李從林 王博龍

摘要：目的 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法研究益母草主要活性成分及藥理機制，為新藥研發(fā)提供參考。方法 檢索中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）收錄的益母草化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為標準篩選活性成分，并找出活性成分對應(yīng)靶點。構(gòu)建益母草活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)、靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），運用DAVID平臺進行靶點GO功能富集和KEGG信號通路富集。結(jié)果 發(fā)掘益母草主要活性成分14種，對應(yīng)靶點216個（包括5個關(guān)鍵靶點AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN），參與生物過程509個。KEGG關(guān)鍵通路包括催產(chǎn)素信號通路、補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)、血小板活化、TNF信號通路等。結(jié)論 本研究初步揭示了益母草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及多維藥理作用，可為益母草開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：益母草；網(wǎng)絡(luò)藥理學；蛋白互作；信號通路；靶點

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.024

中圖分類號：R2-05；R285 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）12-0102-05

Abstract： Objective To study the main active components and pharmacological mechanism of Leonuri Herba based on the network pharmacology； To provide references for research and development of new medicine. Methods Chemical components of Leonuri Herba from the TCMSP database platform were retrieved. The active components were screened by oral bioavailability （OB） ≥ 30% and drug-like （DL） ≥ 0.18， and the corresponding targets of active components were identified. Active components target network and target protein-protein interaction network were constructed， and DAVID platform was used for target GO function enrichment and KEGG signal pathway enrichment analysis. Results Totally 14 main active components and 216 corresponding targets were explored from Leonuri Herba， involving 5 key targets of AKT1， TP53， IL-6， CALM2 and JUN， and participated in 509 biological processes. The key pathways of KEGG included oxytocin signaling pathways， complement and clotting cascades， platelet activation and TNF signaling pathways. Conclusion The material basis and multi-dimensional pharmacological action of Leonuri Herba were preliminarily revealed， which provides basis for its development and utilization.

Keywords： Leonuri Herba； network pharmacology； protein-protein interaction； signal pathway； target

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的新鮮或干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、清熱解毒功效，常用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)閉經(jīng)、惡露不盡、水腫尿少、瘡瘍腫毒[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其化學成分主要包括生物堿類、揮發(fā)油類、黃酮類、二萜類等[2]，具有降低血液黏度、保護心肌、抗氧化、抗炎等藥理活性[3]。然而，其具體的活性物質(zhì)基礎(chǔ)及產(chǎn)生藥理作用的分子機制尚不明確。

中藥多成分、多靶點、低選擇協(xié)同作用的特點是以線性研究為主的傳統(tǒng)實驗藥理學面臨的難題。王永炎院士提出中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)是復雜化學體系，而生物機體也是復雜生命系統(tǒng)，中藥產(chǎn)品化學物質(zhì)實體與機體生物活動的交互規(guī)律研究成為中藥現(xiàn)代研究的重要切入點。相關(guān)研究必須采取整合策略，以多學科交叉、融合為基礎(chǔ)，構(gòu)建新的研究體系。

網(wǎng)絡(luò)藥理學融合了藥學、生物學、計算機學及復雜網(wǎng)絡(luò)分析等多學科的新技術(shù)與新成果，從化合物、靶點、信號通路等多角度入手，實現(xiàn)中藥研究的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，在預測和辨識中藥活性成分群及作用靶點、闡明作用機制、解釋組方規(guī)律、發(fā)現(xiàn)新適應(yīng)癥及新活性化合物等方面，具有獨特優(yōu)勢和巨大潛力。該方法的整體性、系統(tǒng)性切合中藥復雜體系的特點，已在腦心通膠囊、龍血竭腸溶片、冠心靜膠囊等中藥大品種二次開發(fā)的質(zhì)量控制、作用機制、臨床方面得到應(yīng)用[4-6]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)分析益母草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，為其開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“益母草”為關(guān)鍵詞檢索其活性成分及靶點?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）反映化合物的吸收程度，類藥性（drug-like，DL）為化合物與已知藥物的相似性，二者在化合物成藥性評價中起關(guān)鍵作用[7]，本研究以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標準篩選出候選成分，并挖掘文獻報道補充一些重要化學成分。

1.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的益母草活性成分所對應(yīng)的靶點通過UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）翻譯成相應(yīng)基因。再將化合物及相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape3.4.0軟件，繪制益母草活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。度值反映網(wǎng)絡(luò)中某節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)目，介數(shù)是網(wǎng)絡(luò)中所有最短路徑中經(jīng)過該節(jié)點的路徑的數(shù)目與最短路徑總數(shù)的比，度值和介數(shù)是量化1個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性的重要拓撲參數(shù)。

1.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確益母草潛在靶蛋白之間的相互作用，將篩選得到的靶蛋白在STRING平臺（https：//string-db. org/）構(gòu)建蛋靶白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens（人類）”進行操作，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”（中等），其他參數(shù)保持默認設(shè)置。將PPI網(wǎng)絡(luò)模型導入Cytoscape3.5.1軟件，運用“Network Analysis”功能進行分析研究。依據(jù)度值、介數(shù)確定益母草關(guān)鍵靶蛋白。

1.4 KEGG信號通路與GO生物過程富集分析

將得到的潛在靶點在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）進行KEGG信號通路富集分析和GO生物過程富集分析，以P<0.05進行靶基因篩選，分析益母草發(fā)揮藥理作用的主要信號通路及生物過程。

2 結(jié)果

2.1 主要活性成分信息

篩選出益母草主要活性成分8種，由于益母草寧堿等6種成分具有明顯藥理活性[8-9]，故一并納入活性成分研究，共得到14種主要活性成分，見表1。

2.2 主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

益母草主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)見表2，主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1。

2.3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中包含212個節(jié)點（4個靶蛋白未參與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建）、3387條相互作用連線。該網(wǎng)絡(luò)平均度值為58.5，平均介數(shù)為0.036 2，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學參數(shù)，共篩選出5個度值和介數(shù)均高于平均值的關(guān)鍵靶蛋白（AKT1、TP53、IL-6、CALM2、JUN），提示這些蛋白在益母草藥理機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，見圖2。

2.4 GO生物過程富集結(jié)果

對益母草216個靶基因進行GO生物過程富集，篩選到P<0.05的GO條目509個，按照P值由小到大排列的前20條主要生物過程見表3。主要涉及對體內(nèi)外多種有機、無機物的反應(yīng)，對缺氧的反應(yīng)，細胞凋亡負調(diào)節(jié)，細胞增殖的正向調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)，一氧化氮生物合成過程的正調(diào)節(jié)，信號轉(zhuǎn)導等。

2.5 KEGG信號通路富集結(jié)果

對益母草216個蛋白進行KEGG信號通路富集，篩選出P<0.05的信號通路共7大類26條，按照P值由小到大排列，結(jié)果見表4。癌癥相關(guān)通路6條：癌癥的途徑、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、癌癥中的膽堿代謝；循環(huán)系統(tǒng)信號通路3條：補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)、血小板激活、血管平滑肌收縮；糖尿病相關(guān)通路3條：胰島素抵抗、II型糖尿病、I型糖尿??；炎癥相關(guān)通路4條：TNF信號通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)控、Fcγ-R信號調(diào)理的吞噬、NF-κβ信號通路；5條信號通路：PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、p53信號通路、鈣信號通路、催產(chǎn)素信號通路；神經(jīng)遞質(zhì)通路2條：5-羥色胺能突觸、膽堿能突觸；脂代謝通路2條：脂肪細胞因子信號傳遞途徑、脂肪細胞中脂解的調(diào)節(jié)。涉及癌癥、糖尿病、心血管疾病、炎癥等。

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選出益母草主要活性成分14種及靶點216個，KEGG分析顯示靶基因主要分布于心血管、炎癥、糖尿病、癌癥等7大類26條通路。PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)多個與多種復雜疾病緊密相關(guān)的靶點，如AKT1編碼的AKT蛋白。AKT是細胞生長信號通路中的傳感器，在生長因子或胰島素介導的信號轉(zhuǎn)導中扮演重要的角色，在營養(yǎng)代謝、細胞生長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞存活中也具有重要作用[10]?？梢娨婺覆莸乃幚碜饔秒x不開這些關(guān)鍵靶蛋白的直接或者間接作用。

益母草有“血家圣藥”“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱，活血化瘀作用明顯，其萜類活性成分能改變血液流變學、改善微循環(huán)、心肌缺血、抗血栓[11-13]，這與本研究KEGG富集分析得出的益母草靶點可富集在補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、血小板活化、血管平滑肌收縮等信號通路的結(jié)果相吻合。除影響血管平滑肌收縮外，益母草對子宮平滑肌具雙向調(diào)節(jié)作用，如在產(chǎn)后出血中可聯(lián)合縮宮素增強子宮收縮表現(xiàn)為止血作用[14-16]，而應(yīng)用于痛經(jīng)等疾病中則抑制子宮平滑肌收縮[17]。本研究發(fā)現(xiàn)益母草中鼬瓣花二萜、別香橙稀、前益母草二萜、異前益母草二萜、β-蓽澄茄油烯、植醇、山柰酚、石竹素等成分能作用M1、M2、M3膽堿能受體。KEGG富集結(jié)果也有催產(chǎn)素信號通路、膽堿能突觸信號通路、鈣信號通路等決定子宮平滑肌收縮的主要通路。

本研究還發(fā)現(xiàn)，TNF信號通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)控、Fcγ-R信號調(diào)理的吞噬、NF-κβ信號通路等炎癥方面通路，說明益母草中含有抗炎類化合物。王麗娟等[18]采用小鼠熱板法和化學刺激法等發(fā)現(xiàn)益母草具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎作用。其中萜類化合物通過作用于NF-κβ信號通路，下調(diào)一氧化氮合酶和環(huán)氧化酶蛋白質(zhì)表達，致使脂多糖誘導的一氧化氮和前列腺素E2生成減少[19]。益母草中黃酮類物質(zhì)也具有顯著的抗炎作用，能夠抑制肥大細胞和嗜堿性細胞釋放慢反應(yīng)致炎物質(zhì)[20]。

此外，本研究益母草靶基因KEGG富集還得到多條癌癥、糖尿病密切相關(guān)通路。宋霏[21]發(fā)現(xiàn)益母草水提物及益母草醇提物對人宮頸癌具有一定的體外抗腫瘤活性。而降糖作用未見報道，相關(guān)研究均處于探索階段。

益母草成分復雜，藥理作用多樣，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學技術(shù)，初步分析其在血栓性疾病、婦產(chǎn)科疾病、炎癥等方面的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學作為中藥研究的一種新方法，離不開相關(guān)數(shù)據(jù)庫和技術(shù)手段的完善，而中藥成分的發(fā)現(xiàn)也需要積累，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫資料的完整性、準確性及實時更新等有待進一步加強。本研究單純從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度推測了益母草主要活性成分及藥理機制，未將網(wǎng)絡(luò)藥理學所得結(jié)果進行實驗驗證，存在一定局限性，部分結(jié)論尤其是新發(fā)現(xiàn)抗癌及降糖作用仍需進一步驗證。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：290-291.

[2] 劉世軍，唐志書，崔春利，等.益母草化學成分研究進展[J].河南中醫(yī)， 2017，37（2）：358-362.

[3] 阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠，等.益母草的化學、藥理和臨床研究進展[J].中草藥，2003，34（11）：112-116.

[4] 彥瓊，李梢.網(wǎng)絡(luò)藥理學與中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的若干進展[J].中國藥理學與毒理學雜志，2015，29（6）：883-892.

[5] 李泮霖，蘇薇薇.網(wǎng)絡(luò)藥理學在中藥研究中的最新應(yīng)用進展[J].中草藥，2016，47（16）：2938-2942.

[6] 王萍，唐仕歡，蘇瑾，等.基于整合藥理學的中藥現(xiàn)代研究進展[J].中國中藥雜志，2018，43（7）：1297-1302.

[7] 朱依諄，殷明.藥理學[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：29.

[8] 李錕，王樹真，李樂，等.益母草的化學成分和藥理作用研究進展[J].廣大化工，2014，41（2）：54-55.

[9] 劉曉倩.益母草總生物堿腎毒性研究與機制探討[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學，2014.

[10] 李欣.蛋白激酶B結(jié)構(gòu)與功能研究進展[J].成都大學學報：自然科學版，2014，33（4）：314-317.

[11] 張雪，宋玉琴，楊雨婷，等.益母草活血化瘀化學成分與藥理作用研究進展[J].藥物評價研究，2015，38（2）：214-217.

[12] 袁忠治，李繼云，王琰.中藥益母草預防和抑制微小血管血栓形成的作用[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，13（3）：148-150.

[13] 趙彩霞，蔡長春，張增巧，等.益母草的藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展[J].臨床誤診誤治，2011，24（2）：82-84.

[14] 林建華，林其德，劉興會，等.陰道分娩中益母草注射液預防產(chǎn)后出血促進子宮收縮的多中心臨床研究[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2009，25（1）：44- 47.

[15] 何麗，楊俊毅，張靜，等.益母草注射液與縮宮素聯(lián)合應(yīng)用預防產(chǎn)后出血的臨床療效[J].中國婦幼保健，2010，25（11）：1571-1573.

[16] 劉麗娥.益母草注射液與縮宮素聯(lián)合應(yīng)用預防產(chǎn)后出血的臨床觀察[J].中國實用醫(yī)藥，2016，11（12）：159-160.

[17] 趙丁，劉偉娜，王偉，等.益母草提取物對小鼠體外子宮收縮功能的影響[J].醫(yī)藥導報，2008，27（6）：640-642.

[18] 王麗娟，張麗，王勇，等.益母草鎮(zhèn)痛抗炎作用的實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（3）：645-646.

[19] 周勤梅，彭成，劉娟，等.益母草屬二萜類化合物的研究進展[J].中藥材，2014，37（9）：1691-1695.

[20] 陳秋榮.黃酮類化合物藥理作用的分析[J].中國實用醫(yī)藥，2012， 7（21）：254-255.

[21] 宋霏.益母草提取物抗癌研究[J].實用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2010，10（4）：82-83.