯片驗證顯示NR3C1、HSP90AA1、TNF、CASP3、AKT1、PTGS2、TLR4、EGF、IL1B、HRAS在COPD和哮喘與健康樣本之間具有明顯的表達差異，繪制中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡圖后，進一步對Degree值前5的靶點進行分子對接，結果顯示活性成分與關鍵靶點有良好的親和力。結論 小青龍湯主要通過NR3C1、HSP90AA1、TNF、CASP3、AKT1、PTGS2、TLR4、EGF、IL1B、HRAS等多靶點和TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等途徑發(fā)揮對COPD與哮喘“異病同治”作用。

〔關鍵詞〕 小青龍湯;慢性阻塞性肺疾病;哮喘;網(wǎng)絡藥理學;GEO數(shù)據(jù)庫;分子對接

〔中圖分類號〕R285 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.014

Mechanism of "treating different diseases with same method" of Xiaoqinglong Decoction in

treating asthma and chronic obstructive pulmonary disease based on network

pharmacology and bioinformatics

ZHAI Fenfen1， LIU Yufei2， ZHANG Chuantao2*， YANG Yang2， HUANG Qingsong2， GAO Peiyang3， CHEN Xin4

（1. Futian Center for Chronic Disease Control， Shenzhen， Guangdong 518000， China; 2. Department of Respiratory Medicine， Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu， Sichuan 610072， China; 3. Department of

Intensive Care Medicine， Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu， Sichuan 610072， China;

4. Department of Integrated Traditional and Western Medicine， Zigong First People's Hospital， Zigong， Sichuan 643000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the efficacy and the mechanism of "treating different diseases with same method" of Xiaoqinglong Decoction for chronic obstructive pulmonary disease （COPD） and asthma based on network pharmacology and bioinformatics research methods. Methods The targets of Xiaoqinglong Decoction for COPD and asthma were collected through ETCM database， DisGeNET database， GeneCards database and OMIM database. The interrelationships between the targets were analyzed by STRING 11.0， and the core targets were screened using cytoNCA and MCODE plug-ins. KEGG pathway enrichment analysis and GO functional analysis were performed on the acting targets using ClueGO and DAVID databases. Gene chips for COPD and asthma were downloaded from the GEO database， and the R language sav package was applied to verify whether the core acting targets were differentially expressed after de-batching effect， and molecular docking was performed to verify the core targets with significant differential expression. Results A total of 95 action targets of Xiaoqinglong Decoction for COPD and asthma were screened， and 19 core action targets were screened. The results of enrichment analysis showed that a total of 82 signaling pathways and 120 biological processes， 16 molecular functions and 21 cellular components were involved. The GEO microarray validation showed that NR3C1， HSP90AA1， TNF， CASP3， AKT1， PTGS2， TLR4， EGF， IL1B， HRAS had significant expression between COPD and asthma and healthy samples. After mapping the herbal-compound-target network， further molecular docking of the targets in the top five of Degree showed that the active ingredients had good affinity with the key targets. Conclusion Xiaoqinglong Decoction mainly exerted the effect of "treating different diseases with same method" on COPD and asthma through multiple targets such as NR3C1， HSP90AA1， TNF， CASP3， AKT1， PTGS2， TLR4， EGF， IL1B， HRAS and signaling pathways such as TNF signaling pathway and Toll-like receptor signaling pathway.C6DB3500-88BA-4F5F-91C4-FED76FA56888

〔Keywords〕 Xiaoqinglong Decoction; chronic obstructive pulmonary disease; asthma; network pharmacology; GEO database; molecular docking

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）和支氣管哮喘嚴重威脅著人類健康。COPD是以持續(xù)氣流受限為特征的一種可防治的疾病，氣流受限多呈進行性發(fā)展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的炎性反應有關[1]。哮喘是一種由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[2]，常伴廣泛多變的可逆性氣流受限?！爱惒⊥巍笔侵嗅t(yī)重要的診療特色，小青龍湯可以有效治療COPD與哮喘，這體現(xiàn)了中醫(yī)“異病同治”原則，小青龍湯出自醫(yī)圣張仲景的《傷寒雜病論》，有解表散寒、溫肺化飲之功[3]。臨床研究表明，小青龍湯能夠有效改善COPD與哮喘患者咳嗽、咯痰等臨床癥狀，從而改善肺功能[4-5]。但是小青龍湯治療COPD與哮喘的異病同治分子機制尚待闡明，因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法探討小青龍湯“異病同治”對COPD和哮喘的作用機制。

1 資料與方法

1.1 ?小青龍湯的活性成分與靶點收集

小青龍湯含麻黃、桂枝、白芍、細辛、五味子、干姜、半夏、炙甘草8味中藥。在中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）[6]依次檢索有效成分與作用靶點，以可信度

≥0.8為條件進行篩選。

1.2 ?COPD和哮喘的疾病靶點收集

利用疾病相關的基因與突變位點數(shù)據(jù)庫（DisGeNET，https：//www.disgenet.org/，version 7.0）[7]、人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/，version 5.0）[8]、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/），以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”“Asthma”為關鍵詞檢索相關靶點，將3個數(shù)據(jù)庫檢索的靶點整合去重，即為COPD和哮喘的疾病靶點。

1.3 ?小青龍湯治療COPD與哮喘靶點網(wǎng)絡構建

運用jvenn在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html）[9]繪制小青龍藥物靶點與COPD和哮喘疾病靶點韋恩圖。將小青龍-COPD-哮喘的共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/，version 11.0），物種選擇“Homo Sapiens”，閾值選擇“Medium Confidence”，進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡構建，并下載TSV文件。

1.4 ?小青龍湯“異病同治”作用的關鍵靶點篩選

將小青龍-COPD-哮喘PPI網(wǎng)絡的TSV文件導入Cytoscape（version 3.7.2）軟件，使用cytoNCA插件進行拓撲分析，以Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality、Eigenvector均大于中位數(shù)篩選核心網(wǎng)絡，并運用MCODE插件分析核心網(wǎng)絡，識別聯(lián)系緊密的子模塊。選取關鍵模塊進一步分析，并根據(jù)Degree值和連接強度調整網(wǎng)絡展示效果。

1.5 ?GO和KEGG富集分析

運用Cytoscape軟件的ClueGO插件對核心網(wǎng)絡關鍵模塊進行KEGG通路富集分析，運用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）[10]進行GO功能富集分析。

1.6 ?GEO芯片驗證

在GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”“Asthma”為關鍵詞檢索相關數(shù)據(jù)集。下載COPD和哮喘基因表達芯片的矩陣文件（Matrix）和平臺注釋文件（Platforms），使用平臺注釋文件對探針進行注釋，剔除沒有匹配到基因的探針;對于不同探針映射到同一基因，則計算均值作為最終表達值。運用R軟件（version 4.0.3）的sav包進行去批次效應處理，并進行主成分分析（principal component analysis， PCA）評估批次效應是否消除。然后使用ggpubr包繪制核心模塊的基因表達箱式圖。提取具有表達差異的靶點繪制藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡。

1.7 ?分子對接

根據(jù)GEO芯片驗證的結果選取Degree值前5的核心靶點進行分子對接驗證，在PubChem數(shù)據(jù)庫下載Degree值前5活性成分的SDF文件，在 PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www1.rcsb.org/）下載靶點蛋白的3D結構，利用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、去小分子配體等操作，然后利用AutoDockTools 1.5.6及AutoDock Vina軟件進行分子對接。對接結果根據(jù)自由能判斷結合強度，小于-5.0 kcal·mol-1表示有較好的結合活性，小于-7.0 kcal·mol-1表示有強烈的結合活性。

2 結果

2.1 ?小青龍湯的活性成分與靶點

通過ETCM檢索，共搜集活性成分：麻黃17個、芍藥41個、細辛7個、甘草64個、干姜9個、桂枝8個、五味子41個、半夏21個，去除重復項后共獲得小青龍湯活性成分199個。利用數(shù)據(jù)庫中靶點預測功能，對上述活性成分進行作用靶點預測，去除重復項后共獲得小青龍湯靶點581個。C6DB3500-88BA-4F5F-91C4-FED76FA56888

2.2 ?COPD和哮喘的靶點

以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”為關鍵詞在DisGeNET數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中分別檢索到相關基因1428個、2842個、536個;以“Asthma”為關鍵詞在DisGeNET數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中分別檢索到相關基因2096個、5057個、42個;在各個數(shù)據(jù)庫中對基因以Score評分≥中位數(shù)為條件進行篩選，最終整合去重后獲得COPD靶點2494個、哮喘靶點3007個。

2.3 ?PPI網(wǎng)絡構建

通過作圖工具jvenn將小青龍湯作用靶點和COPD、哮喘疾病靶點繪制韋恩圖（圖1）。獲得小青龍湯與COPD共同靶點133個，小青龍湯與哮喘共同靶點189個，COPD與哮喘共同靶點998個，小青龍湯與COPD和哮喘的共同靶點95個。將COPD與哮喘共同靶點、小青龍湯與COPD和哮喘的共同靶點上傳STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo Sapiens”，閾值選擇“medium confidence”，網(wǎng)絡展示選擇“hide disconnected nodes in the network”，得出共有靶點的PPI網(wǎng)絡。

2.4 ?小青龍湯“異病同治”作用的PPI構建與模塊分析

將PPI網(wǎng)絡的TSV文件導入Cytoscape軟件，根據(jù)Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality和Eigenvector拓撲分析后獲得一個具有32個節(jié)點、289條邊的核心網(wǎng)絡，使用MCODE插件分析獲得1個聯(lián)系緊密的子模塊，Score為17.333，包含19個節(jié)點、156條邊;其余節(jié)點未能構成模塊。選取子模塊進一步分析，以Degree值和連接強度優(yōu)化網(wǎng)絡展示。詳見圖2。

2.5 ?GO、KEGG富集分析

使用ClueGO對核心子模塊進行KEGG富集分析，根據(jù)P≤0.05篩選共獲得82條信號通路（圖3），包括恰加斯病（美國錐蟲?。NF信號通路、MAPK信號通路、百日咳、癌癥的途徑、Toll樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路等。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對模塊一進行GO分析，共獲得生物過程（biological process， BP）120項，包括一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞對機械刺激的反應、脂多糖介導的信號通路、干擾素γ產生的正調控、NF-κB導入細胞核的積極調控、MAPK活性的激活、炎癥反應等;獲得細胞組成（cellular component， CC）16個，包括蛋白質復合物、胞質溶膠、核質、細胞外區(qū)域、細胞表面等;獲得分子功能（molecular function， MF）21個，包括相同的蛋白質結合、酶結合、蛋白質結合、轉錄調控區(qū)DNA結合、一氧化氮合酶調節(jié)劑活性、細胞因子活性等，見圖4。

2.6 ?GEO芯片驗證

在GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE8545、GSE64913、GSE69683、GSE74986、GSE106986、GSE112811數(shù)據(jù)集。對6個數(shù)據(jù)集進行注釋、合并并去除批次效應，運用合并后的表達矩陣繪制核心子模塊的基因表達箱式圖。由于HIF1A未在表達矩陣中，因此僅有18個核心靶點繪制箱式圖，見圖5。由圖可知NR3C1、HSP90AA1、TNF、CASP3、AKT1、PTGS2、TLR4、EGF、IL1B、HRAS在COPD和哮喘與健康樣本表達有明顯差異。將這些靶點導入Cytocsape軟件繪制中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡圖，見圖6。

2.7 ?分子對接

選取Degree值最高的5個靶點NR3C1、HSP90AA1、TNF、CASP3、AKT1進行分子對接，結果顯示均有較高的結合活性，見表1。運用PyMOL軟件對這些結合能較高的活性成分-核心靶點分子對接結果進行可視化，見圖7。

3 討論

“異病同治”是中醫(yī)理論體系的重要診療特點，“異”是指疾病相異，“同”是指疾病的病機或證相同而給予相同的治法或方藥。COPD多屬于中醫(yī)學的“肺脹”“喘病”等范疇[11]，哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇[12]，二者病名不同，但病位都在肺，均可見痰飲伏肺，外感寒邪引觸寒飲，痰阻氣道，肺失宣降而發(fā)病。二者雖病名不同，但病因、病位、病機相似，按照“異病同治”原則，以散寒化飲、溫肺理肺為法治療COPD與哮喘，在臨床上獲得較好療效。

小青龍湯為解表散寒、溫肺化飲的代表方劑。方中麻黃、桂枝共為君藥，辛溫發(fā)汗以散表寒，麻黃宣肺以平咳喘，桂枝化氣行水以散里;臣以干姜、細辛，溫肺化飲，兼助麻桂解表散寒;五味子、白芍、半夏為佐藥，五味子斂肺止咳、白芍斂陰養(yǎng)血，防諸藥辛散、耗傷肺氣，半夏降逆和胃、燥濕祛痰;炙甘草為佐使，益氣和中、調和諸藥[3]?？v觀全方，散中有收，開中有合，外散風寒，內祛水飲，復肺氣之宣降，助水道之通調，治療外寒內飲型COPD與哮喘患者療效良好?，F(xiàn)代藥理學研究表明，小青龍湯有止咳、平喘、抗炎、抗過敏、增強免疫等作用[13]，小青龍湯能夠有效減輕哮喘和COPD患者的臨床癥狀，改善炎性指標與肺功能[4-5]。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學與生物信息學分析發(fā)現(xiàn)小青龍湯對COPD與哮喘“異病同治”的10個共同關鍵靶點：NR3C1、HSP90AA1、TNF、CASP3、AKT1、PTGS2、TLR4、EGF、IL1B、HRAS。NR3C1可以通過抑制炎癥基因轉錄發(fā)揮抗炎作用，作為COPD與哮喘主要治療藥物的糖皮質激素可以通過作用于NR3C1以減輕氣道炎癥[14]。HSP90AA1基因編碼熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α， Hsp90α），Hsp90α的上調與COPD在內的多種疾病相關[15]。TNF是經典的促炎細胞因子，在氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，與哮喘、COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關[16-17]。CASP3在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，研究表明，CASP3能通過PLK1-CASP3途徑參與調控氣道平滑肌細胞凋亡[18]。AKT1是PI3K-AKT信號通路中的重要因子，在細胞生長、存活等許多生理過程中起著關鍵作用[19]，與哮喘氣道炎癥及肺功能改變相關[20]。PTGS2激活產生前列腺素E2，作用于許多細胞信號傳導途徑，包括細胞增殖、血管生成、凋亡、侵襲和免疫抑制[21]，與哮喘、COPD氣道黏液分泌增多相關[22]，對于以長期炎癥狀態(tài)為特征的疾病如COPD，抑制PTGS2已成為其關鍵的治療目標[23]。TLR-4在調節(jié)免疫應答以及刺激炎性趨化因子和細胞因子的產生中起關鍵作用[24]，TLR-4可能通過調控TNF-α、IL-17等細胞因子的表達從而參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[25]，TLR-4表達水平增高和COPD的健康損害程度與肺功能改變具有相關性[26]。EGF刺激各種表皮和上皮組織的生長[27]，阻斷其受體的激活可促進TNF誘導的肺上皮細胞凋亡和肺損傷[28]。IL-1B是一種炎癥介質，存在于多種慢性炎癥中[29]。IL-1B參與COPD氣道炎癥[30]，并與哮喘嚴重程度密切相關[31]。一般認為NRAS與黑色素瘤密切相關[32]，研究發(fā)現(xiàn)，NRAS或參與哮喘-COPD重疊綜合征發(fā)病機制[33]。C6DB3500-88BA-4F5F-91C4-FED76FA56888

使用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析發(fā)現(xiàn)，小青龍湯對COPD、哮喘的治療作用可能與一氧化氮生物合成過程正調控、細胞對機械刺激的反應、脂多糖介導的信號通路、干擾素γ產生的正調控、NF-κB導入細胞核的正調控、MAPK活性的激活、炎癥反應等密切相關。通過使用ClueGO進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)排名靠前的通路為：TNF信號通路、MAPK信號通路、癌癥的途徑、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等。TNF-α信號傳導通路可以促進NF-κB的活化[34]，NF-κB被激活后參與哮喘氣道炎癥與氣道重塑形成的多個環(huán)節(jié)[35]，同時與COPD氣道炎癥、氣道重構密切相關[36]。MAPK信號通路包括ERK、JNK、p38等蛋白激酶，與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡相關[37]，JNK的激活能夠促進氣道上皮細胞修復[38]，激活p38會促進黏蛋白MUC5AC表達，抑制MAPK信號通路可改善氣道黏液分泌，修復氣道炎癥損傷[39]。Toll樣受體信號通路在激活免疫應答和引發(fā)炎癥反應中發(fā)揮著重要作用[40]，TLRs能識別吸入氣道的有害物質，參與COPD的發(fā)病過程，影響COPD加重次數(shù)與患者的免疫系統(tǒng)功能，由TLR-4啟動的細胞內信號最終激活NF-κB，釋放大量IL-8、IL-6等炎癥介質，從而誘導中性粒細胞與CD8+T淋巴細胞參與COPD炎癥反應[41]。TLRs與哮喘發(fā)生發(fā)展密切相關，TLRs配體引起下游TRIF和My D88信號通路激活，通過NF-κB通路導致炎性因子釋放[42]。PI3K-AKT信號通路是重要的細胞內信號傳導途徑，參與細胞增殖、凋亡、遷移、轉錄等環(huán)節(jié)[43]，與氣道慢性炎性疾病相關，能夠調節(jié)炎癥介質的釋放、炎癥細胞活化與氣道重塑[44]，干預PI3K信號通路可以減輕COPD大鼠的氣道炎癥[45]，減少哮喘小鼠炎性細胞浸潤，抑制黏液高分泌，減少氣道高反應，改善氣道重塑[46]。據(jù)GO與KEGG分析所示，小青龍湯對COPD、哮喘過程發(fā)揮“異病同治”的作用機制主要集中在減輕炎癥、抑制黏液分泌、改善氣道重塑3個方面。其中，調控Toll樣受體信號通路與PI3K-AKT信號通路、抑制下游NF-κB的激活而調節(jié)炎癥介質的釋放，可能是小青龍湯發(fā)揮“異病同治”作用的主要生物機制。

通過分子對接分析發(fā)現(xiàn)，小青龍湯中的活性成分3-Methoxyherbacetin與AKT1、HSP90AA1，活性成分6-Dimethoxyisoflavone與AKT1、HSP90AA1，活性成分5-Desgalloylstachyurin與HSP90AA，活性成分Alexandrin與CASP3，活性成分Palbinone與CASP3、TNF，活性成分Schisanlactone D與NR3C1，活性成分Sitosterol與NR3C1均有較強的結合活性，提示小青龍湯治療COPD與哮喘的活性成分與關鍵靶點有良好的親和力。

綜上所述，通過網(wǎng)絡藥理學與生物信息學分析，COPD與哮喘的發(fā)病均與NR3C1、HSP90AA1、TNF、CASP3、AKT1、PTGS2、TLR4等靶點及TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路等密切相關，具有相似的發(fā)病機制。分子對接分析提示小青龍湯治療COPD與哮喘的活性成分與關鍵靶點有良好的親和力，小青龍湯可以作用于上述靶點與通路，針對COPD與哮喘的共同發(fā)病機制，發(fā)揮“異病同治”的作用。小青龍湯能夠對COPD和哮喘“異病同治”的前提是這兩種疾病存在共同病機——“外寒內飲”，上述靶點與通路可能是“外寒內飲”的物質基礎之一，今后可以借助體內外實驗進一步驗證。

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