王玨，金宗睿，王維，易麒麟，王繼龍，朱海，徐邦浩，郭雅，文張

0 引言

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，居世界癌癥死亡原因第三位，每年造成70多萬人死亡[1]。肝細(xì)胞癌（HCC）占原發(fā)性肝癌的90%，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的一大挑戰(zhàn)[1-2]。盡管目前對(duì)于HCC有多種治療手段，但五年生存率不超過19%[3]。早期診斷率低、腫瘤進(jìn)展迅速和高復(fù)發(fā)率可能與HCC患者預(yù)后不良有關(guān)，然而，HCC的進(jìn)展機(jī)制尚不清楚。目前，生物信息學(xué)已經(jīng)成為癌癥研究的重要手段之一。因此，尋找預(yù)測HCC診斷、進(jìn)展、預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物，對(duì)HCC的預(yù)防和治療有重要意義。

研究表明，免疫微環(huán)境在HCC的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵作用[4-5]。作為典型的炎性腫瘤，免疫耐受及逃避機(jī)制在HCC的發(fā)展中起著重要作用[6]。例如，骨髓來源的抑制性細(xì)胞通過增強(qiáng)免疫抑制因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[7-8]，所以需要探究如何找到免疫相關(guān)因素。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫對(duì)HCC免疫相關(guān)基因進(jìn)行分析，并且建立HCC的預(yù)后預(yù)測模型，旨在為HCC的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 原始資料下載與整理

從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/）中獲得371例HCC患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床病理信息?？偵鏁r(shí)間≤90天的樣本被排除在外，共獲得329例患者生存數(shù)據(jù)。另外，收集了6例患者的HCC和癌旁樣本用于關(guān)鍵基因的驗(yàn)證。收集的組織立即在液氮中冷凍，并儲(chǔ)存在-80℃的冰箱中。本研究均通過患者知情同意，并得到了廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 免疫浸潤評(píng)估和分組

根據(jù)Bindea等的結(jié)果[9]，本研究使用了一組免疫細(xì)胞表面標(biāo)志基因。利用29個(gè)免疫數(shù)據(jù)集和ssGSEA方法結(jié)合R軟件“GSVA”包將TCGA肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分組。來自TCGA的肝細(xì)胞癌樣本被“hclust”包分為低免疫細(xì)胞浸潤組和高免疫細(xì)胞浸潤組[10]。ESTIMATE算法用于分析免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分、腫瘤純度和ESTIMATE評(píng)分，并繪制聚類熱圖以進(jìn)行有效分組。

1.3 肝細(xì)胞癌免疫相關(guān)基因的篩選

TCGA數(shù)據(jù)分為高免疫細(xì)胞浸潤組和低免疫細(xì)胞浸潤組。根據(jù)FDR<0.05和|log2FC|>1的標(biāo)準(zhǔn)，使用“l(fā)imma”包分析差異基因，其中FDR為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，F(xiàn)C為差異倍數(shù)。另外，從immport數(shù)據(jù)庫中下載1793個(gè)免疫相關(guān)基因。維恩圖從上述兩個(gè)分析中確定真正的免疫相關(guān)基因。

1.4 功能富集分析

為了更好地了解差異基因的潛在生物學(xué)功能，在R中使用“clusterProfiler”包[11]進(jìn)行了涵蓋生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）的基因本體（GO）功能富集和京都基因百科全書（KEGG）分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義，結(jié)果用“ggplot2”包可視化。

1.5 預(yù)后模型的建立和驗(yàn)證

進(jìn)行單因素Cox回歸分析，以確定差異基因的預(yù)后價(jià)值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LASSO回歸算法過濾預(yù)后基因，篩選出4個(gè)預(yù)后相關(guān)免疫基因。基于上述預(yù)后基因，進(jìn)行逐步回歸多因素Cox分析來構(gòu)建預(yù)后基因特征。預(yù)后基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式的構(gòu)建如下[12]：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=∑i（βi*Ei）。Ei指預(yù)后基因的表達(dá)；βi指預(yù)后基因的回歸系數(shù)。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier生存分析用于評(píng)估預(yù)后模型的預(yù)測能力。

1.6 獨(dú)立預(yù)測分析和列線圖構(gòu)建

進(jìn)行單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，以確定預(yù)后模型的預(yù)測能力是否獨(dú)立于常規(guī)臨床特征。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算危險(xiǎn)比和95%置信區(qū)間?；谂R床病理特征，對(duì)整個(gè)隊(duì)列樣本進(jìn)行分層分析。所有獨(dú)立的預(yù)后因素用于建立列線圖，以評(píng)估HCC患者的1、3和5年生存概率。

1.7 qRT-PCR檢測

使用RNAisoPlusreagent（日本TaKaRa公司）提取HCC組織和癌旁組織的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）在37℃ 15 min和85℃ 5 s將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI7500system系統(tǒng)（美國API公司）上，用TBGreen?PremixExTaqTMIIKit（日本TaKaRa公司）進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。引物序列見表1。

表1 4個(gè)免疫相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences of four immune-related genes

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R（v.3.6.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量總結(jié)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用Wilcox檢驗(yàn)比較各組差異。定性變量采用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)或皮爾遜卡方檢驗(yàn)。使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)計(jì)算生存時(shí)間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制Kaplan-Meier曲線顯示存活時(shí)間差異。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織的免疫分組

肝細(xì)胞癌樣本根據(jù)免疫浸潤程度分為高免疫細(xì)胞浸潤組和低免疫細(xì)胞浸潤組。為驗(yàn)證上述分組方案的真實(shí)性，ESTIMATE算法分析結(jié)果提示高免疫細(xì)胞浸潤組的腫瘤純度低于低免疫細(xì)胞浸潤組，而ESTIMATE評(píng)分、免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分值高于低免疫細(xì)胞浸潤組，見圖1。高免疫細(xì)胞浸潤組的免疫成分多于低免疫細(xì)胞浸潤組，TIGIT、PD-L1、PD-1、LAG3、TIM-3、CTLA4和HLA家族在高免疫細(xì)胞浸潤組中表達(dá)也較高。CIBERSORT方法分析結(jié)果表明，高免疫細(xì)胞浸潤組中免疫細(xì)胞類型較多。

2.2 高和低免疫細(xì)胞浸潤的差異表達(dá)分析

基于截止值（|log2FC|>1和FDR<0.05），在低免疫細(xì)胞浸潤組和高免疫細(xì)胞浸潤組之間鑒定了1123個(gè)差異基因，其中包括946個(gè)上調(diào)的差異基因和177個(gè)下調(diào)的差異基因?；趤碜詉mmport數(shù)據(jù)庫的免疫基因和來自高、低免疫細(xì)胞浸潤組的差異基因進(jìn)行維恩分析，發(fā)現(xiàn)了337個(gè)重疊基因，它們被認(rèn)為是真正的差異基因。

2.3 差異基因的GO和KEGG分析

為了探索差異基因的潛在功能，分析了337個(gè)差異基因的GO和KEGG的功能富集。在BP方面，差異基因在免疫反應(yīng)?激活細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和體液免疫反應(yīng)等方面均顯著富集。對(duì)于CC，差異基因在免疫球蛋白復(fù)合物、質(zhì)膜外側(cè)和循環(huán)免疫球蛋白復(fù)合物等方面富集。對(duì)于MF，差異基因在抗原結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合和細(xì)胞因子活性等方面富集，見圖2A。此外，KEGG分析表明，大多數(shù)差異基因相關(guān)途徑與免疫反應(yīng)顯著相關(guān)，見圖2B。

2.4 免疫相關(guān)差異基因的預(yù)后模型

將329例患者的差異基因表達(dá)譜與生存數(shù)據(jù)相結(jié)合，進(jìn)行單因素Cox回歸分析，獲得36個(gè)與患者總體生存期（OS）相關(guān)的mRNAs。執(zhí)行LASSO回歸算法。通過多因素Cox回歸確定由4個(gè)mRNAs組成的模型為預(yù)測患者OS的最佳預(yù)后模型，見圖3A?；赥CGA隊(duì)列分析，4個(gè)mRNAs在腫瘤組織中均表達(dá)下調(diào)，包括S100A9、HMOX1、IL18RAP和FCER1G。

根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將329例肝癌樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=164）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=165）。隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的升高，高風(fēng)險(xiǎn)組患者死亡人數(shù)多于低風(fēng)險(xiǎn)組。生存曲線提示，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存時(shí)間明顯縮短（P=1.547X10-7），見圖3B。1、3和5年OS ROC曲線的AUC值分別為0.752、0.775和0.705，表明該模型具有良好的敏感度和特異性（圖請(qǐng)掃描OSID碼）。

排除臨床數(shù)據(jù)不完整的患者后，共獲得261例患者臨床病理特征，其中高風(fēng)險(xiǎn)組124例，低風(fēng)險(xiǎn)組137例，兩組患者的生存時(shí)間按TNM分期Ⅰ+Ⅱ、組織學(xué)分級(jí)1+2、組織學(xué)分級(jí)3+4、年齡>60歲、女性、男性、有血管侵犯和無血管侵犯不同亞組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者的總生存時(shí)間比低風(fēng)險(xiǎn)組短，見圖4。

2.5 預(yù)測列線圖的構(gòu)建

單因素分析顯示，病理分期（P<0.001）和4-mRNAs模型（P<0.001）與總生存期顯著相關(guān)。多因素分析顯示，4-mRNAs模型（P<0.001）和病理分期（P<0.001）仍然是總生存率的獨(dú)立影響因素，見表2，證實(shí)了模型的可靠性。根據(jù)ROC曲線下面積的比較，確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（AUC=0.784）比其他HCC預(yù)后因素能更準(zhǔn)確地預(yù)測死亡率（相關(guān)數(shù)據(jù)請(qǐng)掃描OSID碼）。

表2 TCGA中肝細(xì)胞癌患者總體生存率的單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analyses of overall survival of hepatocellular carcinoma patients in TCGA

使用以下3個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素來預(yù)測列線圖：TNM分期、組織學(xué)分級(jí)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，見圖5。將不同的獨(dú)立因子與相應(yīng)的分值進(jìn)行匹配，通過相加得到總分值。最后，獲得每例患者的1、3和5年生存概率?？偡衷礁?，列線圖中的預(yù)后越差。校準(zhǔn)圖顯示列線圖的有效性好，45°線代表了最佳預(yù)測情況（圖請(qǐng)掃描OSID碼）。

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證篩選的基因

分析6對(duì)肝細(xì)胞癌和癌旁樣本，以驗(yàn)證4個(gè)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與正常肝組織相比，S100A9、HMOX1、IL18RAP和FCER1G在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與之前的結(jié)果一致，與正常樣品相比，肝細(xì)胞癌樣品中4個(gè)基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖請(qǐng)掃描OSID碼）。

3 討論

目前，肝癌的治療主要包括肝部分切除術(shù)、肝移植、射頻消融、經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞以及藥物治療。然而，這些治療方法的效果有限，到目前為止，還沒有有效的生物標(biāo)志物來準(zhǔn)確預(yù)測肝癌患者的生存率。因此，鑒定可靠的生物標(biāo)志物和肝癌患者預(yù)后的預(yù)測因素非常重要。

越來越多的研究表明，免疫微環(huán)境對(duì)肝癌患者的發(fā)生、進(jìn)展、治療反應(yīng)和遠(yuǎn)期預(yù)后有很大影響[13-14]。免疫細(xì)胞作為機(jī)體的監(jiān)測細(xì)胞，可以干擾分子信號(hào)，識(shí)別腫瘤細(xì)胞的異常增殖。這些細(xì)胞在癌癥的生物學(xué)功能中具有重要作用，包括腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[15]。此外，免疫逃逸機(jī)制的存在往往會(huì)影響腫瘤的預(yù)后。HCC腫瘤微環(huán)境的多種免疫抑制細(xì)胞參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[16]。以往研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的M2表型為腫瘤生長產(chǎn)生炎性反應(yīng)環(huán)境，并通過誘導(dǎo)肝癌的腫瘤血管生成促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，大大降低了患者的生存率[17]。然而，一些癌細(xì)胞可以避免被免疫系統(tǒng)檢測到。這些癌細(xì)胞可以通過抑制免疫反應(yīng)，如抗原呈遞等來逃避免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)腫瘤侵襲[18]。研究報(bào)道，β-連環(huán)蛋白的激活促進(jìn)免疫逃逸和對(duì)程序性死亡受體1（PD-1）的抵抗，并且可能代表HCC患者T細(xì)胞排斥的新生物標(biāo)志物[19]。PD-1作為一種免疫檢查點(diǎn)分子，通過降低T細(xì)胞活性和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受性，導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良。也有報(bào)道稱，納武單抗作為PD-1的免疫抑制劑，可能在晚期肝癌中發(fā)揮作用[20-21]。

本研究以肝細(xì)胞癌的免疫浸潤狀態(tài)為重點(diǎn)，通過分析肝細(xì)胞癌樣本之間的差異，篩選了337個(gè)基因作為免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)的差異基因。進(jìn)一步探討了免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)的差異基因的功能富集，這可能為探索差異基因調(diào)控肝細(xì)胞癌發(fā)展和預(yù)后的機(jī)制提供更多細(xì)節(jié)。

本研究建立的肝癌預(yù)后模型由四個(gè)免疫相關(guān)基因組成，即S100A9、HMOX1、IL18RAP和FCER1G。S100鈣結(jié)合蛋白A9（S100A9）是一種鈣衛(wèi)蛋白，在多種細(xì)胞類型中表達(dá)，并且在骨髓細(xì)胞中大量存在，因此也被稱為骨髓相關(guān)蛋白[22-23]。S100A9在多種癌癥中過度表達(dá)[24-26]。S100A9招募髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）通過炎性反應(yīng)途徑促進(jìn)癌癥生長[27]。另外，有研究表明S100A9主要位于HCC腫瘤組織中浸潤的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，很少有HCC細(xì)胞本身表達(dá)S100A9[28]。血紅素加氧酶1（HMOX1）是血紅素分解代謝的核心酶，與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)[29-30]。迄今為止，許多研究人員提出HMOX1與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，如抗細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且它可以成為潛在的癌癥治療靶點(diǎn)。有研究表明，增加的細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白通過抑制IL-6表達(dá)顯著抑制了人類HCC細(xì)胞的遷移和生長[31]。白介素18受體輔助蛋白（IL18RAP）是白介素1受體家族的成員，由多種細(xì)胞類型表達(dá)，包括免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞[32]。IL18RAP通過抑制涉及caspase-3的血管生成和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，有效抑制HCC細(xì)胞的生長，充分證明了IL18RAP的抗腫瘤作用[33]。IgE的Fc組分高親和性1受體（FCER1G）是參與過敏反應(yīng)的關(guān)鍵分子[34]。FCER1G對(duì)慢性炎性反應(yīng)至關(guān)重要，并在死亡激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[35]。FCER1G與腎透明細(xì)胞癌的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[35]。目前，F(xiàn)CER1G在肝細(xì)胞癌中的作用未見報(bào)道。本研究使用六對(duì)肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織檢測這四個(gè)基因的mRNA水平。結(jié)果表明，這四種mRNA在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果基本一致，這也證實(shí)了模型的可靠性。

目前，一些由多個(gè)基因組成的預(yù)后模型可以預(yù)測肝癌的預(yù)后，如Xu等開發(fā)的由8個(gè)免疫相關(guān)mRNA組成的預(yù)后模型[36]。然而，該模型在肝癌免疫微環(huán)境的研究中沒有得到廣泛應(yīng)用。本研究結(jié)果表明，由這四個(gè)基因組成的風(fēng)險(xiǎn)模型能夠區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)人群和低風(fēng)險(xiǎn)人群，并準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)后。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高的HCC患者預(yù)后較差。值得注意的是，風(fēng)險(xiǎn)模型是肝癌的獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素。基于這一特征，構(gòu)建了預(yù)后列線圖，以幫助患者制定短期治療策略。因此，該預(yù)后模型可能參與HCC的發(fā)展，并可能成為一種可靠的臨床生物標(biāo)志物。

人類白細(xì)胞抗原（HLA）基因的多態(tài)性被認(rèn)為與多種惡性腫瘤的敏感度有關(guān)，并參與致癌、腫瘤增殖和免疫逃逸的進(jìn)程[37-38]。有研究發(fā)現(xiàn)，與早期實(shí)體癌的周圍正常組織相比，HLAI類在癌細(xì)胞中高表達(dá)，這可能導(dǎo)致基于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的癌癥免疫療法的抗腫瘤效應(yīng)[39]。有研究結(jié)果顯示，CD8+CTL通過HLAI類特異性上調(diào)腫瘤細(xì)胞系中PD-L1的表達(dá)[40]。

根據(jù)目前的研究，已鑒定的mRNAs可能成為免疫治療的潛在靶點(diǎn)，并在預(yù)測和評(píng)估HCC患者的OS方面具有較大潛力。本研究的優(yōu)勢在于挖掘和分析TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并建立一種新的免疫相關(guān)預(yù)后模型。該模型在預(yù)測HCC患者的OS方面效果顯著，反映了HCC腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)。然而，目前研究的缺點(diǎn)是該模型沒有得到其他數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證。未來，4個(gè)mRNA標(biāo)記的預(yù)后價(jià)值需要在其他獨(dú)立的HCC數(shù)據(jù)集和更多的臨床患者中進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，本研究缺乏蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組織化學(xué)的檢測。因此，這些免疫相關(guān)mRNAs的應(yīng)用價(jià)值需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步闡明。盡管存在這些局限性，目前的研究建立了一種新的HCC免疫相關(guān)基因特征，它與患者風(fēng)險(xiǎn)和OS密切相關(guān)。

綜上所述，本研究通過分析肝細(xì)胞癌樣本和免疫細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)之間的差異，構(gòu)建了預(yù)后模型并確定了與免疫相關(guān)的肝細(xì)胞癌核心基因。鑒定出的基因可能用于靶向治療和免疫治療，為臨床提供新的治療思路。