朱秋燕 曾鑫冰 楊筱倩 謝若曦 李笑 黃小平 鄧常清

〔摘要〕 目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以髓鞘再生的主要功能細(xì)胞少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells， OPCs）為靶點，預(yù)測益氣活血開竅組分中藥有效成分對腦缺血后白質(zhì)損傷的促修復(fù)作用。方法 從TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中預(yù)測組分中藥主要有效成分促進(jìn)腦卒中后OPCs修復(fù)腦白質(zhì)的作用靶點;整合GEO、GeneCards和CTD數(shù)據(jù)庫中獲得的腦卒中疾病靶基因，通過STRING繪制“中藥組分-疾病”靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖;并進(jìn)行GO及KEGG富集分析。同時，采用大鼠腦缺血再灌注模型，從神經(jīng)功能和形態(tài)學(xué)評價益氣活血開竅組分中藥對腦缺血再灌注后腦白質(zhì)損傷的促修復(fù)作用。結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共獲取33個疾病-藥物共同潛在靶點。PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示VEGFA、PTGS2、NTRK1、ESR2和MET等可能為核心作用靶點，富集分析主要涉及鈣離子、PI3K-Akt、VEGF、Rap1、Ras、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性和MAPK信號通路，KEGG富集分析GEO數(shù)據(jù)集差異基因結(jié)果顯示，卒中5 d和15 d均涉及PI3K-Akt信號通路。藥理學(xué)實驗結(jié)果顯示，益氣活血開竅組分中藥可改善腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能障礙，減輕腦白質(zhì)損傷和大鼠胼胝體、紋狀體髓鞘脫失。結(jié)論 益氣活血開竅組分中藥可改善腦缺血再灌注后白質(zhì)損傷，機(jī)制可能與各有效成分通過多靶點、多途徑促進(jìn)髓鞘再生和白質(zhì)修復(fù)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);益氣活血開竅組分中藥;腦缺血再灌注;髓鞘再生

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.012

Network pharmacology reseach and pharmacodynamic validation of the ingredient Chinese

medicine with Qi-benefiting， blood-activating and resuscitation on white matter

protection after cerebral ischemia

ZHU Qiuyan1，2， ZENG Xinbing1，2， YANG Xiaoqian1， XIE Ruoxi1，2， LI Xiao3， HUANG Xiaoping2*， DENG Changqing2*

（1. Laboratory of Vascular Biology， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Key Laboratory of Cerebrovascular Disease Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Medical College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective Through network pharmacology， to predict the promoting and repairing effect of effective components of the ingredient Chinese medicine with Qi-benefiting， blood-activating and resuscitation on white matter injury after cerebral ischemia with oligodendrocyte precursor cells （OPCs）， the main functional cells of myelin regeneration. Methods TCMSP， PubChem and SwissTargetPrediction databases were used to predict the targets of the effective components of ingredient Chinese medicine in promoting white matter repair of OPCs after stroke; GEO， GeneCards and CTD databases were used to search the stroke targets; PPI network diagram of "ingredient Chinese medicine-disease" targets was drew through STRING， and preformed for GO and KEGG enrichment analysis. Meanwhile， using the rat cerebral ischemia-reperfusion model， the promoting and repairing effect of effective components of the ingredient Chinese medicine with Qi-benefiting， blood-activating and resuscitation on white matter injury after cerebral ischemia was evaluated from neurological function and morphology. Results A total of 33 drug-disease common potential targets were identified in network pharmacology. PPI network and topology analysis revealed that VEGFA， PTGS2， NTRK， ESR2 and MET， etc. may be important targets， enrichment analysis mainly involved Calcium， PI3K-Akt， VEGF， Rap1， Ras， EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance and MAPK signaling pathways. KEGG enrichment analysis of differential genes in GEO data sets showed， PI3K-Akt signialing pathway was involved in both 5 and 15 days of stroke. Pharmacological experiments showed that the ingredient Chinese medicine with Qi-benefiting， blood-activating and resuscitation can improve neurological function and mitigate white matter injury after cerebral ischemia-reperfusion， reduce white matter injury and demyelination of corpus callosum and striatum in rats. Conclusion The ingredient Chinese medicine with Qi-benefiting， blood-activating and resuscitation can effectively improve white matter injury after cerebral ischemia-reperfusion and the effect may be closely related to the multi-target and multi-pathway promotion of myelin regeneration and white matter repair by each active ingredient.7E3093FA-79F3-495C-8636-0D4D21CC5D88

〔Keywords〕 network pharmacology; ingredient Chinese medicine with Qi-benefiting， blood-activating and resuscitation; cerebral ischemia-reperfusion; remyelination

腦梗死是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，具有高致死率和致殘率的特點[1-3]。腦缺血可導(dǎo)致嚴(yán)重腦損傷、神經(jīng)細(xì)胞迅速損傷和死亡[4]。長期以來，腦缺血后的神經(jīng)修復(fù)研究側(cè)重對神經(jīng)元或灰質(zhì)損傷的保護(hù)，而近年來，研究證明腦白質(zhì)完整性對于腦卒中后長時程神經(jīng)修復(fù)具有重要意義[5-6]。腦白質(zhì)是大腦內(nèi)神經(jīng)纖維聚集區(qū)域，約占人腦體積50%，也是關(guān)鍵損傷部位，它可破壞神經(jīng)元之間、皮質(zhì)和皮質(zhì)下中樞之間的信號傳遞，也可造成神經(jīng)纖維投射區(qū)的灰質(zhì)損傷，對神經(jīng)元造成二次傷害，是腦缺血后神經(jīng)功能難以恢復(fù)的重要原因[7-9]。

腦白質(zhì)主要位于腦胼胝體、紋狀體等區(qū)域，由少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes， OLs），OLs突起形成的髓鞘及髓鞘包裹的神經(jīng)元軸突三部分組成。腦白質(zhì)的主體是OLs，OLs來源于腦白質(zhì)原位的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells， OPCs）以及室管膜下區(qū)（subventricular zone， SVZ）的多潛能神經(jīng)干細(xì)胞[10]。腦缺血后，白質(zhì)中的OLs損傷導(dǎo)致神經(jīng)軸突髓鞘脫失，而成熟的OLs缺乏增殖能力，必須依賴新生成的OPCs增殖分化為成熟OLs，形成新的髓鞘，此即“髓鞘再生”[11-12]。OPCs是白質(zhì)修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞，因缺血等因素誘導(dǎo)的腦內(nèi)源性白質(zhì)修復(fù)作用十分有限，局部炎癥、氧化應(yīng)激、興奮毒性等因素導(dǎo)致腦內(nèi)環(huán)境的改變也不利于OPCs的存活和修復(fù)[13]。由于白質(zhì)修復(fù)涉及OPCs增殖、分化與成熟等復(fù)雜過程，因此，單一措施的促白質(zhì)修復(fù)作用往往有限，應(yīng)該從多環(huán)節(jié)、多途徑尋找促進(jìn)其修復(fù)的措施。

中醫(yī)藥研究表明，腦梗死的基本病機(jī)是氣虛血瘀，治療應(yīng)益氣活血。黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用中藥，可有效減輕腦損害，改善腦梗死患者神經(jīng)功能缺損癥狀。黃芪甲苷（Astragaloside Ⅳ， ASTⅣ）是黃芪抗缺血性腦卒中的主要活性成分[14]，三七總皂苷（Panax notoginseng saponins， PNS）是三七的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、三七皂苷R1[15]。冰片有開竅醒神之功，多用于中風(fēng)、痰熱、神昏竅閉等證，其主要有效成分為左旋龍腦[16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，以冰片配伍AST Ⅳ與PNS的益氣活血開竅組分中藥可促進(jìn)腦缺血再灌注后藥物成分入腦，且可促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元增殖和內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，減輕腦微血管損傷，具有促神經(jīng)修復(fù)的作用[17-18]。由于腦缺血后的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝與細(xì)胞凋亡等同樣可影響OPCs的增殖、分化，從而影響腦白質(zhì)修復(fù)。因此，推測該組分中藥也可能具有通過促進(jìn)髓鞘再生發(fā)揮對腦缺血后白質(zhì)損傷的修復(fù)作用。為了驗證這一推測，本研究首先用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了該組分中藥中的主要有效成分對腦缺血后OPCs髓鞘再生的作用及可能的靶點，然后采用體內(nèi)實驗初步探討了其促進(jìn)腦缺血再灌注后白質(zhì)損傷的修復(fù)作用，以期為后繼研究奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 ?益氣活血開竅組分中藥作用腦卒中后OPCs髓鞘再生的潛在靶點預(yù)測

1.1.1 ?AST Ⅳ、冰片和PNS主要有效成分潛在靶點的預(yù)測 ?在中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[19]及PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得AST Ⅳ、冰片主要活性成分（左旋龍腦）、PNS 5個主要活性成分（人參皂苷Re、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd）的CAS號，輸入PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中獲取SMILES號，將AST Ⅳ、冰片主要成分、PNS中5個主要活性成分（人參皂苷Re、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd）的SMILE號輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/）中，獲得AST Ⅳ、冰片和PNS中活性成分的作用靶點。

1.1.2 ?腦卒中后OPCs髓鞘再生靶標(biāo)基因獲取 ?在Gene Expression Omnibus （GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中，以“white matter”AND“stroke”AND“oligodendrocyte precursor cells”為檢索式，獲取芯片編號為GSE53737的高通量測序數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集由25個樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)組成，包括10個對照樣本（非卒中）、8個卒中5 d樣本和7個卒中15 d樣本。本研究比較了卒中5 d與卒中15 d的差異表達(dá)基因（differentially expression genes， DEGs），以P<0.05，|log2（FC）|≥1.5作為DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)。為了使上述各芯片數(shù)據(jù)集篩選出來的DEGs更具有腦卒中的基因?qū)傩?，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和Comparative Toxicogenomics Database（CTD）數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）中，以“stroke”為關(guān)鍵詞檢索靶基因，與GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的DEGs取交集。

1.1.3 ?中藥組分-疾病靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建 ?將藥物有效成分潛在靶點與疾病潛在靶點取交集，獲得藥物-疾病共同靶基因，并將共同靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，選擇“multiple proteins”“Homo sapiens”，靶點間的最低聯(lián)系分?jǐn)?shù)調(diào)整為“0.400”，勾選“隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。在“Exports”處下載整個PPI網(wǎng)絡(luò)的“TSV”格式，在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析，并利用CytoNCA插件分析相關(guān)靶點的拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點度值（Degree）和介數(shù)中心性（betweenness centrality， BC）來評價節(jié)點的重要性，篩選出排名前7的關(guān)鍵靶點。節(jié)點對應(yīng)的Degree和BC值越大，則其在網(wǎng)絡(luò)中起到的作用越重要。7E3093FA-79F3-495C-8636-0D4D21CC5D88

1.1.4 ?GO和KEGG富集分析 ?采用R語言Clusterprofiler、org.Hs.eg.db和enrichplot等數(shù)據(jù)包分析藥物-疾病共同靶基因的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF），對冰片、AST Ⅳ、PNS作用于腦卒中后OPCs髓鞘再生的靶點進(jìn)行GO富集分析;基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點基因的通路富集分析。進(jìn)行可視化分析，將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

1.2 ?益氣活血開竅組分中藥對大鼠腦缺血再灌注后白質(zhì)損傷的促修復(fù)作用

1.2.1 ?藥品與試劑 ?冰片主要成分左旋龍腦（1，7-三甲基-二環(huán)庚-2-醇，L-Borneol），純度86%，批號：20170815，購自湖北俊輝有限公司;AST Ⅳ，純度99.89%，批號：MUST-20090308，購自成都曼思特生物科技有限公司;PNS，純度≥98%，批號：MUST-20031901，購自成都曼思特生物科技有限公司。藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液備用。

1.2.2 ?動物 ?SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質(zhì)量250～270 g，由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)合格證號：4307272111006536。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，場地許可證號：SYXK（湘）2019-0009。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d。動物的使用符合國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。大鼠在手術(shù)前禁食12 h，不禁水。手術(shù)在室溫26 ℃左右下進(jìn)行，操作過程中用加熱墊保持大鼠體溫。

1.2.3 ?大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立 ?采用Zea Longa[20]等方法，用線栓造成大腦中動脈阻塞，缺血2 h后，再灌注7 d，制作大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型。2%戊巴比妥按照50 mg/kg腹腔注射麻醉，鈍性分離頸總動脈（common carotid artery， CCA）、頸外動脈（external carotid artery， ECA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery， ICA）。結(jié)扎ECA;在結(jié)扎處剪一小切口，將線栓從切口向ICA緩慢插入，推至遇到輕微阻力時停止，固定。腦缺血2 h后，將線栓退出約5 mm，制作缺血再灌注模型。假手術(shù)組只分離ICA、ECA，不插線栓，其余操作與模型組一致。

1.2.4 ?實驗用藥劑量及分組 ?根據(jù)我們前期實驗結(jié)果[16]，冰片、AST Ⅳ、PNS配伍抗腦缺血再灌注損傷的有效配伍劑量為冰片7.5 mg/kg、AST Ⅳ10 mg/kg、PNS 25 mg/kg，將動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、冰片組（劑量：7.5 mg/kg）、AST Ⅳ+PNS配伍組（AST Ⅳ+PNS組，劑量：AST Ⅳ10 mg/kg+PNS 25 mg/kg）、冰片+AST Ⅳ+PNS配伍低劑量組（低劑量組，劑量：冰片7.5 ?mg/kg+AST Ⅳ10 mg/kg+PNS 25 mg/kg）、冰片+AST Ⅳ+PNS配伍高劑量組（高劑量組，劑量：冰片15 mg/kg+AST Ⅳ20 mg/kg+PNS 50 mg/kg）。各組于造模蘇醒后開始灌胃給藥，每天兩次，間隔12 h。假手術(shù)組和模型組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉。末次給藥后次日檢測。

1.2.5 ?神經(jīng)行為學(xué)測定 ?各組大鼠于MCAO后第1、第3、第5、第7天，采用改良神經(jīng)功能缺損程度評分法（mNSS評分法）分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試，主要評價大鼠的感覺、運動、反射及平衡功能，并計算總分，最高分18分。得分越高，表示其神經(jīng)損害越嚴(yán)重。測試方法：由3位測試人員分別以盲法對大鼠進(jìn)行打分和記錄，然后計算平均分，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.6 ?白質(zhì)區(qū)（胼胝體、紋狀體）神經(jīng)纖維損傷檢測

染色液在乙醇中與髓鞘特異性結(jié)合，使髓鞘呈現(xiàn)淺藍(lán)色，故可采用髓鞘染色法評估大鼠白質(zhì)區(qū)髓鞘損傷程度。選取6 μm腦組織冠狀切面的石蠟切片。脫蠟后（二甲苯Ⅰ 20 min→二甲苯Ⅱ 20 min→無水乙醇10 min→95%乙醇5 min→85%乙醇2 min→75%乙醇2 min→純水），立即放入預(yù)熱1 h的KB染液A液中，再放回恒溫箱中孵育4 h。流水沖洗后，再放入碳酸鋰中浸洗15 s，75%乙醇中脫色15 s，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，至灰質(zhì)與白質(zhì)較好的分色后，流水沖洗，封片。在TissueFAXS Plus S儀器下采集圖片，計算單位面積藍(lán)色區(qū)域百分比，進(jìn)行定量分析。

1.3 ?統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料用“x±s”表示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)多組比較采用兩因素重復(fù)測量方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗;同一樣本多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnetts t檢驗。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?益氣活血開竅組分中藥主要成分對腦卒中后髓鞘再生的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果

2.1.1 ?AST Ⅳ、冰片與PNS活性成分特性及預(yù)測靶標(biāo) ?在TCMSP及PubChem中獲得AST Ⅳ、冰片主要活性成分左旋龍腦和PNS主要活性成分人參皂苷Re、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的ADME特性、Mol ID號和CAS號（見表1）。篩選AST Ⅳ、冰片和PNS主要活性成分的靶基因并去除7個成分中重復(fù)基因，得到365個預(yù)測靶點。

2.1.2 ?腦卒中后OPCs髓鞘再生的靶標(biāo)基因篩選 ?從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選腦卒中后OPCs差異表達(dá)的數(shù)據(jù)集GSE53737，下載其原始數(shù)據(jù)，篩選出卒中5 d及卒中15 d的OPCs的DEGs，并進(jìn)行人小鼠同源基因轉(zhuǎn)換，最終得到1422個DEGs。此外，在GeneCards 人類基因數(shù)據(jù)庫中檢索到7349個靶基因，在CTD數(shù)據(jù)庫中檢索到37 520個靶基因，合并并刪除重復(fù)值后最終得到16 426個腦卒中背景基因。將高通量數(shù)據(jù)集獲得的DEGs與腦卒中背景基因取交集，合并并刪除重復(fù)項后得到1162個靶基因，即為腦卒中后OPCs髓鞘再生的候選基因（見圖1a）。將365個藥物靶基因與1162個腦卒中后OPCs髓鞘再生DEGs取交集，獲得33個共同靶基因（見圖1b）。7E3093FA-79F3-495C-8636-0D4D21CC5D88

2.1.3 ?中藥組分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析 ?為獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，將“2.1.2”項下的益氣活血開竅組分中藥與腦卒中后OPCs髓鞘再生的33個交集靶點基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，下載TSV格式文件。將該文件導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建有效成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。并用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，以Degree和BC值對節(jié)點的重要性進(jìn)行評價，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。篩選網(wǎng)絡(luò)中排列前7的節(jié)點（表2），包括VEGFA、PTGS2、NTRK1、ESR2、TYMS、F2R和GLI1，推測這些靶點可能是藥物成分作用的核心靶點。

2.1.4 ?對共同靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析 ?利用R語言對33個共同靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。以P<0.05為基準(zhǔn)篩選，根據(jù)P值和count進(jìn)行排序后，選擇具有代表性的通路作為重要通路并進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖4。結(jié)果可知，益氣活血開竅組分中藥的有效成分對腦卒中后腦白質(zhì)OPCs髓鞘再生的生物學(xué)過程（BP）主要涉及MAPK和ERK1/2級聯(lián)的正向調(diào)節(jié)、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、肌醇脂質(zhì)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)等（圖4a）;在細(xì)胞組分（CC）中，主要包括膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、胞質(zhì)膜筏和細(xì)胞質(zhì)膜微囊等（圖4b），在分子功能（MF）上涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、G蛋白α亞單位結(jié)合和類固醇激素受體活性等（圖4c）;而KEGG通路富集結(jié)果可知（圖4d），各成分對OPCs髓鞘再生的作用機(jī)制主要涉及鈣離子、PI3K-Akt、VEGF、Rap1、Ras、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性和MAPK等信號通路。

2.1.5 ?對GEO數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析 ?利用R語言對GSE53737數(shù)據(jù)集中卒中5 d及卒中15 d OPCs的DEGs進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，在卒中5 d時，OPCs作用主要涉及溶酶體、聚糖降解、突觸囊泡循環(huán)、吞噬囊泡和PI3K-Akt等信號通路，在卒中15 d時OPCs作用主要涉及溶酶體、凋亡、趨化因子信號和PI3K-Akt等信號通路，在卒中5 d和卒中15 d OPCs作用機(jī)制均涉及PI3K-Akt信號通路（圖5）。

2.2 ?益氣活血開竅組分中藥對腦缺血再灌注后神經(jīng)功能的影響

在腦缺血2 h后，分別于再灌注后1、3、5、7 d測定大鼠神經(jīng)功能。隨著灌注時間增加，各組大鼠神經(jīng)功能均有一定程度改善，均能不同程度減輕腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，隨著給藥時間的延長，mNSS評分逐漸下降，以高劑量組下降最為明顯（圖6a）。對再灌注第7天各組大鼠mNSS評分進(jìn)行比較（圖6b），結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組mNSS評分顯著升高（P<0.001）。與模型組比較，AST Ⅳ+PNS組及低、高劑量組mNSS評分顯著下降（P<0.05或P<0.01），以低、高劑量組下降最為明顯（P<0.05或P<0.01）。

2.3 ?益氣活血開竅組分中藥對腦缺血再灌注后腦白質(zhì)損傷的影響

圖7a顯示缺血再灌注7 d后腦胼胝體損傷情況。假手術(shù)組大鼠中未見胼胝體髓鞘空泡化和白質(zhì)病變。模型組大鼠示髓鞘纖維疏松和紊亂，髓鞘空泡化明顯甚至有髓鞘的斷裂和脫失。冰片組、AST Ⅳ+PNS組以及低、高劑量組髓鞘空泡化、纖維紊亂和疏松情況均有一定程度改善，以高劑量組效應(yīng)最為明顯，未見明顯空泡樣變性或者髓鞘脫失。圖7b顯示各組大鼠單位面積腦胼胝體髓鞘化百分比的比較。與假手術(shù)組相比，模型組胼胝體髓鞘化百分比降低（P<0.001）。與模型組比較，冰片組、AST Ⅳ+PNS組及低、高劑量組胼胝體髓鞘化百分比均升高（P<0.05或P<0.01或P<0.001），且與低劑量組相比，高劑量組作用明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。圖7c顯示缺血再灌注7 d后腦紋狀體損傷情況。在假手術(shù)組，紋狀體髓鞘呈塊狀，成團(tuán)均勻分布，髓鞘排列緊密有序，界限清楚。模型組大鼠紋狀體區(qū)損傷嚴(yán)重，髓鞘溶解消失。與模型組相比，冰片組、AST Ⅳ+PNS組見少量的髓鞘呈點狀分布，脫髓鞘化無明顯改善。低劑量組大鼠紋狀體髓鞘脫失情況有所改善，保留少量界限清楚的髓鞘團(tuán)塊，但仍存在髓鞘空泡化和髓鞘斷裂缺失。高劑量組紋狀體雖有明顯髓鞘溶解和空泡化，紋狀體內(nèi)髓鞘數(shù)量不多，但界限清楚。圖7d顯示各組大鼠單位面積腦紋狀體髓鞘百分比的比較。與假手術(shù)組相比，模型組紋狀體髓鞘百分比顯著減少（P<0.001）。與模型組相比，低劑量組和高劑量組紋狀體髓鞘百分比顯著增加（P<0.01或P<0.001），低劑量組與冰片組、AST Ⅳ+PNS組相比顯著減輕了腦缺血后的髓鞘脫失（P<0.01），且高劑量組的髓鞘百分比顯著高于低劑量組（P<0.05）。

3 討論

腦缺血再灌注是加重缺血性腦卒中后神經(jīng)損傷的主要原因之一，亦屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇。神經(jīng)系統(tǒng)主要由神經(jīng)細(xì)胞（即神經(jīng)元）與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成。神經(jīng)元包括胞體、樹突與軸突;神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、OLs及小膠質(zhì)細(xì)胞[21]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元胞體及樹突的聚積處，新鮮標(biāo)本因富含血管而顏色灰暗，稱為灰質(zhì);神經(jīng)纖維集聚處因髓鞘色澤亮白稱為白質(zhì)。腦白質(zhì)血流量較灰質(zhì)少，且深部缺乏側(cè)支循環(huán)。因此，腦白質(zhì)更易受缺血的影響，且較灰質(zhì)受損嚴(yán)重[22-23]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了益氣活血開竅組分中藥中的AST Ⅳ、冰片主要有效成分左旋龍腦與PNS的有效成分人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1促腦卒中后OPCs髓鞘再生的作用及靶點。收集到365個藥物成分作用靶點，1162個腦卒中促OPCs髓鞘再生靶點，最終篩選出33個藥物-疾病共同靶基因。中藥組分-疾病靶點VEGFA、PTGS2、NTRK1、ESR2、和MET等基因與腦卒中后OPCs增殖和分化密切相關(guān)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選出益氣活血開竅組分中藥主要有效成分促進(jìn)腦卒中OPCs髓鞘再生的核心靶點，結(jié)果顯示，該組分中藥有效成分促進(jìn)腦卒中OPCs髓鞘再生與VEGFA、PTGS2、NTRK1、ESR2、TYMS、F2R和GLI1等靶點密切相關(guān)。GO和KEGG通路富集分析結(jié)果提示，7種有效成分對OPCs髓鞘再生的調(diào)控與鈣離子、PI3K-Akt、VEGF、Rap1、Ras、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性和MAPK等信號通路密切相關(guān)。此外，數(shù)據(jù)集分析結(jié)果表明，7種有效成分在卒中后不同時間段可以產(chǎn)生不同的影響，而且有一些信號通路在兩個時間點（卒中后5 d與15 d）均起作用，如PI3K-Akt信號通路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明益氣活血開竅組分中藥中的主要有效成分可以促進(jìn)腦卒中后OPCs髓鞘再生，且該作用與PI3K-Akt等信號通路密切相關(guān)，是多靶點、多途徑相互作用的結(jié)果。7E3093FA-79F3-495C-8636-0D4D21CC5D88

藥效學(xué)實驗結(jié)果表明，腦缺血再灌注后1、3、5、7 d，mNSS評分顯著增加，提示神經(jīng)功能嚴(yán)重缺損。各給藥組均能減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。在再灌注后第7天，各給藥組mNSS評分不同程度下降，且以低、高劑量組作用更為明顯，表明益氣活血開竅組分中藥可有效改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能。大鼠胼胝體和紋狀體形態(tài)學(xué)檢測顯示，腦缺血再灌注后，胼胝體和紋狀體髓鞘空泡化明顯甚至有髓鞘的斷裂和脫失，髓鞘面積減少。各藥物組髓鞘空泡化和疏松情況均有一定程度改善，能顯著增加胼胝體髓鞘面積，改善腦白質(zhì)脫髓鞘化，且以高劑量組的作用最為明顯。藥效學(xué)研究表明益氣活血開竅組分中藥對腦缺血再灌注后白質(zhì)（胼胝體和紋狀體）損傷具有改善作用。

綜上所述，益氣活血開竅組分中藥對腦缺血再灌注后白質(zhì)損傷具有改善作用，其作用可能與促進(jìn)腦卒中后OPCs髓鞘再生有關(guān)，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。以該網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測和藥效學(xué)結(jié)果為依據(jù)，進(jìn)一步開展益氣活血開竅組分中藥促腦缺血后白質(zhì)修復(fù)作用和機(jī)制的研究，可作為今后的研究方向。

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